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        4種清熱解毒復(fù)方中草藥體外抑菌及抗PRRSV活性研究

        2022-03-03 02:12:58程耀蝶陳希文
        中國畜牧獸醫(yī) 2022年2期
        關(guān)鍵詞:中草藥

        孫 璐,張 靜,尹 苗,2,程耀蝶,代 錕,吳 倩,2,趙 洪,2,陳希文,2

        (1.綿陽師范學(xué)院,動物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,綿陽 621000;2.四川生豬重大疫病監(jiān)測與防控工程研究中心,綿陽 621000)

        豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以發(fā)熱、厭食、妊娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等為主要癥狀的疫病。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,該病的患病幾率也日益增長,PRRS癥狀復(fù)雜,難以控制[1],一旦感染了PRRSV,扁桃體、上呼吸道及肺臟的巨噬細胞、單核細胞等會被破壞,造成肺損傷和機體免疫抑制,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等病菌入侵機體導(dǎo)致豬死亡的風(fēng)險就會大大增加,給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害。目前用于防制PRRSV的主要措施是接種疫苗,主要有滅活苗和弱毒苗兩種[2],但兩種疫苗的臨床效果均不理想。因此,篩選有效的抗PRRSV和抑菌的藥物是控制PRRSV的重要途徑。

        中草藥屬于純天然產(chǎn)物,可以在不傷害機體的前提下直接殺死細菌和抑制病毒,不易產(chǎn)生耐藥性,對機體毒副作用小[3]。大腸桿菌病、金黃色葡萄球菌病和PRRS均屬于外感溫?zé)岵》懂?,因動物所患疾病通常是由細菌和病毒混合感染引起,所以中藥的?lián)合使用及使用復(fù)方成為了必然[4]。瀉心湯、黃連解毒湯、三黃虎杖湯及清瘟敗毒散在方劑中屬于清熱解毒類,現(xiàn)代的藥理學(xué)研究初步證明了清熱解毒復(fù)方中草藥具有多種作用,可以抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能及抗菌等[5-6]。本試驗探究了4種清熱解毒復(fù)方中草藥抗PRRSV和體外抑菌活性,以期為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 中草藥

        黃芩(山西,批號:201004)、黃柏(四川,批號:20081405)、梔子(四川,批號:200708)、青黛(福建,批號:190102813)、荊芥(四川,批號:200701)、防風(fēng)(內(nèi)蒙古,批號:200222)、羌活(四川,批號:201201)、大黃(四川,批號:202008104)、黃連(四川,批號:202011076)、虎杖(湖北,批號:B806251-01)均購自綿陽高新區(qū)凱立大藥房。4種清熱解毒復(fù)方組分及比例見表1。

        表1 4種清熱解毒復(fù)方組成

        1.2 主要試劑及儀器

        LB培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂(PCA)、0.25%胰蛋白酶、低血清培養(yǎng)基等均購自綿陽市匯億鑫科技有限公司;One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix、RNase-free ddH2O均購自寶生物工程(大連)有限公司。

        CO2培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司;核酸提取儀購自濟凡生物科技(常州)有限公司;倒置顯微鏡(Nikon)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀均購自上海亞榮生化儀器廠;熒光定量PCR分析儀購自杭州博日科技股份有限公司;振蕩培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司。

        1.3 供試細菌和病毒

        標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、PRRSV均由綿陽師范學(xué)院動物疫病防控與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心保存。

        1.4 中草藥提取

        稱取干燥后的單味中草藥各50 g,加入500 mL蒸餾水,浸泡30 min后煎煮,沸騰后保持微沸狀態(tài)煎煮1 h[7],8層醫(yī)用紗布過濾;濾渣中加入300 mL蒸餾水,煎煮至沸騰后再保持微沸30 min,合并2次水煎提取的濾液;將濾液蒸發(fā)濃縮直至成為浸膏,再將浸膏烘干、粉碎。按4種復(fù)方的配比配制成初始濃度為250 mg/mL的藥液,高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌15 min[8],4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 體外抑菌試驗

        1.5.1 菌懸液制備 將保存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活化后,接種于LB肉湯培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18~24 h[9]。用生理鹽水稀釋細菌濃度直至108CFU/mL,作為試驗所需濃度。

        1.5.2 體外抑菌活性的測定 每15支EP管為一組。在2~14號管中各加入500 μL無菌LB肉湯,1號管中加入1 000 μL 250 mg/mL的藥液,取出500 μL加入2號管,吹打混勻,重復(fù)操作,直至12號,依次獲得62.50、31.25、15.63、7.81、3.90、1.95、0.98、0.49、0.24、0.12 mg/mL的藥液,在1~12號管中每管加入50 μL 108CFU/mL的菌懸液;13號管作為空白對照,14號管中加入50 μL菌懸液作為陽性對照,15號管中加入500 μL藥液和50 μL生理鹽水作為陰性對照,渦旋混勻,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后觀察混濁程度。將藥液和細菌的混合液每個濃度取2 μL點樣于LB平板上,每一組點樣3個平板作為對照,肉眼觀察LB平板是否有細菌生長,將無菌生長的最小濃度作為該中草藥的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)[10]。

        選出無菌生長的濃度,吸取菌藥液100 μL涂布于平板計數(shù)瓊脂上,設(shè)置3個平行對照,37 ℃恒溫培養(yǎng)18~24 h后對平板進行計數(shù)[11],3個平行對照取平均值,以菌落總數(shù)<5的最低濃度作為該中草藥的最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)[12]。

        1.6 體外抗PRRSV試驗

        1.6.1 復(fù)方中草藥對Marc-145細胞最大安全濃度的測定 用細胞維持液將復(fù)方中草藥從初始濃度250 mg/mL二倍倍比稀釋到2-10,依次加到長成單層Marc-145細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上,每孔100 μL,各稀釋度均重復(fù)4孔,設(shè)置細胞對照[13]。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,將96孔細胞板放在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況[14],以4孔均不出現(xiàn)病變?yōu)樽畲蟀踩珴舛萚15]。

        1.6.2 病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量的測定 將待測病毒進行10倍稀釋,直至10-6,加到長滿單層Marc-145細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上,每孔100 μL,每個稀釋度重復(fù)8孔,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,通過Reed-Muench法計算病毒液的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(median tissue culture infective dose,TCID50)[16]。

        距離比例=(高于50%的病變率-50%)/(高于50%病變的病變率-低于50%的病變率)

        TCID50=高于50%病變的病毒最高稀釋度的對數(shù)+距離比例

        1.6.3 中草藥對病毒吸附細胞的阻斷作用 以復(fù)方最大安全濃度為初始濃度,用細胞維持液二倍倍比稀釋復(fù)方后,加在長滿單層細胞的細胞培養(yǎng)板中,每孔100 μL,每個稀釋濃度重復(fù)4孔,37 ℃培養(yǎng)4 h后棄去原液;每孔中再加入100 μL 100 TCID50的病毒液,培養(yǎng)2 h[17],棄去液體;每孔加入100 μL維持液,培養(yǎng)72 h,設(shè)置病毒對照。

        1.6.4 中草藥對病毒合成復(fù)制的抑制作用 在長成單層Marc-145細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中加入100 μL 100 TCID50病毒液,37 ℃吸附2 h;加入不同稀釋度的中草藥稀釋液,每孔100 μL,重復(fù)4孔,37 ℃培養(yǎng)4 h后[17],棄去原液;加入100 μL維持液,培養(yǎng)72 h,設(shè)置病毒對照。

        1.6.5 中草藥對病毒的直接殺滅作用 將不同稀釋度的中草藥與等體積的100 TCID50病毒液混合,加到96孔細胞培養(yǎng)板上,37 ℃作用4 h,棄去混合液;加100 μL維持液,培養(yǎng)72 h[18],重復(fù)4孔,設(shè)置病毒對照。

        1.6.6 實時熒光定量RT-PCR檢測 通過自動核酸提取儀提取病毒RNA,參考路斌等[19]設(shè)計引物和探針,上游引物:5′-GCTAGGCCGCAAGT-ACATWC-3′;下游引物:5′-ATCATTTGCCGC-AATCG-3′;探針:5′-CCCCTGCCCACCACGTY-GECLIPSE-3′。引物及探針均由北京華大基因研究中心合成。

        PCR反應(yīng)體系15 μL:One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix 7.5 μL,上、下游引物及探針各0.5 μL,RNase-free ddH2O 4 μL,RNA模板2 μL。PCR擴增程序:52 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。檢測結(jié)果成立的標(biāo)準(zhǔn)是陽性對照FAM熒光Ct值<38,陰性對照無信號。若中草藥復(fù)方對病毒無抑制作用,則樣品中會含有病毒核酸,導(dǎo)致出現(xiàn)Ct值和特異的擴增曲線;若中草藥復(fù)方對病毒有抑制作用,則樣品中無病毒核酸,不會出現(xiàn)Ct值和特異擴增曲線,從而得出中草藥抗病毒效果。

        2 結(jié) 果

        2.1 4種復(fù)方中草藥的體外抑菌活性

        由表2可知,4種復(fù)方中草藥的體外抑菌活性差異較大,其中瀉心湯對大腸桿菌的抑菌活性最強,MIC和MBC均為7.81 mg/mL;其次是黃連解毒湯和三黃虎杖湯,黃連解毒湯MIC為31.25 mg/mL,MBC為62.50 mg/mL,三黃虎杖湯MIC為62.5 mg/mL,MBC為125 mg/mL;清瘟敗毒散對大腸桿菌沒有明顯的抑制效果。 瀉心湯、黃連解毒湯和三黃虎杖湯對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性較好,瀉心湯和三黃虎杖湯的MIC均為0.24 mg/mL,MBC均為0.49 mg/mL;黃連解毒湯的MIC為0.49 mg/mL,MBC為0.98 mg/mL;清瘟敗毒散的體外抑菌活性較差,MIC和MBC均為125 mg/mL。

        表2 4種復(fù)方中草藥對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性

        2.2 4種復(fù)方中草藥在Marc-145細胞上的最大安全濃度

        觀察細胞病變情況,結(jié)果表明,黃連解毒湯對細胞的毒害性最小,最大安全濃度為3.90 mg/mL,其次為清瘟敗毒散(表3)。

        表3 4種復(fù)方中草藥在細胞上的最大安全濃度

        2.3 PRRSV的TCID50

        經(jīng)過5 d的培養(yǎng),稀釋度在10-3至10-4時,50%的細胞孔出現(xiàn)了病變;當(dāng)稀釋度為10-1和10-2時,全部的細胞孔均出現(xiàn)病變;當(dāng)稀釋度為10-3時,8個細胞孔中有5個細胞孔發(fā)生了細胞病變,當(dāng)稀釋度10-4時,8個細胞孔中只有3個細胞孔發(fā)生病變,利用Reed-Muench法計算出PRRSV的TCID50為10-3.6(表4)。

        表4 PRRSV的TCID50

        2.4 4種復(fù)方中草藥的抗病毒試驗

        實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,陽性對照的Ct值為32.18,3種作用下不同復(fù)方中草藥抗病毒結(jié)果見表5。由表5可知,阻斷作用中,瀉心湯在1/4和1/8最大安全濃度都出現(xiàn)了病毒Ct值,分別為36.80和35.02,而在最大安全濃度和1/2最大安全濃度下無Ct值,說明在1/2最大安全濃度(0.24 mg/mL)下,瀉心湯對PRRSV有阻斷作用,三黃虎杖湯在0.12 mg/mL有阻斷效果,黃連解毒湯和清瘟敗毒散均在0.98 mg/mL對PRRSV有較好的阻斷作用;4種復(fù)方中草藥對病毒的抑制作用和直接殺滅作用都未出現(xiàn)Ct值,說明4種復(fù)方中草藥對PRRSV的抑制作用和直接殺滅作用較好。

        表5 4種復(fù)方中草藥抗病毒作用

        3 討 論

        大腸桿菌病、金黃色葡萄球菌病和PRRS是養(yǎng)殖中常見的疾病,都屬于外感溫?zé)岵》懂?,治療則以清熱解毒中草藥為主。瀉心湯具有瀉火解毒、燥濕泄熱的作用[20-21];黃連解毒湯主治火熱實證[22],主要用于清熱解毒[23];三黃虎杖湯主要具有清熱解毒、活血化瘀的功能,清瘟敗毒散能清熱解毒、瀉火通便[24],所以本試驗選取了這4種組方較為簡單的復(fù)方中草藥進行體外的抑菌抗病毒研究。

        在抑菌方面,中藥的一些成分能直接破壞細菌最外面的細胞膜和細胞壁,導(dǎo)致細菌自身的代謝出現(xiàn)紊亂,達到在體外抑制致病菌的效果[25]。王鈺雄等[26]研究中瀉心湯對普通耐藥金黃色葡萄球菌的MIC為0.3125 mg/mL,與本試驗中瀉心湯對金黃色葡萄球菌的結(jié)果相近,可能是因為大黃、黃連、黃芩3種中草藥都有一定的抑菌效果[27],大黃中含有的大黃酸、黃芩中含有的黃芩素均能夠使細胞通透性增大,造成細菌細胞內(nèi)容物流出,最終導(dǎo)致致病菌死亡[28]。本試驗中黃連解毒湯對大腸桿菌抑菌活性MIC和MBC分別為31.25和62.5 mg/mL,與呂顏枝等[29]研究黃連解毒湯對雞大腸桿菌的MIC為250 mg/mL結(jié)果相近。耿梅英等[30]研究發(fā)現(xiàn),清瘟敗毒散提取液對金黃色葡萄球菌ATCC 25923的MIC為8 mg/mL,抑菌效果較好,其所用的清瘟敗毒散主要藥物為黃連、金銀花、連翹、甘草、丹皮,而本研究中的清瘟敗毒散組方與之不同,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制效果較差??赡苁且驗楸驹囼灢捎玫氖亲顬閭鹘y(tǒng)的水煎法,但是有些中藥成分是不溶于水的,熱穩(wěn)定性也不好,所以提取出的有效成分有限,而這些有效成分之間產(chǎn)生了頡頏作用,導(dǎo)致其抑菌效果較差。

        在抗病毒方面,4種復(fù)方中草藥主要成分為黃連和黃芩,黃連主要成分為生物堿,具有清熱解毒、抗菌、抗病毒等作用;黃芩有效成分為黃芩苷、黃芩素等黃酮類物質(zhì),具有除熱、抗炎及抗菌等功效[31]。4種復(fù)方中草藥對病毒均有阻斷作用,可能是因為其中的多糖、三萜類等生物活性成分干擾病毒蛋白和RNA的合成或與病毒直接結(jié)合,抑制病毒復(fù)制或破壞其結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),大黃、黃柏等單味中藥可以直接抗病毒[32];黃芩具有抗PRRSV的作用[33];黃連的提取液可以抑制RNA聚合酶發(fā)揮抗病毒的作用[34],均與本研究結(jié)果相近。4種復(fù)方中草藥的抑制作用和直接殺滅均較好,可能是因為單味中藥之間產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),復(fù)方可以通過抑制病毒的黏附、合成等機制發(fā)揮抗病毒作用[35]。但是4種復(fù)方中草藥的組分均非單一活性成分,起關(guān)鍵作用的是哪一成分或是多靶點協(xié)同的抗病毒作用有待進一步研究[36]。冼瓊珍等[37]研究發(fā)現(xiàn),黃芩、黃連及黃柏對PRRSV有較好的阻斷作用,其中黃芩和黃連的抑制作用比阻斷作用好,但是黃柏和黃連幾乎對PRRSV沒有直接滅活的作用。唐耀平等[38]研究發(fā)現(xiàn),清瘟敗毒散對高致病性PRRSV的預(yù)防和治療的有效率達75%。本試驗結(jié)果表明,4種復(fù)方中草藥在體外的抗病毒效果均較好,但中藥中能夠抗病毒的成分很少[39],所以還需要進行更深入的研究。

        本研究采用傳統(tǒng)方法提取4種清熱解毒復(fù)方中草藥活性成分,以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和PRRSV作為病原體在體外進行了抑菌抗病毒試驗并取得了良好效果,但由于中草藥成分復(fù)雜,相關(guān)作用機制研究有限,且進入機體內(nèi)后還會受到溫度、pH、作用部位及宿主健康狀況等多種因素影響,因此若要實現(xiàn)中藥普及應(yīng)用于獸醫(yī)臨床還需要進一步深入的研究。

        4 結(jié) 論

        本研究結(jié)果表明,4種清熱解毒復(fù)方中草藥中瀉心湯體外抑菌及抗PRRSV的效果最好,其次是三黃虎杖湯、黃連解毒湯和清瘟敗毒散,4種清熱解毒復(fù)方均有一定的體外抑菌和抗病毒活性,該研究結(jié)果可為豬場臨床用藥提供一定參考。

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