陶德良，趙姍姍，陳 曦，陳金銘，楊 新，宋軍科，趙光輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

新孢子蟲(Neosporacaninum)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，可感染犬、牛、羊等多種哺乳動物。新孢子蟲感染會引起新生犢牛神經(jīng)系統(tǒng)紊亂以及孕畜的流產(chǎn)和死胎，是引起牛繁殖障礙的一種重要病原，給世界養(yǎng)牛業(yè)帶來了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，新孢子蟲感染導(dǎo)致的流產(chǎn)與母胎界面的炎癥以及免疫反應(yīng)有關(guān)[1-2]，但具體的致病機(jī)制仍不夠清楚。目前，國內(nèi)對于新孢子蟲致病機(jī)制的研究集中在Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、Nod樣受體(Nod-like receptors，NLRs)等先天免疫中的一些模式識別受體以及NF-κB(nuclear factor kappa-B)、MAPK(mitogen-activated protein kinase)等先天免疫中的經(jīng)典通路在新孢子蟲感染中的作用，并且有研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)等在新孢子蟲感染中也發(fā)揮著巨大的作用，但是關(guān)于新孢子蟲與凋亡、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激以及microRNA等在新孢子蟲感染中的調(diào)控作用的研究十分有限，仍需要大量的基礎(chǔ)科學(xué)研究來探討相關(guān)的機(jī)制。本文將在新孢子蟲感染過程中宿主如何通過模式識別受體識別新孢子蟲的感染、并進(jìn)一步調(diào)控相關(guān)信號通路以及細(xì)胞免疫來抵抗新孢子蟲感染方面作以概述，以期為新孢子蟲病的研究提供參考。

1 模式識別受體在新孢子蟲感染中的作用

先天免疫(innate immunity)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線，在抵抗病原感染與增殖中發(fā)揮著重要作用，同時參與抗原的識別與遞呈，并與獲得性免疫(adaptive immunity)應(yīng)答聯(lián)合作用來清除病原微生物感染。在先天免疫中，一些免疫細(xì)胞可以通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或者損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs)，當(dāng)這些模式受體被激活后，可以產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，激活相應(yīng)的信號通路，并促使吞噬細(xì)胞聚集，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，同時PRRs也會參與誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫細(xì)胞(特別是T淋巴細(xì)胞)的共刺激信號[3]。目前研究的PRRs主要包括Toll樣受體、NOD樣受體、C型凝集素受體(C-type lectins receptors，CLRs)和RIG 樣受體(RIG-like receptors，RLRs)[3]。在新孢子蟲感染中，TLRs中的TLR2和TLR3在抑制新孢子蟲的增殖以及控制炎癥方面發(fā)揮著重要作用；NLRs家族中的成員可以組裝為炎癥小體參與新孢子蟲的清除。目前對于CLRs與RLRs的研究十分有限，但也有研究發(fā)現(xiàn)，CLRs中的Dectin-1可以抑制新孢子蟲的增殖以及控制炎癥的發(fā)展。

1.1 TLRs

TLRs是一類跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞，TLRs主要通過識別病原微生物一些固有成分來參與機(jī)體的先天免疫應(yīng)答。關(guān)于TLRs在新孢子蟲感染中的作用研究日益增多，尤其集中在TLR2和TLR3。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細(xì)胞體外感染模型中檢測到TLR3和TRIF的上調(diào)，敲除TLR3和TRIF的小鼠出現(xiàn)新孢子蟲荷蟲量增加與炎癥病變加劇，表明TLR3-TRIF增強(qiáng)了小鼠對新孢子蟲感染的抵抗力，并且當(dāng)TLR3-TRIF靶向宿主的溶酶體時，新孢子蟲會激活TLR3依賴的Ⅰ型干擾素的免疫應(yīng)答[4]。在感染新孢子蟲的牛羊中同樣檢測到TLR3的上調(diào)，新孢子蟲感染的妊娠母牛在胎盤和脾臟組織以及胎兒中均可以檢測到TLR3/7/8的上調(diào)表達(dá)，這與滅活的可溶性全抗原或者重組NcSAG1、NcHSP20或NcGRA7蛋白免疫后的效果一致[1]；同樣Nc-Spain7和Nc-Spain1H這2種蟲株感染牛均能夠上調(diào)TLR2的表達(dá)，這可能與新孢子蟲的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)的毒性作用有關(guān)[5]。此外，暴露于新孢子蟲的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR2和TLR11表達(dá)上調(diào)，TLR2/MyD88依賴的抗原遞呈細(xì)胞成熟以及促炎因子增多[6]，且TLR11介導(dǎo)的MEK-ERK信號通路會迅速激活，進(jìn)而導(dǎo)致白細(xì)胞介素12p40(interleukin-12p40，IL-12P40)的上調(diào)表達(dá)[7]。由此可見，宿主TLRs在介導(dǎo)新孢子蟲感染引起的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，新孢子蟲激活的TLRs可以通過MyD88依賴途徑以及TRIF依賴途徑等接頭分子來調(diào)控下游NF-κB、MAPK等信號通路以及促進(jìn)IFN、IL等一些炎性因子的表達(dá)來發(fā)揮抗新孢子蟲感染的作用。目前關(guān)于新孢子蟲與TLRs的研究集中在TLR2和TLR3。在TLRs中，TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑激活NF-κB在先天免疫中也是經(jīng)典途徑之一，那么新孢子蟲會不會上調(diào)TLR4的表達(dá)來參與先天免疫呢？TLR9能夠識別一些CpG DNA，新孢子蟲感染會不會導(dǎo)致一些低甲基化和非甲基化的DNA或者mtDNA到胞質(zhì)中從而激活TLR9誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)仍有待探討。

1.2 NLRs

Nod樣受體又稱核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體，是一類胞漿病原模式識別受體，主要在一些免疫細(xì)胞中表達(dá)，如吞噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，其功能與其他模式識別受體類似，識別病原微生物的固有成分，從而激活先天免疫中的信號通路，目前有關(guān)Nod樣受體在新孢子蟲中的研究有限，但是Nod 2在抵抗新孢子蟲入侵中發(fā)揮著重要作用，小鼠巨噬細(xì)胞暴露于新孢子蟲后，檢測到Nod 2表達(dá)上調(diào)并與胞內(nèi)納蟲泡共定位；而敲除Nod 2小鼠的MAPK通路的激活被抑制以及新孢子蟲的荷蟲量增加[8]。除此之外，NLRs家族具有其他模式識別受體所不具備的功能，NLRs可以充當(dāng)支架蛋白，在胞質(zhì)內(nèi)招募ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)，ASC通過與caspase-1結(jié)合組裝形成炎癥小體(inflammasome)。對于新孢子蟲而言，NLRP3炎癥小體是研究最多的，新孢子蟲感染的骨髓源性巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)激活NLRP3炎癥小體，血清中IL-18和IFN-γ升高，增強(qiáng)Th1型反應(yīng)，限制新孢子蟲增殖，表明NLRP3有助于新孢子蟲的清除[9]。

1.3 CLRs

C型凝集素受體也是機(jī)體內(nèi)一類重要的PRRs，主要在一些抗原遞呈細(xì)胞中表達(dá)，如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，參與介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，包括識別病原微生物、激活補(bǔ)體以及吞噬作用等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，CLRs中的Dectin-1在新孢子蟲感染中發(fā)揮著重要作用，新孢子蟲感染的Dectin-1-/-小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與蟲體荷蟲量均出現(xiàn)下降，且IL-12p40也出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[11]，提示Dectin-1與新孢子蟲的清除有關(guān)。

1.4 其他相關(guān)受體

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，當(dāng)EGFR被激活后，能夠活化其內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，磷酸化下游的信號分子，激活包括PI3K/AKT、MAPK等在內(nèi)的多種信號通路，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖與凋亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，新孢子蟲感染會激活EGFR-AKT和EGFR-MAPK信號通路，進(jìn)而介導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡，清除入侵的新孢子蟲[2]，可能與凋亡在抵抗病原微生物中的作用有關(guān)。此外，在新孢子蟲感染的小鼠中，趨化因子受體CCR5(CC-chemokine receptor 5)被激活，并誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移到感染部位，而敲除CCR5小鼠的自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)和樹突狀細(xì)胞的遷移率大大下降，且死亡率增加[12]，提示在新孢子蟲入侵的過程中，CCR5對于炎癥的控制有一定的作用。

2 新孢子蟲感染激活宿主先天免疫

2.1 NF-κB通路

NF-κB通路是天然免疫中一條經(jīng)典的炎癥相關(guān)通路，NF-κB家族包括5個成員，Rel A(p65)、Rel B、c-Rel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)，它們可形成同源或者異源二聚體入核調(diào)控相應(yīng)的靶基因來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，尤其是在炎癥反應(yīng)中，從病原體的識別到促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生都依賴NF-κB途徑[13]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在原蟲感染中發(fā)揮著重要作用，新孢子蟲感染牛巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析表明，新孢子蟲感染激活了NF-κB通路，而滅活的新孢子蟲速殖子則不能激活NF-κB通路，提示NF-κB可能在新孢子蟲入侵過程中引起巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。有趣的是，新孢子蟲致密顆粒蛋白6(NcGRA6)和14-3-3重組蛋白激活了NF-κB通路，引起核內(nèi)NF-κB/p65蛋白水平的升高[14-15]。

2.2 MAPK通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在所有的真核細(xì)胞中均有表達(dá)，主要分為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNKs)、p38 MAPK 和ERK5 4個亞家族。當(dāng)MAPK通路激活后，可以磷酸化下游蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞的生長分化、應(yīng)激與炎癥等過程[16]。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK通路的激活與新孢子蟲感染宿主的免疫應(yīng)答密切相關(guān)，新孢子蟲果糖-1,6-二磷酸酶(NcFBPase)與14-3-3重組蛋白均可以激活MAPK途徑，顯著提高p38和ERK蛋白的磷酸化水平，并且誘導(dǎo)IL-12p40和TNF-α等細(xì)胞因子的釋放[15]，通過TLRs的串?dāng)_反應(yīng)也可以活化MAPK信號通路，新孢子蟲感染激活TLR11-Myd88依賴的MEK-ERK信號途徑，增加促炎因子的表達(dá)，減少新孢子蟲荷蟲量[7]。這些研究說明，MAPK信號通路在新孢子蟲入侵中可能發(fā)揮著正向調(diào)節(jié)作用。

2.3 其他相關(guān)信號通路

Ca2+作為機(jī)體內(nèi)重要的第二信使，是機(jī)體內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)的重要一環(huán)，可通過鈣傳感蛋白調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是在頂復(fù)門原蟲的入侵過程中，Ca2+調(diào)控著蟲體的滑行運(yùn)動和微線體分泌等生理過程，而CDPKs(calcium-dependent protein kinases)是機(jī)體內(nèi)的一種鈣傳感蛋白，在頂復(fù)門寄生原蟲鈣信號的傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，CDPKs介導(dǎo)的鈣離子信號傳導(dǎo)對于頂復(fù)門原蟲(如瘧原蟲、弓形蟲等)的入侵具有重要作用[17]。目前，關(guān)于鈣依賴蛋白激酶與新孢子蟲的作用也有研究，鈣依賴蛋白激酶抑制劑處理的感染新孢子蟲的孕鼠中，腦中寄生蟲荷蟲量降低并且幼崽的生存率提高[18]，提示CDPK可能是治療與防控新孢子蟲病的一個新的靶點(diǎn)。感染新孢子蟲的牛單核細(xì)胞的微陣列分析發(fā)現(xiàn)，STAT被磷酸化，JAK-STAT途徑上的相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并且新孢子蟲ROP16蛋白也能夠直接誘導(dǎo)STAT3發(fā)生磷酸化和核移位，最終引起細(xì)胞凋亡[19]。

2.4 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)

中性粒細(xì)胞作為一種吞噬細(xì)胞，在先天免疫中發(fā)揮著巨大作用，如吞噬清除病原體以及形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)等。NETs是宿主對抗病原微生物的感染以及炎癥反應(yīng)的一種新型效應(yīng)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，NETs在脊椎動物和無脊椎動物中廣泛存在，它不僅可以捕獲微生物與病毒，還可捕獲一些原蟲，如惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)等[20]。新孢子蟲同樣可以觸發(fā)NETs，在羊中性粒細(xì)胞中檢測到新孢子蟲速殖子與NETs的共定位，且彈性蛋白、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、鈣離子、ERK1/2和p38 MAPK等分子或信號通路均參與新孢子蟲誘導(dǎo)的胞外誘捕網(wǎng)的形成，捕獲新孢子蟲速殖子[21]，作為一種捕獲病原體的效應(yīng)機(jī)制，NETs可以通過不同的信號途徑被觸發(fā)在清除新孢子蟲中發(fā)揮一定的作用。

2.5 活性氮

一氧化氮(nitric oxide,NO)作為一種炎癥分子，在抵抗新孢子蟲入侵中發(fā)揮著重要的作用，尤其是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和降低新孢子蟲的荷蟲量，新孢子蟲感染小鼠可以誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，限制新孢子蟲在小鼠體內(nèi)的增殖，而抑制一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的活性，則會刺激新孢子蟲的增殖[22]，說明依賴于NO的殺傷作用對于新孢子蟲的增殖具有抑制作用。

3 細(xì)胞免疫應(yīng)答

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫(cellular immunity)對于病原微生物的清除十分重要，尤其是新孢子蟲，作為一種胞內(nèi)寄生的原蟲，體液免疫對其作用不大，細(xì)胞免疫才是關(guān)鍵。細(xì)胞免疫一方面可通過細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，尤其是IFN-γ，被認(rèn)為是新孢子蟲及其他胞內(nèi)寄生原蟲感染機(jī)體的救命分子，在抗病原微生物以及控制炎癥過程中發(fā)揮著重要作用[6]，另一方面，細(xì)胞免疫可由CD8+T細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶，通過死亡配體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生細(xì)胞毒性殺傷，這對于胞內(nèi)病原微生物的殺傷十分重要。但是，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的特征是出現(xiàn)以單核巨噬細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)和特異性的細(xì)胞毒性，這些強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致母畜妊娠期間流產(chǎn)。

模式識別受體不僅在先天免疫中發(fā)揮作用，TLR2還可以通過激活Th1型免疫應(yīng)答，促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)γ干擾素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-12分泌，限制寄生蟲增殖[6]。此外，新孢子蟲14-3-3蛋白可以激活Th1型免疫應(yīng)答，促進(jìn)IFN-γ的分泌，對急性新孢子蟲感染具有一定的保護(hù)作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在新孢子蟲感染的妊娠綿羊和奶牛中，胎盤中的CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤以及IFN-γ顯著上調(diào)表達(dá)[24]。高毒力(Nc-Spain7)和低毒力(Nc-Spain1H)的犬新孢子蟲株均可以導(dǎo)致外周血中CD4+與CD8+T細(xì)胞的增加，但妊娠后期炎癥免疫反應(yīng)弱于早中期[25]，這可能與新孢子蟲病由急性期轉(zhuǎn)為慢性期有關(guān)。

4 展望

隨著CRISPR-CAS9、多組學(xué)測序分析等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，學(xué)者們越來越關(guān)注新孢子蟲與宿主的互作機(jī)制研究。盡管目前已發(fā)現(xiàn)宿主可通過多種途徑調(diào)控先天免疫和適應(yīng)性免疫來抵抗新孢子蟲的感染，但關(guān)于新孢子蟲的致病機(jī)制研究仍有許多未解之謎，如新孢子蟲如何誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡以及逃避宿主免疫的方式、新孢子蟲速殖子和緩殖子之間相互轉(zhuǎn)換的分子基礎(chǔ)、新孢子蟲引起孕畜流產(chǎn)的分子機(jī)制以及導(dǎo)致新生兒神經(jīng)紊亂的機(jī)制等，這些科學(xué)問題的解決將為發(fā)掘新的防控新孢子蟲病藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子提供重要理論指導(dǎo)。