陳 哲，楊鵬霞，雷明明，陳佳彬，閆樂艷

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，南京 210014；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游設(shè)施農(nóng)業(yè)工程重點實驗室，南京 210014；3.泰州市金鵬鵝業(yè)專業(yè)合作社，泰州 225319)

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，對維持機體組織、器官功能完整性具有關(guān)鍵作用。細(xì)胞周期受細(xì)胞周期素(Cyclin)、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(CDKs)和細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子(CKIs)的共同調(diào)控。p21基因是最早被發(fā)現(xiàn)具有CKIs活性的轉(zhuǎn)錄因子，通過特異性失活CDKs調(diào)控細(xì)胞周期停滯，是抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的中心事件[1]。研究證明，p21基因在家禽卵泡發(fā)育[2]、哺乳動物卵子成熟[3]和胚胎發(fā)育[4-5]過程中具有重要調(diào)節(jié)作用。

p21是多個信號通路的中間節(jié)點[6]，其基因功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制非常復(fù)雜，啟動子區(qū)多個調(diào)控元件(如Sp1、C/EBP、STATs等)參與p21基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[7-8]。體外試驗發(fā)現(xiàn)，lncRNA SYISL可以通過與p21及肌肉特異性基因啟動子結(jié)合，沉默肌細(xì)胞生成素(myogenin，MyoG)和肌球蛋白重鏈4(myosin heavy chain 4，MYH4)的表達，促進成肌細(xì)胞增殖并抑制其分化[9]。p21基因發(fā)揮作用還受到p53和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的調(diào)控[10]。目前，關(guān)于p21基因與各轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的相互作用還不明確。p21基因在肌肉發(fā)育中的調(diào)控作用得到越來越多的關(guān)注，肌肉發(fā)生過程受到一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，這些因子在肌細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)及細(xì)胞凋亡中都起到重要作用[11]。p21在多個信號通路中發(fā)揮作用，參與成肌細(xì)胞、肌管和肌纖維等多個階段的分化停滯，與生肌過程相關(guān)，參與調(diào)控小鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)向細(xì)胞激活和增殖[12]，p21基因敲除(p21-/-)小鼠表現(xiàn)出肌肉分化延遲的癥狀，同時生肌決定因子(myogenic determinant，MyoD)和MyoG在肌肉中的表達量顯著降低[1]。

中國是肉鵝生產(chǎn)和消費大國，鵝肉是理想的高蛋白、低脂肪、低膽固醇的健康食品，近年來的消費量日趨上漲。目前，針對鵝肉的發(fā)育調(diào)控機制已經(jīng)做了大量研究工作，胚胎期是畜禽肌纖維形成的關(guān)鍵時期，挖掘影響胚胎期肌肉發(fā)育的關(guān)鍵候選基因，從而更有效調(diào)控鵝肌肉發(fā)育是可行的方案。本研究對鵝p21基因全長及啟動子區(qū)序列進行克隆與分析，篩選核心啟動子區(qū)并初步明確核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，為進一步分析p21基因在鵝胚胎期肌肉發(fā)育中的作用、闡明鵝肌肉發(fā)育的遺傳機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 泰州鵝種蛋來自泰州金鵬鵝業(yè)專業(yè)合作社，孵化第28天采集鵝胚腿肌組織樣，一部分置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?另一部分用于提取組織DNA。

1.1.2 主要試劑 SMARTer?RACE 5′/3′ Kit購自Clontech公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TksGflex DNA Polymerase、T4 DNA連接酶、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶NheⅠ及XhoⅠ均購自NEB公司；動物組織DNA提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自鼎國生物公司；熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-Enhancer、pRL-TK、pGL3-Basic及Dual-luciferase Assay System試劑盒均購自Promega公司；DNA Marker購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Mut Express?Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2定點突變試劑盒購自Vazyme公司；胎牛血清、PBS、胰蛋白酶及Opti-MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；Trizol Reagent和Lipofectamine LTX均購自Invitrogen公司；小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 采用Trizol法提取鵝胚腿肌總RNA，取1 μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，核酸分析儀測定總RNA的純度和濃度，選用D260 nm/D280 nm值為1.8～2.0的RNA為模板，按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照SMARTer?RACE 5′/3′Kit說明書反轉(zhuǎn)錄合成RACE所需cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鵝p21基因中間片段擴增 根據(jù)鴨(Anasplatyrhynchos)p21基因序列(GenBank登錄號:NW_004677468)信息查詢CDS區(qū)序列(453 bp，編碼151個氨基酸)，使用Oligo 7.0軟件設(shè)計巢式引物擴增p21基因中間片段，其中pF1和pR1為第一輪PCR引物，pF2和pR2為第二輪PCR引物，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 p21基因全長序列引物

第一輪PCR擴增體系50 μL：TksGflex DNA Polymerase 1 μL，2×Gflx PCR Buffer 25 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 22 μL。第一輪PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min；9 ℃保存。以鑒定正確的第一輪PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪PCR擴增，反應(yīng)條件與第一輪PCR一致，對第二輪PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，回收純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 鵝p21基因3′-RACE 利用pF3和UPM Primer為上、下游引物進行Outer PCR擴增。PCR擴增體系50 μL：cDNA 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 1 μL，pF3(20 μmol/L)1 μL，UPM(10×) Primer 5 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍作為模板，利用pF4和UPS Primer作為上、下游引物進行Inner PCR擴增。PCR擴增體系50 μL：Outer PCR 反應(yīng)液 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)條件同Outer PCR一致。2次PCR擴增3′-UTR序列，產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對鑒定正確的PCR產(chǎn)物純化回收后使用引物pF4進行測序，測得3′-端出現(xiàn)套峰，進行TA克隆測序。將純化回收產(chǎn)物加A處理后，使用DNA Ligation連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 鵝p21基因5′-RACE 利用pR5和UPM Primer為上、下游引物進行Outer PCR擴增。PCR擴增體系50 μL：cDNA 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 1 μL，pR5(10 μmol/L)1 μL，UPM(10×) Primer 5 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸60 s，共30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，利用pR6和UPS Primer作為上、下游引物進行Inner PCR擴增。PCR擴增體系50 μL：Outer PCR 反應(yīng)液 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 25 μL，Tks Gflex DNA Polymerase (1.25 U/μL) 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，滅菌ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)條件同Outer PCR一致。2次PCR擴增5′-UTR序列，產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對鑒定正確的PCR產(chǎn)物純化回收后使用引物pR6進行TA克隆測序。

1.2.5 鵝p21基因5′-側(cè)翼區(qū)片段PCR擴增 以泰州鵝胚腿肌cDNA為模板，結(jié)合已經(jīng)獲得的鵝p21基因序列和鴨(Anasplatyrhynchos)p21基因(GenBank登錄號：NW_004677468)側(cè)翼區(qū)序列信息，設(shè)計引物p21F/R擴增p21基因5′-側(cè)翼區(qū)序列獲得P1片段，并進行生物信息學(xué)分析，針對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點存在區(qū)域設(shè)計5條上游引物(P1F、P2F、P3F、P4F、P5F)以及共同的下游引物PR，遞減擴增啟動子區(qū)片段，對所有上游引物引入NheⅠ限制性酶切位點及保護堿基，下游引物引入了XhoⅠ酶切位點及對應(yīng)的保護堿基，引物序列見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 p21基因啟動子序列引物

PCR擴增體系50 μL：Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL，2×Gflx PCR Buffer 25 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；68 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對鑒定正確的PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pMD19-T載體上，重組質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ酶切鑒定正確后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 對所獲片段進行克隆、測序和拼接，得到鵝p21基因全序列，采用NCBI的ORF Finder程序分析開放基因閱讀框(ORF)及所編碼的氨基酸序列；利用ClustalX軟件與鴨(登錄號：XP_038024143)、原雞(登錄號：NP_989727)、火雞(登錄號：XP_010722537)、家豬(登錄號：XP_013833312)、犬(XP_038539267)、馬(登錄號：XP_023480611)、獼猴(登錄號：NP_001181651)、黑猩猩(登錄號：XP_003950875)、人(登錄號：NP_000380)、小鼠(登錄號：NP_031695)、大鼠(登錄號：NP_542960)、倉鼠(登錄號：XP_035312869)和斑馬魚(登錄號：NP_001121892)p21基因氨基酸序列進行相似性比對；采用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

使用Primer Premier 6.0軟件中的motif模塊對鵝p21基因5′-側(cè)翼區(qū)序列進行TATA-box、CAAT-box和GC-box元件分析；采用GPMiner在線軟件(http:∥www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù)測p21基因5′-端轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)；使用TFSEARCH在線軟件(http:∥mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)預(yù)測p21基因啟動子區(qū)內(nèi)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

1.2.7 鵝p21基因啟動子報告基因載體構(gòu)建及鑒定 利用表2所列引物進行PCR擴增鵝p21基因遞減長度的啟動子片段，對擴增片段進行NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收、T4 DNA連接酶連接后，定向克隆到同樣雙酶切的pGL3-Enhancer載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性單克隆菌落進一步測序鑒定。 利用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切和測序驗證，篩選構(gòu)建正確的鵝p21基因pGL3-P1(-1 114～+96 bp)、pGL3-P2(-723～+96 bp)、pGL3-P3(-444～+96 bp)、pGL3-P4(-292～+96 bp)、pGL3-P5(-35～+96 bp)和pGL3-P6(+37～+96 bp)重組雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒。將啟動子報告載體及對照質(zhì)粒pGL3-Basic分別轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞，檢測啟動子活性。

1.2.8 鵝p21基因突變位點報告基因載體的構(gòu)建 結(jié)合啟動子活性檢測結(jié)果，對啟動子核心區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行預(yù)測。 利用點突變技術(shù)對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行敲除，設(shè)計并合成引物MutF/R，引物序列見表2。 點突變試驗以pGL3-P5(-35～+96)質(zhì)粒為模板，突變引物PCR擴增整個質(zhì)粒，回收擴增片段，加入DpnⅠ酶，去除模板質(zhì)粒后再次回收，回收產(chǎn)物加T4 DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行PCR鑒定，對鑒定正確的菌液測序后挑選序列正確的質(zhì)粒進行克隆，構(gòu)建突變位點報告基因載體pGL3-MyoD-p21。

1.2.9 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性檢測 C2C12細(xì)胞復(fù)蘇后，均勻等量接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度達70%～80%時，將構(gòu)建的重組雙熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)作為試驗組，轉(zhuǎn)染pGL3-Basic為陰性對照組，pRL-TK為內(nèi)參質(zhì)粒。質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞裂解，檢測雙報告基因熒光素酶活性。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 運用GraphPad Prism軟件進行單因素方差分析，使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan’s多重比較，P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鵝p21基因的擴增

鵝胚腿肌總RNA樣品用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，可滿足試驗要求。鵝p21基因cDNA全長擴增結(jié)果見圖1。由圖1可知，分別得到中間片段(313 bp)、5′-RACE(438 bp)和3′-RACE(1 618 bp)產(chǎn)物，序列長度與預(yù)期片段大小相符。利用DNAMAN軟件對所有片段的測序結(jié)果進行拼接，最終獲得鵝p21基因全長序列1 943 bp，其中CDS區(qū)為453 bp，5′-UTR為125 bp，3′-UTR為1 365 bp。

M，DL2000 DNA Marker；1，部分CDS區(qū)PCR產(chǎn)物(313 bp)；2，3′-RACE Outer PCR產(chǎn)物；3，3′-RACE Outer PCR產(chǎn)物稀釋10倍；4，3′-RACE Inner PCR產(chǎn)物(1 618 bp)；5，5′-RACE Outer PCR產(chǎn)物；6，5′-RACE Inner PCR產(chǎn)物(438 bp)

2.2 鵝p21基因5′-側(cè)翼區(qū)PCR擴增

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，鵝p21基因5′-側(cè)翼區(qū)擴增片段P21長1 210 bp(圖2A)，系列缺失啟動子片段P1、P2、P3、P4、P5和P6分別長1 242、851、572、420、163和92 bp(圖2B)，均符合預(yù)期長度。利用DNAMAN將p21基因5′-側(cè)翼區(qū)測序結(jié)果與鵝p21基因全長cDNA序列進行拼接，獲得鵝p21基因編碼啟動子ATG前約1 100 bp的側(cè)翼區(qū)序列。

M，DL2000 DNA Marker；1～7，p21(1 210 bp)、P1(1 242 bp)、P2(851 bp)、P3(572 bp)、P4(420 bp)、P5(163 bp)和P6(92 bp)引物片段

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 鵝p21基因序列分析 ORF Finder程序分析顯示，鵝p21基因全長序列存有符合Kozak規(guī)則的完整開放閱讀框，編碼區(qū)位于126-578 bp，長453 bp，編碼151個氨基酸。利用NCBI Conserved Domains在線工具進行結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，p21基因編碼蛋白具有CDI(cyclin-dependent kinase inhibitor)家族的保守結(jié)構(gòu)域，位于21-66位氨基酸處。不同物種p21蛋白的氨基酸序列相似性比對發(fā)現(xiàn)，鵝p21基因與鴨的相似性達到93.4%，與雞和火雞的相似性均為75.5%，與其他物種相似性均較低(圖3)，說明p21作用機制在禽類中相對保守。

圖3 不同物種p21蛋白的氨基酸序列比對

2.3.2 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 根據(jù)不同物種的p21蛋白氨基酸序列，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示，鵝與鴨的親緣關(guān)系最近，且與同綱的雞、火雞成簇，豬、人等哺乳動物成簇，斑馬魚單獨成簇，最后3個物種相聚成簇(圖4)。

圖4 p21氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.3.3 鵝p21基因5′-側(cè)翼區(qū)序列分析 對鵝p21基因5′-側(cè)翼區(qū)序列進行啟動子元件分析，結(jié)果顯示，5′-側(cè)翼區(qū)序列存在1個CAAT box和1個GC box，無TATA box，BDGP在線預(yù)測鵝p21基因轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)位于-11 bp處。利用TFSEARCH預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，結(jié)果顯示，鵝p21基因啟動子區(qū)存在多個潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括C/EBP、Sp1和MyoD等(圖5)。表明鵝p21基因上游1.1 kb序列是啟動子區(qū)，具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性的潛在功能。

圖5 鵝p21基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測

2.4 雙熒光素酶報告載體構(gòu)建及活性分析

雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明，不同長度啟動子在C2C12細(xì)胞均具有活性，6個啟動子片段的活性依次呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，以pGL3-P4(-292～+96 bp)的熒光素酶相對活性最高，當(dāng)缺失p21基因啟動子區(qū)-35/+37 bp序列后，雙熒光素酶報告載體pGL3-P6(+37～+96 bp)較pGL3-P4(-292～+96 bp)、pGL3-P5(-35～+96 bp)活性極顯著降低(P<0.01)，分別下降了88.89%和83.58%(圖6)。推測-35～+96 bp是鵝p21基因核心啟動子區(qū)，在-35～+37 bp啟動子區(qū)域存在核心順式調(diào)控元件。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同

2.5 突變載體構(gòu)建及核心調(diào)控元件驗證

以pGL3-P5(-35～+96 bp)為模板，對核心啟動子區(qū)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點MyoD(+25～+36 bp)進行點突變擴增，擴增產(chǎn)物加T4 DNA Ligase連接、克隆，挑取單克隆提取質(zhì)粒進行測序驗證，結(jié)果表明，試驗成功構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點突變載體pGL3-MyoD-p21(圖7A)。將構(gòu)建好的突變位點報告基因載體pGL3-MyoD-p21和對照載體pGL3-P5(-35～+96 bp)分別轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞，雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明，突變位點報告基因在C2C12細(xì)胞中有活性，突變位點報告基因的熒光素酶相對活性極顯著低于pGL3-P5(-35～+96 bp)(P<0.01)(圖7B)。推測MyoD是調(diào)控鵝p21基因啟動子活性的核心順式調(diào)控元件。

方框內(nèi)表示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點突變比對

3 討 論

家禽肌肉的形成起始于胚胎期，由肌祖細(xì)胞定向增殖、分化成成肌細(xì)胞，成肌細(xì)胞進一步分化、融合形成肌管，最終形成肌纖維[13]。肌纖維的數(shù)量在出雛前已經(jīng)固定，后期肌肉量的增加主要依靠肌纖維的肥大[14]。肌肉含量是家禽關(guān)鍵經(jīng)濟性狀之一，因此挖掘影響禽胚胎期肌纖維發(fā)育的關(guān)鍵基因具有重要的經(jīng)濟價值。

3.1 鵝p21基因序列克隆及分析

肌肉發(fā)育過程需要許多調(diào)控因子的參與，研究表明，細(xì)胞周期調(diào)控基因在鴨胚孵化中期表達下調(diào)，減緩胸肌細(xì)胞的增殖，為孵化后期肌細(xì)胞融合和分化提供必要條件[15]。對雞胚研究發(fā)現(xiàn)，p21基因mRNA在孵化期的表達模式與成肌細(xì)胞增殖、分化規(guī)律一致[16-17]，推測細(xì)胞周期調(diào)控基因(如p21基因)在調(diào)控禽胚胎期肌肉發(fā)育中具有重要作用。本研究獲得了鵝p21基因全長序列和部分5′-側(cè)翼區(qū)序列，生物信息學(xué)分析表明，鵝p21基因編碼蛋白含有高度保守的CDI家族結(jié)合位點。系統(tǒng)進化樹分析表明，p21蛋白在不同物種間具有較高的保守性，與禽類相似性較高，與鴨進化關(guān)系最近，推測其在功能上也存在一定的相似性。

鵝p21基因啟動子區(qū)包含CAAT box和GC box等典型的真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，但缺失TATA box。TATA box是基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控開關(guān)，主要功能是保證轉(zhuǎn)錄的正確定位[18]。研究發(fā)現(xiàn)，人分泌成分(secretory component，SC)基因啟動子區(qū)缺少TATA box，但位于編碼區(qū)(+8～+21 bp)的IRF-E元件補償了TATA box缺失效應(yīng)，通過構(gòu)建起始前復(fù)合物可激活基因轉(zhuǎn)錄[19]。這與生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)家族調(diào)控機制相似，MyoD通常以二聚體形式與E-box元件結(jié)合[20]，進而激活基因轉(zhuǎn)錄，推測MyoD(+25～+36 bp)元件可能同樣具有補償TATA box缺失效應(yīng)的作用，還需要進一步試驗驗證。

3.2 鵝p21基因啟動子活性及調(diào)控元件分析

本研究構(gòu)建了6個不同長度啟動子片段的報告基因載體，雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，-35～+96 bp區(qū)域是鵝p21基因核心啟動子區(qū)，在-35～+37 bp啟動子區(qū)域存在核心順式調(diào)控元件。MatInspector分析發(fā)現(xiàn)，-35～+37 bp區(qū)域內(nèi)存在MyoD(+25～+36 bp)結(jié)合位點，利用點突變技術(shù)對該位點進行敲除，構(gòu)建雙熒光素酶重組載體，轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞，對突變位點報告基因載體進行活性檢測，結(jié)果顯示，MyoD轉(zhuǎn)錄因子突變載體pGL3-MyoD-p21的活性極顯著下降，推測MyoD是鵝p21基因的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件一般位于啟動子區(qū)，但一些重要的調(diào)控元件也存在于編碼區(qū)內(nèi)，小鼠多個組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件位于編碼區(qū)[21]，人Pax5基因關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件位于第1外顯子[22]，本研究結(jié)果表明，鵝p21基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控也存在同樣相似的機制。

MyoD是MRFs家族一員，是成肌分化的決定因子[23]。在動物胚胎期，MyoD可以誘導(dǎo)肌祖細(xì)胞向生肌細(xì)胞系轉(zhuǎn)變[24]，體外試驗也發(fā)現(xiàn)，MyoD可以將其他類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〖?xì)胞[25]。胚胎期肌細(xì)胞的分化需要肌肉特異性基因的表達和細(xì)胞周期終止共同調(diào)節(jié)[20]，研究表明，MyoD和p21基因在此過程中發(fā)揮重要作用，一方面，MyoD誘導(dǎo)前成肌細(xì)胞分化發(fā)育形成肌纖維；另一方面，通過誘導(dǎo)p21基因表達上升，進而實現(xiàn)細(xì)胞周期終止在G0階段[26]。

肌肉特異性基因啟動子區(qū)大都存在E-box元件，MRFs的二聚體可與之結(jié)合，以調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄[27-28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p21基因啟動子區(qū)含有E-box元件，且位于MyoD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點內(nèi)，核心序列為CAGGTG，MyoD可直接調(diào)控p21基因轉(zhuǎn)錄活性，這是首次在分子水平揭示MyoD對p21基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。下一步可以通過染色質(zhì)免疫共沉淀(EMSA)和凝膠阻滯分析試驗等方法驗證MyoD調(diào)控鵝p21基因轉(zhuǎn)錄活性的功能，并進一步研究其作用機制。

4 結(jié) 論

本試驗成功克隆泰州鵝p21基因全長及啟動子序列，鵝p21基因與鴨進化關(guān)系最近。啟動子活性檢測發(fā)現(xiàn)，-35～+96 bp區(qū)域是核心啟動子區(qū)，-35～+37 bp區(qū)域存在核心順式調(diào)控元件。對核心區(qū)轉(zhuǎn)錄因子進行定點突變，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子突變表達載體后測定活性，表明MyoD是啟動子核心順式調(diào)控因子。