王軼男，孔令敏，徐海峰，張正文，李春宇，尹 伊，金 一，呂艷秋

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002；2.長(zhǎng)春市第一中等職業(yè)學(xué)校，長(zhǎng)春 130000；3.長(zhǎng)春市經(jīng)開(kāi)區(qū)興隆山鎮(zhèn)政府，長(zhǎng)春 130000)

熱休克蛋白A8(heat shock protein A8，HSPA8)，也稱(chēng)為熱休克70 ku蛋白8，是Hsp70蛋白家族的組成成員，也是高度保守的伴侶蛋白[4]。HSPA8具有促凋亡和抗凋亡的特性，對(duì)細(xì)胞活力起保護(hù)作用，在細(xì)胞外的空間中也能夠檢測(cè)到[5]。研究表明，從輸卵管上皮的頂部質(zhì)膜(APM)制劑中獲得的可溶性蛋白成分能夠增強(qiáng)哺乳動(dòng)物精子的存活率，而可溶性蛋白部分的存活增強(qiáng)特性似乎在很大程度上取決于HSPA8，在輸精過(guò)程中由輸卵管上皮細(xì)胞產(chǎn)生HSPA8[6]，可提高公豬[7]、公羊[8]和公牛[7]精子的存活率。此外，HSPA8對(duì)提高精子活力、精子膜流動(dòng)性、精子與輸卵管細(xì)胞結(jié)合能力和體外單精子受精率有直接作用[9]。 Elliott等[7]研究發(fā)現(xiàn),0.5 μg/mL HSPA8對(duì)精子活力的積極影響最大，可顯著提高豬精子活力和卵母細(xì)胞囊胚率[8-9]，所以本試驗(yàn)在冷凍基礎(chǔ)液中選用0.5 μg/mL HSPA8進(jìn)行研究。

精漿(seminal plasma，SP)是一種在睪丸、附睪和附屬性腺中分泌的液體混合物，包含多種調(diào)節(jié)精子功能的因素。據(jù)報(bào)道，用自體(同種)SP補(bǔ)充凍融的公羊精子可以改善精子的特性，包括運(yùn)動(dòng)性、活力和穿透宮頸黏液的能力,以及宮腔內(nèi)人工授精后的生育能力[10]。一方面，在生殖生理過(guò)程中，精子在短時(shí)間內(nèi)與精漿發(fā)生相互作用，精子和未稀釋的精漿之間的接觸時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致精子快速死亡，相反，附睪精子可以在附睪液中保存幾天并保持其受精能力[11]；另一方面，在物種之間一定濃度的精漿通常有利于液態(tài)或冷凍狀態(tài)下精液的保存[11]。 Rodriguez-Martinez等[12]研究發(fā)現(xiàn)，解凍后添加精漿可改善膜和頂體的完整性，并增強(qiáng)體內(nèi)受精成功率，且與改良的冷凍解凍保護(hù)劑聯(lián)合使用可獲得良好的育種效果。本試驗(yàn)通過(guò)在冷凍前添加HSPA8和解凍后添加精漿，研究其對(duì)豬精子品質(zhì)的影響，以期為改善豬精子凍融損傷原理和優(yōu)質(zhì)豬精液的保存提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)和考馬斯亮藍(lán)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜(0.22 mm)購(gòu)自華美生物工程有限公司；精子頂體形態(tài)花生凝集素?zé)晒鈽?biāo)記(PNA-FITC)購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；HSPA8購(gòu)自上海聯(lián)邁生物科技有限公司；其余藥品如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 精液采集

豬精液均采自延吉市政興種豬場(chǎng)，選用5頭成年健康的長(zhǎng)白豬，使用手握法采集豬精液，檢測(cè)精子活力≥85%時(shí)可用于本試驗(yàn)。

1.3 精液冷凍前、冷凍及解凍處理

1.3.1 冷凍基礎(chǔ)液的配制 對(duì)照組(無(wú)HSPA8)冷凍基礎(chǔ)Ⅰ液：葡萄糖0.750 g，檸檬酸鈉0.690 g，Tris 0.565 g，NaHCO30.100 g，EDTA 0.235 g，青霉素鈉0.060 g，硫酸鏈霉素0.500 g，卵黃20 mL，最后定容至100 mL；對(duì)照組(無(wú)HSPA8)冷凍基礎(chǔ)Ⅱ液：冷凍基礎(chǔ)Ⅰ液和6%甘油；處理組(有HSPA8)冷凍基礎(chǔ)Ⅰ液：HSPA8 500 μg，葡萄糖0.750 g，檸檬酸鈉0.690 g，Tris 0.565 g，NaHCO30.100 g，EDTA 0.235 g，青霉素鈉0.060 g，硫酸鏈霉素0.500 g，卵黃20 mL，最后定容至1 000 mL；處理組(有HSPA8)冷凍基礎(chǔ)Ⅱ液：冷凍基礎(chǔ)Ⅰ液和6%甘油。

1.3.2 冷凍前處理 采集到合格精液后立即用BTS稀釋?zhuān)⒎湃?5 ℃恒溫箱平衡1 h，隨后用4層紗布包裹后放入17 ℃恒溫箱平衡2 h，每間隔30 min輕微上下晃動(dòng)數(shù)次避免精子進(jìn)入假死狀態(tài)；2 h后分裝到離心管中，17 ℃、2 400 r/min離心10 min，棄上清液；分別用預(yù)冷為17 ℃的冷凍基礎(chǔ)Ⅰ液進(jìn)行重懸，重懸后將其放入4 ℃恒溫箱中平衡3 h；沿著杯壁加入等體積的冷凍基礎(chǔ)Ⅱ液，最終將精子甘油濃度調(diào)為3%，精子密度為5×108/mL，對(duì)精液樣品進(jìn)行冷凍分裝。

1.3.3 冷凍處理 在4 ℃條件下緩慢灌裝精液于0.25 mL冷凍麥管中，用不同顏色的聚乙烯醇粉末迅速封口并做好顏色記錄，隨后小心放入盛有液氮的冷凍盒中，置于液氮液面上方3～5 cm處熏蒸10 min，隨后投入液氮罐內(nèi)。

借鑒游客感知價(jià)值測(cè)量相關(guān)研究，依據(jù)“Means-End”理論，參考我國(guó)《中華人民共和國(guó)旅游行業(yè)規(guī)范——旅游景區(qū)游客中心設(shè)置與服務(wù)規(guī)范》(LB/T011-2011)對(duì)于游客中心相關(guān)建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)、臨安大峽谷村游客中心現(xiàn)狀，設(shè)計(jì)游客中心屬性層與結(jié)果層題項(xiàng)；參考KAHLE[23]的LOV價(jià)值觀列表，制定使用游客中心可能滿(mǎn)足的游客最終目的題項(xiàng)，量表指標(biāo)來(lái)源如表1所示。設(shè)計(jì)訪(fǎng)談問(wèn)卷如表2所示。

1.3.4 解凍處理 解凍時(shí)迅速取出冷凍麥管置于60 ℃水浴鍋中解凍8 s。解凍后取出并剪斷細(xì)管兩端，將精液樣品倒入1.5 mL離心管中，各處理組均添加等量的提前預(yù)熱到37 ℃的對(duì)應(yīng)精漿濃度(0、10%、30%、50%)的解凍稀釋液，37 ℃恒溫箱中孵育15 min。孵育后以600 r/min離心5 min，棄上清液，按之前的原則添加預(yù)熱好的解凍稀釋液，重復(fù)2次。

1.4 精子基本質(zhì)量評(píng)估

運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估：解凍并孵育15 min后，取2 μL精液置于37 ℃的精子計(jì)數(shù)池中，在顯微鏡(200×)下，通過(guò)精子分析儀分析精子直線(xiàn)速度(VSL)、曲線(xiàn)速度(VCL)、前向性運(yùn)動(dòng)(STR)、直線(xiàn)性運(yùn)動(dòng)(LIN)、平均路徑速度(VAP)和運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性(WOB)。

質(zhì)膜完整性評(píng)估：取50 μL精液與1 mL低滲溶液混勻，37 ℃孵育30 min后，在顯微鏡(200×)下觀察200個(gè)精子(卷尾即質(zhì)膜完整的精子)，統(tǒng)計(jì)質(zhì)膜完整率。

頂體完整性評(píng)估：按照精子頂體形態(tài)花生凝集素?zé)晒鈽?biāo)記(PNA-FITC)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)，在熒光顯微鏡下觀察精子頂體狀態(tài)，置于流式細(xì)胞儀(BDC6 Plus)上進(jìn)行計(jì)數(shù)。

細(xì)胞凋亡評(píng)估：將H33342染色液與37 ℃預(yù)熱的精子混勻后，37 ℃水浴鍋中避光孵育20 min；加入PI染色工作液混勻后，37 ℃水浴鍋中孵育10 min，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)染色的精子樣本。

線(xiàn)粒體膜電位評(píng)估：按照線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)染色的精子樣本。判斷依據(jù)：高線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)的精子具有黃色或者橙色熒光；較低線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)的精子具有綠色熒光。

DNA完整性(CMA3)評(píng)估：按照Chromomycin A3檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)，在熒光顯微鏡下觀察染色后的精子。判斷依據(jù)：精子頭部發(fā)出亮綠色熒光表示CMA3陽(yáng)性(染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常)；精子頭部發(fā)出暗綠色熒光表示CMA3陰性(染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常)。

1.5 冷凍前添加HSPA8和解凍后添加精漿對(duì)豬精子獲能狀態(tài)的影響

1.5.1 提取精子蛋白 獲能后的精液800 r/min離心6 min，棄上清，將RIPA(強(qiáng))裂解液和蛋白酶抑制劑PSMF按照4∶1比例混勻加入，振蕩器振蕩3 min使精子細(xì)胞充分裂解，置于搖床上4 ℃搖動(dòng)40 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，用移液槍吸取上清液即為精子蛋白。

1.5.2 精子蛋白濃度測(cè)定 按照BCA蛋白濃度測(cè)定說(shuō)明書(shū)，加入0、1、2、4、8、12、16、20 μL標(biāo)準(zhǔn)品到96孔板中，加標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋液PBS補(bǔ)足20 μL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL；加適當(dāng)體積精子蛋白樣品到96孔板中，樣品不足時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋液PBS補(bǔ)足20 μL；在各孔中加入200 μL的BCA工作液，使用移液槍反復(fù)吸取使其充分混勻，37 ℃恒溫箱中放置30 min；用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處的吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線(xiàn)，計(jì)算各組精子蛋白最終濃度。

1.5.3 SDS-PAGE免疫印跡 將蛋白溶液和上樣緩沖液置于95 ℃以上水浴鍋中煮沸5 min；將20 μL預(yù)混好的蛋白樣品加入膠孔中，80 V 30 min后轉(zhuǎn)換100 V跑至距底邊約1.5 cm處停止；將多余膠切掉，按照膠的大小剪裁PVDF膜，使用半干轉(zhuǎn)膜的方式將膠上的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，按照由下到上的順序放置(濾紙-PVDF膜-膠-濾紙)，對(duì)應(yīng)正負(fù)極，電壓調(diào)至25 V，轉(zhuǎn)膜1.5 h。

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后的PVDF膜使用1×TBST在搖床上清洗3次，10 min/次；加入5%脫脂奶粉于搖床上封閉1～2 h，用1×TBST在搖床上洗膜3次，10 min/次；加入一抗(按照1∶1 000進(jìn)行稀釋)，放入4 ℃過(guò)夜，孵育18～24 h，用1×TBST在搖床上洗膜3次，10 min/次；加入二抗，置于搖床上孵育1～2 h，1×TBST在搖床上洗膜3次，10 min/次；將顯影液ECL染色A與B液按1∶1的比例充分混勻后，均勻覆蓋在PVDF膜上，放入數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖，采用方差分析多重比較檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 豬新鮮精液質(zhì)量參數(shù)檢測(cè)

由表1可知，新鮮精液精子活力為94.00%，質(zhì)膜完整性為73.23%，頂體完整性為70.04%，各項(xiàng)指標(biāo)均顯示精液質(zhì)量完好，說(shuō)明精液適合應(yīng)用于本試驗(yàn)研究。

表1 豬新鮮精子質(zhì)量參數(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.2 冷凍前添加HSPA8和解凍后添加精漿對(duì)豬精子運(yùn)動(dòng)能力的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，添加0.5 μg/mL HSPA8組且未添加精漿時(shí)，精子曲線(xiàn)速度、直線(xiàn)速度、平均路徑速度和前向性運(yùn)動(dòng)均顯著提升(P<0.05)，精子直線(xiàn)性運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)的擺動(dòng)性均無(wú)顯著差異(P>0.05)；向解凍稀釋液中添加不同濃度的精漿后發(fā)現(xiàn)，各處理組的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)受精漿濃度的影響產(chǎn)生改變，當(dāng)精漿濃度為50%時(shí)改善的效果最佳，且顯著高于添加0.5 μg/mL HSPA8組(P<0.05)。

表2 凍融前后豬精子運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè)結(jié)果

2.3 冷凍前添加HSPA8和解凍后添加精漿對(duì)豬精子質(zhì)量參數(shù)的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，添加0.5 μg/mL HSPA8處理組精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性均顯著提升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡水平和線(xiàn)粒體膜電位均顯著下降(P>0.05)；向解凍稀釋液中添加不同濃度的精漿后發(fā)現(xiàn)，在精漿濃度為30%時(shí)精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性和線(xiàn)粒體膜電位開(kāi)始得到顯著改善(P<0.05)，當(dāng)精漿濃度為50%時(shí)改善的效果最佳，且顯著高于添加0.5 μg/mL HSPA8組(P<0.05)。凍融前后豬精子質(zhì)膜完整性、頂體完整性、細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1～4。

a，精子尾巴卷曲-質(zhì)膜完整的精子；b，精子尾巴未卷曲-質(zhì)膜破損的精子

表3 凍融前后豬精子質(zhì)量參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

2.4 冷凍前添加HSPA8和解凍后添加精漿對(duì)豬精子魚(yú)精蛋白缺失水平的影響

由圖5可知，當(dāng)向冷凍保護(hù)劑中添加HSPA8時(shí)，精子魚(yú)精蛋白缺失率顯著降低(P<0.05)；用不同濃度精漿對(duì)解凍精子進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，用50%精漿處理的精子魚(yú)精蛋白缺失率明顯下降，且顯著低于添加0.5 μg/mL HSPA8組(P<0.05)。

a，頂體破損的精子；b，頂體完整的精子

a，活精子細(xì)胞；b，死精子細(xì)胞

a，高線(xiàn)粒體膜電位；b，低線(xiàn)粒體膜電位

A,柱形圖，肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。B,熒光圖，發(fā)出亮光(亮綠色熒光)為魚(yú)精蛋白缺失的精子；發(fā)出暗光(暗綠色熒光)為正常的精子

2.5 冷凍前添加HSPA8和解凍后添加精漿對(duì)豬精子獲能狀態(tài)的影響

由圖6可知，添加0.5 μg/mL HSPA8的精子蛋白酪氨酸磷酸化水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；用不同濃度的精漿對(duì)解凍精子進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)，添加50%精漿的處理組精子蛋白酪氨酸磷酸化水平顯著高于0.5 μg/mL HSPA8組(P<0.05)。

A，蛋白酪氨酸磷酸化檢測(cè)結(jié)果；B，灰度值

3 討 論

3.1 HSPA8對(duì)凍融精子的影響

HSPA8是高度保守的蛋白，存在于由豬輸卵管上皮、sAPM制備的可溶性蛋白質(zhì)亞群中，在精子存儲(chǔ)過(guò)程中發(fā)揮作用，可提高公豬和公牛精子的體外存活率[7]。因此，HSPA8可能是一種具有生物活性的sAPM成分，可用于提高體外精子活力[7]。本研究也得到了相同的結(jié)果，與對(duì)照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加0.5 μg/mL HSPA8提高了公豬的精子活力，且添加0.5 μg/mL HSPA8不僅僅可以提高精子活力，還可提高精子頂體膜、DNA完整性(魚(yú)精蛋白)、線(xiàn)粒體膜電位及體外獲能水平等。表明HSPA8可在一定程度上改善冷凍保護(hù)劑對(duì)豬精子的不良影響[13]。

3.2 HSPA8和精漿聯(lián)合使用對(duì)凍融精子質(zhì)量參數(shù)與動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

目前，冷凍保存仍然會(huì)對(duì)精子造成損害，低溫保存通過(guò)對(duì)精子膜、細(xì)胞骨架、運(yùn)動(dòng)器官和細(xì)胞代謝等產(chǎn)生影響，降低精子質(zhì)量[14]。精子的存活率、質(zhì)膜完整性、頂體完整性和抗氧化狀態(tài)等各種參數(shù)都與生育能力有關(guān)，且都會(huì)受到凍融過(guò)程的影響[15-16]。Lodhi等[17]報(bào)道，解凍后正常狀態(tài)精子的存活率、運(yùn)動(dòng)能力和膜完整性之間都有顯著的相關(guān)性。在本研究中，通過(guò)檢測(cè)精子的活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性和細(xì)胞凋亡水平發(fā)現(xiàn)，用精漿處理確實(shí)得到了改善。在凍融時(shí)向解凍稀釋液中添加10%和30%精漿對(duì)精子的影響相對(duì)較少，用50%精漿處理后有顯著的效果，表明精漿的作用與濃度有關(guān)；且在50%精漿中解凍冷凍保存的公豬精子將顯著提高精子的生存和運(yùn)動(dòng)能力，這可能會(huì)延長(zhǎng)精子的壽命并對(duì)母豬的生育能力產(chǎn)生積極影響。

精子活力高可能與線(xiàn)粒體的活性有關(guān)，而控制精子活力的機(jī)制是調(diào)節(jié)其線(xiàn)粒體活性，因此這對(duì)于維持精液活力是絕對(duì)有必要的[18-20]。線(xiàn)粒體膜電位與精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)(VCL、VSL、VAP等)顯著相關(guān)，且具有高水平線(xiàn)粒體膜電位的精子體外受精后受精率更高[21]。本研究中，與對(duì)照組相比，在冷凍前添加HSPA8和解凍后用50%精漿處理的精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)均顯著升高，且表現(xiàn)出更高水平的線(xiàn)粒體膜電位。 說(shuō)明0.5 μg/mL HSPA8和50%精漿聯(lián)合使用可顯著改善線(xiàn)粒體膜電位水平與精子的運(yùn)動(dòng)性能。

3.3 HSPA8和精漿聯(lián)合使用對(duì)凍融精子DNA完整性和精子獲能的影響

魚(yú)精蛋白是一種精子中濃縮的父本基因組的包裝中必不可少的特異核蛋白[22]。研究顯示，魚(yú)精蛋白缺乏會(huì)使染色質(zhì)的緊密包裝惡化，并增加對(duì)外界壓力的敏感性，從而導(dǎo)致更高的精子DNA損傷風(fēng)險(xiǎn)[23]。到目前為止，最常用的分析魚(yú)精蛋白缺乏癥的方法是CMA3染色，這與精子DNA的完整性密切相關(guān)，魚(yú)精蛋白缺乏與精子DNA損傷呈正相關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加HSPA8冷凍保護(hù)劑和解凍后添加不同濃度的精漿時(shí)魚(yú)精蛋白缺失率明顯減少，表明添加HSPA8后冷凍精子中魚(yú)精蛋白水平得到了來(lái)自精漿的主動(dòng)保護(hù)作用，從而保護(hù)精子的DNA完整性。

精子獲能是哺乳動(dòng)物精子受精的終極成熟事件，精子獲能過(guò)程包括pH改變、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的增加、鈣離子的涌入，以及精子蛋白酶體活性的變化和鋅離子的外流，以獲得受精的能力[25]。由于冷凍導(dǎo)致了類(lèi)似獲能的狀態(tài)，進(jìn)而致使凍融公豬精子的受精期縮短。研究證明，精漿可在體外對(duì)精子質(zhì)量產(chǎn)生積極的影響，可逆轉(zhuǎn)凍死的現(xiàn)象，根據(jù)金霉素(CTC)的染色模式，暴露于精漿會(huì)在體外逆轉(zhuǎn)公豬精子的冷凍吞噬作用[26]。在冷凍保存的公羊精液中添加精漿可改善受精后母羊的繁殖力[27]，在精漿中解凍公豬精子能增加體內(nèi)精子的存活時(shí)間，也可改善家畜的生殖能力[28-29]。在本研究中，冷凍前添加HSPA8和解凍后用50%精漿處理的精子蛋白酪氨酸磷酸化顯著增加，表明精子完全具備體外受精的能力，也同時(shí)有可能改善母豬的受精率。

4 結(jié) 論

本研究在冷凍基礎(chǔ)液中添加0.5 μg/mL HSPA8和解凍稀釋液中添加不同濃度的精漿發(fā)現(xiàn)，0.5 μg/mL HSPA8和50%精漿聯(lián)合使用顯著改善了精子的活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性、線(xiàn)粒體膜電位、細(xì)胞凋亡水平和體外獲能能力。