李偉浩，孫媛媛，劉聚祥

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071000)

當(dāng)前，大型規(guī)模化養(yǎng)殖已成為中國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展的主要方向，而飼用抗生素對(duì)防治畜禽細(xì)菌性疾病、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)性能和飼料利用率方面均有重要作用，使得畜禽數(shù)量與產(chǎn)量得到很大提高，獲得較為可觀的經(jīng)濟(jì)效益。但飼用抗生素的長(zhǎng)期添加導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性、環(huán)境污染、動(dòng)物源食品藥物殘留等一系列問題，因此中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年7月發(fā)布194號(hào)公告：“自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種”，意味著中國(guó)飼料行業(yè)進(jìn)入全面“禁抗”時(shí)代，因此，亟需尋求研發(fā)綠色無(wú)害的動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑。在目前受到廣泛研究和應(yīng)用的替抗產(chǎn)品中，牛至油和博落回提取物作為植物提取物不僅具有促生長(zhǎng)、抑菌殺菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，而且具有天然、無(wú)毒副、無(wú)耐藥及無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn)[1-2]。

牛至油(oregano oil)是從牛至中提取的具有特殊芳香氣味的揮發(fā)油，主要化學(xué)成分是百里香酚(thymol)和香芹酚(carvacrol)、萜烯類及其衍生物等[3-4]。研究表明，牛至油可顯著抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌類及普通變形菌類[5-6]，有效調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系平衡，改善腸道形態(tài)，提高食欲，進(jìn)而可提高增重、飼料利用率及抗感染能力[7-8]。博落回(Macleayacordata)是罌粟科博落回屬多年生草本植物，博落回中主要生物活性物質(zhì)為異喹啉類生物堿，如血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿等[9-10]，具有抗菌、促進(jìn)腸道黏膜發(fā)育、改善料重比、提高生長(zhǎng)性能及增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的作用[11-12]。

最先出現(xiàn)的牛至油市售產(chǎn)品是荷蘭羅帕法姆公司1995年生產(chǎn)的諾必達(dá)(RopadiarTM)牛至油預(yù)混劑，諾必達(dá)是純天然牛至提取物，其牛至油含量≥5%，價(jià)格相對(duì)較高，應(yīng)用成本也較高。博落回提取物(Sangrovit?)最早是由德國(guó)的Phytobiotics公司生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)的主要產(chǎn)品為湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司研發(fā)的美佑壯博落回散，為二類中獸藥制劑。這些產(chǎn)品均為預(yù)混劑，不適于畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖的水線系統(tǒng)。鑒于此，本試驗(yàn)研制牛至油博落回提取物復(fù)合溶液劑，并測(cè)定其含量及體外抑菌活性，以期為臨床提供一種適用于畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖水線系統(tǒng)的替代抗生素促生長(zhǎng)劑，并為其臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 牛至油(批號(hào)：20200812，含量≥90%)購(gòu)自江西海瑞天然植物有限公司；博落回提取物(批號(hào)：F01040 020091801，含量≥60%)購(gòu)自湖南漢清生物技術(shù)有限公司；聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油(批號(hào)：20200902)購(gòu)自深圳市歐朋特科技有限公司；2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT，含量≥98%)、叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA，含量≥98%)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；色譜純乙腈(含量≥99.95%)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；色譜純磷酸(含量≥85%)購(gòu)自福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98%)、血根堿標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98%)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；抗生素藥敏片(青霉素、鏈霉素、替米考星、氟苯尼考、頭孢噻呋)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株BNCC336902、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株BNCC186335、糞鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株BNCC336445均購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC50041由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及新生牛血清均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；脫纖維綿羊血購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 電子天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超純水系統(tǒng)購(gòu)自上海力新儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；超凈工作臺(tái)(ZHJH-1106B)購(gòu)自ZHCHENG公司；恒溫振蕩器(THZ-98C)購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(SPX)購(gòu)自寧波江南儀器廠；立式高壓滅菌器(LDZX-50L)購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器(SPD-20A)、控制器(CBM-20A)及泵(LC-6AD)均購(gòu)自日本島津有限公司。

1.2 牛至油博落回口服液處方篩選及優(yōu)化

以牛至油和博落回提取物的溶解性狀、感官性狀為主要考察指標(biāo)，并結(jié)合兩種成分各自的理化性質(zhì)，考慮到溶解能力、揮發(fā)速度、穩(wěn)定性及臨床應(yīng)用中安全性等因素，選取適宜的溶劑、增溶劑和抗氧化劑。在水、乙醇及丙二醇等常用溶劑中確定以水為溶劑；比較不同增溶劑對(duì)牛至油與博落回提取物的增溶效果，在吐溫-80、吐溫-20、聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油(RH40)中確定以RH40為增溶劑；針對(duì)植物精油易氧化問題，從符合安全標(biāo)準(zhǔn)、高效抗氧化要求的BHT、維生素E及BHA中確定以BHT為抗氧化劑。

以口服液感官評(píng)分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析，采用Design-Expert 10.0統(tǒng)計(jì)軟件Box-Behnken法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，即以牛至油、博落回提取物及RH40添加量為影響因子，各取3個(gè)水平，進(jìn)行響應(yīng)面分析，從而更加直觀地篩選出牛至油博落回口服液最優(yōu)配方。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，響應(yīng)面分析因素水平見表2。

表1 牛至油博落回口服液感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 響應(yīng)面分析因素水平

1.3 含量測(cè)定

1.3.1 色譜條件 采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定：色譜柱為Waters SunFire C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶0.2%磷酸水溶液=7∶3；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為血根堿270 nm和香芹酚275 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.2 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱取10 mg香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，定容，制成濃度為400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密稱取5 mg血根堿標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，定容，制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。陰性對(duì)照品溶液的配制：按配方稱取口服液中的輔料，制成不含藥品的口服液陰性對(duì)照品，精密量取100 μL陰性對(duì)照品，置于50 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，定容。供試品溶液的配制：精密量取100 μL口服液，置于50 mL容量瓶中，加入乙腈溶解，定容。

1.3.3 專屬性考察 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白輔料制備的陰性對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件和進(jìn)樣方法進(jìn)樣，驗(yàn)證香芹酚和血根堿的出峰位置是否唯一，考察香芹酚和血根堿兩峰之間以及與其他雜質(zhì)峰分離是否良好。

1.3.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品貯備溶液適量，用乙腈稀釋制成香芹酚濃度分別為400、200、100、50、25和12.5 μg/mL，血根堿濃度分別為100、50、25、12.5、6.25和3.125 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按照1.3.1色譜條件和進(jìn)樣方法進(jìn)樣，記錄各色譜峰峰面積，以濃度X為橫坐標(biāo)、吸收峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.3.5 樣品含量測(cè)定 取制備的牛至油博落回口服液10批，按供試品溶液制備方法處理，按照1.3.1色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，并計(jì)算血根堿和香芹酚的含量。

1.4 體外抑菌試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)藥品的制備 按照優(yōu)化后牛至油博落回口服液的組方制備牛至油博落回口服液，同時(shí)分別制備5%牛至油、1%博落回對(duì)照品溶液以及空白輔料溶液。

1.4.2 藥敏片的制備 將直徑5 mm的無(wú)菌濾紙片置于高壓滅菌的5 mL玻璃藥敏瓶中，分別加入牛至油博落回口服液、5%牛至油溶液、1%博落回溶液和空白輔料溶液，待濾紙片將藥液充分吸收后將其平鋪于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃烘箱中烘干備用。

1.4.3 菌懸液制備 用無(wú)菌接種環(huán)將活化后的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，將糞鏈球菌接種于血瓊脂平板上，細(xì)菌菌種于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，然后挑取各培養(yǎng)基上該菌生長(zhǎng)比較典型的菌落接種到肉湯中：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌接種于普通肉湯中；糞鏈球菌接種于血清肉湯中，經(jīng)過(guò)平板計(jì)數(shù)法制成細(xì)菌總數(shù)為1.5×106CFU/mL的菌懸液備用。

1.4.4 抑菌圈直徑測(cè)定 采用濾紙片法(K-B法)測(cè)定抑菌圈直徑。先將高壓滅菌的瓊脂培養(yǎng)基的溫度降至45 ℃左右，在干燥滅菌的直徑9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)加入15 mL培養(yǎng)基，待冷卻凝固后，再吸取100 μL菌懸液，并用無(wú)菌涂布棒均勻涂布于相應(yīng)瓊脂平皿，備用。用鑷子輕柔夾取自制藥敏片和青霉素、鏈霉素、替米考星、頭孢噻呋、氟苯尼考藥敏片輕輕地貼于涂有菌液的培養(yǎng)基上。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑，按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》判斷對(duì)藥物的敏感性[13]。

1.4.5 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定 按照曾振靈[14]介紹的試管二倍稀釋法進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定。試驗(yàn)組取90支經(jīng)過(guò)高壓滅菌的試管，分為9排，每組10支。1～3排：每管加入2 mL無(wú)菌的液體培養(yǎng)基，每排第1個(gè)管中加入稀釋2.5倍后的牛至油博落回口服液2 mL，混勻后取2 mL加入第2管，以此類推，至第8管取2 mL廢去，最后向8支試管中分別加入50 μL供試品菌液并振蕩使其均勻；第9管加入液體培養(yǎng)基及菌懸液作無(wú)藥陽(yáng)性對(duì)照；第10管只加入液體培養(yǎng)基及試驗(yàn)藥品作無(wú)菌陰性對(duì)照。 4～6與7～9排除試驗(yàn)藥品分別添加5%牛至油對(duì)照溶液和1%博落回對(duì)照溶液以外，其余操作同1～3排。

陽(yáng)性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的渾濁現(xiàn)象，陰性對(duì)照出現(xiàn)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，則試驗(yàn)成立。觀察其他試管狀況，不出現(xiàn)渾濁的濃度是口服液的MIC。將所有清晰無(wú)菌生長(zhǎng)的試管培養(yǎng)液以劃線法接種于相應(yīng)的瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，以菌落不超過(guò)5個(gè)為口服液的MBC。

1.4.6 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 按照吳克剛等[15]介紹的微量棋盤稀釋法測(cè)定聯(lián)合用藥的MIC，將5%牛至油溶液與1%博落回溶液進(jìn)行二倍稀釋，牛至油稀釋6個(gè)梯度，按高濃度到低濃度從左到右縱向加入96孔板，博落回溶液稀釋6個(gè)梯度，按高濃度到低濃度從上到下橫向加入96孔板，接入對(duì)數(shù)期菌液，調(diào)整菌液濃度為1×105CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h。以聯(lián)合藥敏指數(shù)(FIC)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)，計(jì)算公式為：

FIC指數(shù)=(甲藥聯(lián)合時(shí)MIC/甲藥單獨(dú)時(shí)MIC)+(乙藥聯(lián)合時(shí)MIC/乙藥單獨(dú)時(shí)MIC)

FIC指數(shù)，≤0.5為協(xié)同作用；0.5～1為相加作用；1～2為無(wú)關(guān)作用；>2為頡頏作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Excel 2016和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 牛至油博落回口服液配方的優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面模型的建立 以牛至油、博落回提取物、RH40添加量為影響因子，以牛至油博落回口服液感官評(píng)分為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表3。根據(jù)Design-Expert軟件，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，從而得出最終的二元回歸方程為：感官評(píng)分Y=93.40-5.56A-1.30B+2.44C+2.75AB+4.08AC+1.80BC-12.59A2-7.46B2-7.64C2。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

續(xù)表

2.1.2 響應(yīng)面繪制及分析 采用Design-Expert軟件繪制相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖1～3。由圖1～3可知，3因素對(duì)感官評(píng)分的影響大小依次為：牛至油>博落回>RH40。等高線圖形越呈圓形，表示兩因素交互作用越??；等高線圖形越呈橢圓形，表示兩因素交互作用越大?？梢?，響應(yīng)面分析與回歸分析結(jié)果相互吻合。

圖1 牛至油與RH40添加量對(duì)口服液感官評(píng)分的二維等高線圖(A)和三維響應(yīng)面圖(B)

2.1.3 響應(yīng)面優(yōu)化配方及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳配方為：5%牛至油、1%博落回提取物、25% RH40，0.02% BHT,余量為水。最佳感官評(píng)分為94.5。驗(yàn)證試驗(yàn)中，在該條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得感官評(píng)分別為94.3、94.6和93.7，平均值94.2，說(shuō)明模型模擬較好，與實(shí)測(cè)值基本吻合。

圖2 牛至油與博落回提取物添加量對(duì)口服液感官評(píng)分的二維等高線圖(A)和三維響應(yīng)面圖(B)

圖3 博落回提取物與RH40添加量對(duì)口服液感官評(píng)分的二維等高線圖(A)和三維響應(yīng)面圖(B)

2.2 牛至油博落回口服液含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 方法專屬性驗(yàn)證 方法專屬性結(jié)果見圖4。由圖4可知，陰性對(duì)照品無(wú)明顯峰出現(xiàn)，說(shuō)明可忽略口服液的輔料對(duì)含量測(cè)量的影響，香芹酚對(duì)照品、血根堿對(duì)照品出峰時(shí)間與供試品溶液中香芹酚、血根堿出峰時(shí)間相同，均在3.8和1.1 min，峰分離度良好，周圍無(wú)雜峰干擾，說(shuō)明該方法專屬性良好，可用來(lái)測(cè)量制劑藥物的含量。

A，陰性對(duì)照品；B，香芹酚對(duì)照品；C，血根堿對(duì)照品；D，口服液樣品

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 通過(guò)測(cè)定不同濃度的香芹酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和血根堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以濃度X為橫坐標(biāo)、吸收峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示，香芹酚的線性回歸方程為：Y=13 578X+20 877，R2=0.9999，在香芹酚濃度12.5～400 μg/mL范圍內(nèi)測(cè)定方法線性良好(圖5)；血根堿的線性回歸方程為：Y=97 560X+59 801，R2=0.9998，在血根堿濃度3.125～100 μg/mL范圍內(nèi)測(cè)定方法線性良好(圖6)。

圖5 牛至油博落回口服液中香芹酚含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖6 牛至油博落回口服液中血根堿含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.3 樣品含量測(cè)定結(jié)果 檢測(cè)10批牛至油博落回口服液香芹酚的平均含量為42.59 mg/mL，血根堿的平均含量為6.51 mg/mL。

2.3 牛至油博落回口服液體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 抑菌圈直徑 不同藥物對(duì)4種細(xì)菌的體外抑菌效果見表5。由表5可知，對(duì)大腸桿菌，氟苯尼考、頭孢噻呋、鏈霉素表現(xiàn)為高度敏感，替米考星及口服液為中度敏感，而青霉素、5%牛至油溶液及1%博落回溶液為低度敏感；對(duì)沙門氏菌，氟苯尼考、頭孢噻呋及鏈霉素為高度敏感，青霉素、替米考星及口服液為中度敏感，5%牛至油和1%博落回為低度敏感；對(duì)金黃色葡萄球菌，除5%牛至油溶液表現(xiàn)為中度敏感外，其余均表現(xiàn)為高度敏感；對(duì)糞鏈球菌，氟苯尼考、青霉素及頭孢噻呋為高度敏感，1%博落回、口服液及鏈霉素表現(xiàn)為中度敏感，5%牛至油和替米考星表現(xiàn)為低度敏感。表明頭孢噻呋和氟苯尼考具有強(qiáng)大的廣譜抗菌性，而研制的牛至油博落回口服液對(duì)4種菌株均表現(xiàn)為高度或中度敏感，抗菌譜較廣，牛至油與博落回之間無(wú)頡頏作用。

表5 濾紙片法(K-B法)測(cè)得的抑菌圈直徑

2.3.2 MIC和MBC 37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，空白對(duì)照孔均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)照孔細(xì)菌生長(zhǎng)良好，可見培養(yǎng)基明顯渾濁。由表6可知，牛至油博落回口服液對(duì)4種細(xì)菌菌有較好的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌有良好的殺菌作用；1%博落回對(duì)沙門氏菌的抑制作用弱于其他3種菌，對(duì)金黃色葡萄球菌具有良好的殺菌作用；5%牛至油溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌作用較大腸桿菌、沙門氏菌及糞鏈球稍強(qiáng)，其中對(duì)糞鏈球菌抑殺效果不明顯。

表6 3種供試藥對(duì)4種細(xì)菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

2.3.3 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 5%牛至油溶液和1%博落回溶液對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥時(shí)的MIC見表7～10，二者的聯(lián)合藥敏指數(shù)見表11，結(jié)果顯示，5%牛至油溶液和1%博落回溶液的聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌表現(xiàn)為相加作用，對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用，對(duì)糞鏈球菌表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表7 牛至油和博落回提取物對(duì)大腸桿菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

表8 牛至油和博落回提取物對(duì)沙門氏菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

表9 牛至油和博落回提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

表10 牛至油和博落回提取物對(duì)糞鏈球菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

表11 牛至油和博落回提取物的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)FIC指數(shù)

3 討 論

牛至油和博落回提取物在臨床上常用制劑分別為牛至油預(yù)混劑和博落回散，二者均采用混飼給藥，混飼給藥不僅存在拌料不均問題，而且大多數(shù)畜禽在患病后會(huì)出現(xiàn)食欲下降甚至食欲廢絕，經(jīng)常需要高劑量給藥或頻繁給藥，往往難以保證療效，也提高了畜禽藥物中毒的可能性[16]?？诜夯祜嫿o藥可以將藥物均勻溶解于水中，在保證給藥量的同時(shí)降低了畜禽藥物中毒的可能性，也適應(yīng)了規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的水線供水系統(tǒng)。

3.1 牛至油博落回口服液處方優(yōu)化

通過(guò)處方篩選并采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，成功制備出了牛至油博落回口服液。該制劑處方中2種成分都不溶于水，由于是口服液劑，且主要針對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)乳頭飲水給藥，所以選擇水作為溶劑；通過(guò)篩選不同增溶劑對(duì)牛至油和博落回提取物的增溶效果，其中RH40增溶效果最好用量最少，且無(wú)毒無(wú)刺激性，故確定RH40為增溶劑；而牛至油易氧化，應(yīng)選擇脂溶性抗氧化劑，其中BHT屬于油脂抗氧化劑且符合安全標(biāo)準(zhǔn)，故根據(jù)BHT標(biāo)準(zhǔn)用量添加。

顏色、狀態(tài)、氣味等感官評(píng)價(jià)為溶液劑的主要質(zhì)量要求，因此以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，3個(gè)影響因素對(duì)感官評(píng)分構(gòu)成三維空間的響應(yīng)面圖和二維平面的等高線圖，能夠直觀地反映出3因素的相互作用和對(duì)感官評(píng)分的影響。響應(yīng)面越陡峭，表示該因素對(duì)感官評(píng)分的影響越大，響應(yīng)面越平緩，表示該因素對(duì)感官評(píng)分的影響越小[17]。隨著牛至油、博落回提取物和RH40的增加，感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明3個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分均有較明顯的影響，且兩兩因素之間的交互作用均顯著。結(jié)果表明，牛至油添加量對(duì)口服液感官影響最顯著，RH40添加量影響次之，博落回提取物添加量對(duì)口服液感官影響最小。

3.2 牛至油博落回口服液體外抑菌試驗(yàn)

王新偉等[18]就牛至油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果研究表明，牛至油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力明顯強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌，其中低濃度牛至油對(duì)2種細(xì)菌的抑菌活性與本研究結(jié)果完全一致。許璐等[19]研究發(fā)現(xiàn)，牛至油與香芹酚對(duì)金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌的殺菌效果相當(dāng)，百里香酚對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌效果與牛至油和香芹酚相當(dāng)，對(duì)糞鏈球菌的作用較弱，推測(cè)本研究中1%牛至油溶液對(duì)糞鏈球菌抑殺作用弱的原因可能是在水溶液的制備過(guò)程中有酚類損失。王朝元等[20]研究發(fā)現(xiàn)，博落回生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好；李美荃等[21]研究顯示，隨著濃度的增加，博落回生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及大腸桿菌的抑制效果增強(qiáng)，其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最強(qiáng)。蘇紅等[22]研究博落回提取物中血根堿對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，其對(duì)金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌的抑制作用最強(qiáng)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

研究發(fā)現(xiàn)，牛至油和博落回提取物對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌均有較強(qiáng)的抑菌效果[23]。牛至油抗菌機(jī)制主要是使細(xì)胞質(zhì)膜通透和去極化[24]，抑制細(xì)菌生物膜的形成，影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[25]等。博落回提取物抗菌機(jī)制主要是通過(guò)干擾Fts Z蛋白的裝配進(jìn)而抑制細(xì)菌分裂，誘導(dǎo)膜結(jié)合細(xì)胞壁自溶酶的釋放，導(dǎo)致細(xì)菌溶解[26]，抑制DNA合成，影響細(xì)胞膜的通透性[27]等，從抗菌機(jī)制預(yù)計(jì)2種藥物聯(lián)用時(shí)可以從不同途徑抑制并殺死細(xì)菌，因此本研究首次將牛至油與博落回提取物聯(lián)合應(yīng)用，聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，牛至油與博落回提取物之間存在著良好的正向作用，無(wú)頡頏作用，對(duì)大腸桿菌及沙門氏菌起相加作用，對(duì)金黃色葡萄球菌起無(wú)關(guān)作用，對(duì)糞鏈球菌為協(xié)同作用，因此可以通過(guò)聯(lián)合使用提高臨床抗菌效果。

4 結(jié) 論

本研究成功研制出可以與水任意比例混溶的牛至油博落回口服液，其中香芹酚含量為42.59 mg/mL，血根堿量為6.51 mg/mL，其對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、糞鏈球菌與金黃色葡萄球菌均有良好的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌和糞鏈球菌的抑菌效果最強(qiáng)。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，牛至油博落回聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌起相加作用，對(duì)金黃色葡萄球菌起無(wú)關(guān)作用，對(duì)糞鏈球菌為協(xié)同作用，二者聯(lián)合應(yīng)用可以提高抗菌效果。