周倜 藍(lán)海斌 馬遙 朱劍 高山*

肝臟缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷是肝臟外科手術(shù)以及肝臟移植中經(jīng)常遇到的問(wèn)題。預(yù)處理是一種有效的降低肝臟I/R 損傷的方法，在損傷發(fā)生前，通過(guò)短時(shí)間的缺血或低劑量的藥物等低強(qiáng)度刺激，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的應(yīng)激，以獲得抵御高強(qiáng)度缺血缺氧的能力。研究表明，在細(xì)胞受到因缺血缺氧等因素刺激時(shí)，會(huì)影響蛋白的正常表達(dá)和修飾，導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的聚集，引起細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ER stress），細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過(guò)程中，能夠啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）來(lái)使細(xì)胞適應(yīng)外界應(yīng)激刺激，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及細(xì)胞的正常功能［1］。本研究旨在通過(guò)藥物預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，觀察其對(duì)大鼠肝臟I/R損傷的保護(hù)作用，并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 衣霉素（Tunicamycin/TM）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，大鼠GRP78、IRE1α 多克隆抗體及小鼠抗GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Santacruz 公司，HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司，BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 6 周齡SPF 級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠20 只，體重160～180 g，購(gòu)自江蘇卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXK（蘇）2021-0013）。分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中，5 只/籠，自由飲食，控制溫度范圍為22℃±2℃，濕度范圍為40%～70%，所有動(dòng)物的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1 周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4 組，每組5 只，其中空白對(duì)照組（Vehicle Sham）按體重予0.9%氯化鈉溶液（1 mL/100 g）腹腔注射，3 d 后僅行開(kāi)關(guān)腹假手術(shù)；TM 對(duì)照組（TM Sham）動(dòng)物予100μg/kg 的衣霉素行腹腔內(nèi)注射，3 d 后行假手術(shù)；I/R 損傷組（Vehicle I/R）按體重予0.9%氯化鈉溶液（1 mL/100 g）注射3 d 后行肝臟I/R 損傷手術(shù)，TM 預(yù)處理組（TM I/R）在行100μg/kg的衣霉素腹腔注射預(yù)處理3 d 后行肝臟I/R 損傷處理。

1.3 大鼠缺血再灌注損傷模型的建立 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)大鼠I/R 損傷模型采用肝中葉及肝左葉（全肝70%）缺血再灌注的方法，具體操作如下：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)前1 d 禁食，手術(shù)采用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，術(shù)中乙醚吸入維持麻醉，麻醉成功后，仰臥位固定于操作臺(tái)，背部墊高以暴露手術(shù)視野。碘伏消毒手術(shù)區(qū)域后，沿腹部正中切口剪開(kāi)腹腔并向兩側(cè)牽開(kāi)暴露肝臟，首先游離肝周圍韌帶及肝葉間韌帶，將肝中葉及肝左葉向上翻起，暴露出供應(yīng)肝左葉及肝中葉的肝蒂。對(duì)照組（Vehicle Sham 組及TM Sham 組）動(dòng)物進(jìn)行至此步驟即停止操作，溫鹽水紗布覆蓋切口4 5 min 后關(guān)腹。肝I/R 損傷模組（Vehicle I/R 組及TM I/R 組）用微型血管夾鉗夾閉供應(yīng)肝左葉及肝中葉的肝蒂，隨后用溫鹽水紗布覆蓋腹腔切口，阻斷肝蒂45 min 后放開(kāi)血管夾，待觀察到缺血肝葉血流重新灌注后，將肝臟小心復(fù)位，關(guān)腹并消毒切口。肝血流再灌注24 h后，按前述步驟麻醉開(kāi)腹，取出肝臟標(biāo)本后處死動(dòng)物。

1.4 肝臟病理學(xué)檢查 肝臟標(biāo)本取出后置于冰上，迅速用眼科剪在肝臟相同位置剪取一小塊肝臟組織放入干凈的EP 管內(nèi)保存于液氮中，用于后期蛋白水平檢測(cè)。其余部分肝臟固定于10%中性福爾馬林溶液內(nèi)。經(jīng)脫水、包埋、烘干后行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.5 血清轉(zhuǎn)氨酶檢查 各組動(dòng)物分別于術(shù)前，假手術(shù)或I/R 損傷處理后6 h 及12 h 采用斷尾取血法采集外周血全血1 mL，放置于4℃冰箱內(nèi)靜置2 h 后，4℃離心5 min（3,000rpm），用移液器吸取上層血清至潔凈EP管內(nèi)，用全自動(dòng)血生化分析儀測(cè)量血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，AST）水平。

1.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 從液氮中取出保存的肝臟組織樣本放入研缽內(nèi)，加入少量液氮后迅速研磨至粉末狀，收集組織于離心管內(nèi)，加入預(yù)冷過(guò)的裂解液，冰上裂解20 min 后使用超聲裂解10 次，再繼續(xù)冰上裂解10 min，充分裂解后放入4℃離心機(jī)離心20 min（12,000 rpm），收集上清液，即為蛋白溶液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整濃度值10 μg/uL 后分裝，采用SDS-PAGE 電泳法電泳后轉(zhuǎn)膜、抗體雜交、顯色掃描后使用Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物血清轉(zhuǎn)氨酶水平 結(jié)果顯示，僅注射0.9%氯化鈉溶液的Vehicle Sham 組動(dòng)物與TM Sham組動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)兩種轉(zhuǎn)氨酶水平無(wú)顯著差異（圖1 A、B；P＞0.05），兩組動(dòng)物假手術(shù)前后轉(zhuǎn)氨酶水平無(wú)差異（P＞0.05），表明單純TM 腹腔注射不會(huì)造成明顯的肝功能損害，是一種較為安全的預(yù)處理方式。在行I/R 損傷處理的兩組動(dòng)物中，血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1C、D）：兩組動(dòng)物血清轉(zhuǎn)氨酶水平在I/R 損傷處理后均明顯升高，至I/R 損傷后6 h，ALT 及AST 水平升至峰值，但TM I/R 組動(dòng)物外周血兩種轉(zhuǎn)氨酶的水平在I/R 損傷后6 h 均顯著低于I/R 對(duì)照組（Control）（P＜0.05），I/R損傷6 h 后，兩組動(dòng)物血清ALT 及AST 均出現(xiàn)下降，提示肝功能逐漸恢復(fù)，至I/R 損傷后12 h，Vehicle I/R 組血清ALT 水平仍明顯高于TM 預(yù)處理組（P＜0.05），I/R損傷后12 h，兩組間AST 水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖1 各組動(dòng)物血清轉(zhuǎn)氨酶水平

2.2 肝臟組織學(xué)改變 肝臟標(biāo)本HE 染色結(jié)果顯示（見(jiàn)圖2），Vehicle Sham 組動(dòng)物肝臟鏡下肝細(xì)胞形態(tài)正常，大小均勻，排列有序，具有正常的中央靜脈結(jié)構(gòu)；TM Sham 組動(dòng)物肝臟鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞輕度水腫；Vehicle I/R 組肝臟可見(jiàn)肝組織內(nèi)充血明顯，肝細(xì)胞水腫改變，大小不等，排列紊亂，肝細(xì)胞片狀壞死，匯管區(qū)內(nèi)可見(jiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)； TM I/R 組動(dòng)物肝臟鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞間血細(xì)胞及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少量肝細(xì)胞壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常。

圖2 肝臟組織病理（HE ×200）

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78 表達(dá)水平 結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3），Vehicle Sham 組GRP78 水平顯著低于其他組，與Vehicle Sham 組相比，TM Sham 組GRP78 的水平顯著升高，表明100 μg/kg 劑量的TM 預(yù)處理能夠引起肝細(xì)胞發(fā)生明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。與Vehicle I/R 組相比，TM I/R 組GRP78 水平升高更為明顯（P＜0.05）。隨后，檢測(cè)了不同處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)分子IRE1α 的激活情況，結(jié)果顯示，各組動(dòng)物肝細(xì)胞內(nèi)IRE1α 的水平無(wú)顯著差異，但各組動(dòng)物肝細(xì)胞內(nèi)pT-IRE1α 的水平存在顯著差異，在肝臟發(fā)生I/R 損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)pTIRE1α 的水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。同時(shí)，TM I/R 組動(dòng)物發(fā)生I/R 損傷后，其肝細(xì)胞內(nèi)pT-IRE1α的水平顯著高于Vehicle I/R 組（P＜0.05）。

圖3 各組肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平（*P＜0.05）

3 討論

在肝臟外科手術(shù)及肝移植過(guò)程中，肝臟I/R 損傷是手術(shù)醫(yī)師經(jīng)常遇到的問(wèn)題，常關(guān)系到術(shù)后肝功能的恢復(fù)甚至移植肝的存活。研究表明，肝臟I/R 損傷的病理生理機(jī)制主要包括缺血所直接引起細(xì)胞缺氧損傷，以及血流再灌注恢復(fù)后，肝臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的損傷［2］。為減輕手術(shù)過(guò)程中肝臟I/R 損傷，臨床醫(yī)師探索了眾多方法，缺血預(yù)處理被認(rèn)為是目前預(yù)防肝臟I/R 損傷較為有效且實(shí)用的手段，預(yù)處理能夠使肝臟可以耐受后期手術(shù)中更長(zhǎng)時(shí)間及強(qiáng)度的I/R［3］。但這一方法也存在諸多限制，近年來(lái)，通過(guò)藥物預(yù)處理的方法減輕肝臟I/R 損傷程度正成為研究的熱點(diǎn)，通過(guò)在術(shù)前給予一定劑量的藥物處理，以達(dá)到減輕術(shù)中可能需要長(zhǎng)時(shí)間肝臟缺血阻斷的肝臟I/R 損傷目的［4］。

研究表明，肝臟及多種臟器的I/R 損傷均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在著密切的聯(lián)系，發(fā)生I/R 損傷時(shí)，缺血、缺氧、肝臟內(nèi)自由基以及炎癥因子的釋放均可導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［5-6］。在I/R 發(fā)生的早期，缺血缺氧導(dǎo)致肝細(xì)胞的蛋白合成功能障礙，大量錯(cuò)誤折疊蛋白及未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔聚集，這會(huì)誘發(fā)細(xì)胞的未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）以適應(yīng)這一應(yīng)激，UPR 能夠通過(guò)激活一系列細(xì)胞內(nèi)分子通路，減少未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的聚集，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能的恢復(fù)［7］。這一特殊的自我保護(hù)機(jī)制提示可以通過(guò)刺激細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘發(fā)UPR 作為減輕I/R 損傷的新策略。

衣霉素是一種特異度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)藥物，能夠阻礙新生蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的糖基化修飾，從而引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［8］。但目前大多衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型多在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，缺少動(dòng)物體內(nèi)特異度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型，通過(guò)本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，建立了衣霉素腹腔注射誘導(dǎo)大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型，在大鼠肝臟I/R 損傷前3 d 給予100 μg/kg 的衣霉素腹腔注射，能夠明顯減輕I/R 所造成的肝臟損傷。本實(shí)驗(yàn)中，各組動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)氨酶水平檢測(cè)顯示，給予100 μg/kg 衣霉素預(yù)處理3 d 后，在接受I/R 損傷處理后，與Vehicle I/R 組相比較，TM I/R 組動(dòng)物術(shù)后外周血清中ALT 及AST 水平均明顯降低（P＜0.05），這一結(jié)果說(shuō)明，在接受衣霉素預(yù)處理后，在發(fā)生肝臟I/R 損傷時(shí)，肝臟損傷程度較輕，預(yù)處理對(duì)肝臟I/R 起到了保護(hù)作用，此外還觀察到，與Vehicle Sham 組相比，TM 組動(dòng)物ALT 及AST 水平雖然表現(xiàn)出一定程度升高，但與Vehicle I/R 相比，這樣輕度的損害對(duì)肝功能的影響較為輕微，且能夠在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)正常。術(shù)后各組動(dòng)物的肝臟組織病理學(xué)結(jié)果也表明，Vehicle I/R 組動(dòng)物肝臟出現(xiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，I/R 損傷程度較重，而TM I/R 組動(dòng)物肝臟組織的炎癥反應(yīng)程度則相對(duì)比較輕微。這一結(jié)果表明，TM 能夠在不顯著損傷肝功能的基礎(chǔ)上，對(duì)肝臟I/R 損傷起到明顯的保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為，在細(xì)胞內(nèi)主要有3 條UPR 信號(hào)傳導(dǎo)通路，分別由存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三種跨膜蛋白IRE1α、PERK、以及ATF6 感受和傳導(dǎo)，在正常生理狀態(tài)下，IRE1α、PERK、以及ATF6 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78/Bip）相結(jié)合，處于失活狀態(tài)［9］。在細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的未折疊蛋白能夠與GRP78 相結(jié)合，導(dǎo)致GRP78 與IRE1α、PERK、以及ATF6 幾種傳導(dǎo)分子解離，導(dǎo)致這些感受態(tài)蛋白的激活，引起一系列下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而減少錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的聚集。因此，GRP78 常被視為細(xì)胞發(fā)生UPR 的標(biāo)志性蛋白［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)免疫印跡的方法檢測(cè)了不同分組情況下，肝組織細(xì)胞的GRP78 表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組動(dòng)物的肝臟組織內(nèi)GRP78 的表達(dá)水平顯著低于其他各組（P＜0.05），這就說(shuō)明在正常的生理狀態(tài)下，GRP78在肝臟組織內(nèi)的表達(dá)量較低。而采取TM 腹腔注射后，筆者觀察到肝臟組織內(nèi)GRP78 的水平顯著升高，表明TM 處理能夠誘發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生比較明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而這一預(yù)處理所誘發(fā)的UPR 能夠?qū)Ω闻KI/R 損傷起到較明顯的保護(hù)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)在肝臟發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及I/R 損傷的過(guò)程中，均觀察到IRE1α 通路的激活，免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IRE1α 的表達(dá)水平在各組無(wú)明顯差異，說(shuō)明在生理狀況下，IRE1α 處于失活的狀態(tài)，而IRE1α 激活的標(biāo)志是其發(fā)生了磷酸化，通過(guò)檢測(cè)各組肝臟組織標(biāo)本內(nèi)磷酸化的IRE1α 水平，Vehicle Sham組的肝臟組織內(nèi)，磷酸化的IRE1α 水平顯著低于其他組，而TM 預(yù)處理及I/R 處理均能夠引起顯著的IRE1α磷酸化水平升高（P＜0.05）。同時(shí)，還觀察到，與I/R 組動(dòng)物相比，TM I/R 組動(dòng)物肝臟組織內(nèi)磷酸化IRE1α 的水平升高更為明顯（P＜0.05），但TM 組動(dòng)物肝臟的損傷程度卻相對(duì)較輕，提示IRE1α 的激活及磷酸化可能與TM 預(yù)處理對(duì)肝臟I/R 損傷的保護(hù)作用相關(guān)，這一結(jié)果提示TM 預(yù)處理所引起的IRE1α 的磷酸化激活可能作為一種保護(hù)性機(jī)制，減輕了I/R 所致的肝臟損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TM 預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟I/R 損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)IRE1α 的磷酸化激活可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激預(yù)處理在肝臟I/R 損傷中的保護(hù)作用相關(guān)，其下游相關(guān)分子通路及調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。