以善佳，李慕軍，馬文紅,3*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530022；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，桂林 541001；3.柳州市婦幼保健院，柳州 545002)

人類輔助生殖技術(shù)(ART)是通過各種醫(yī)療輔助手段幫助不孕不育夫婦獲得妊娠與活產(chǎn)的技術(shù)，由于促排卵技術(shù)的廣泛應(yīng)用，以及全胚冷凍策略的興起，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕過程中卵母細(xì)胞和胚胎冷凍現(xiàn)象越來越普遍，且不同時(shí)期卵母細(xì)胞及胚胎的冷凍保存和復(fù)蘇是IVF技術(shù)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。卵母細(xì)胞和胚胎的冷凍方法主要分為玻璃化冷凍和程序化冷凍。相對(duì)于程序化冷凍，玻璃化冷凍復(fù)蘇操作更加簡單，不需要使用昂貴的程序冷凍儀，條件更容易滿足，冷凍速度更快[1]。玻璃化冷凍復(fù)蘇技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于各個(gè)生殖中心，但是玻璃化冷凍對(duì)于卵母細(xì)胞、胚胎及其相關(guān)DNA甲基化、基因組印跡和組蛋白修飾等表觀遺傳修飾的影響，目前仍知之甚少。本文就這一問題進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)和總結(jié)，期望為改善玻璃化冷凍后卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)及臨床活動(dòng)提供理論依據(jù)。

一、玻璃化冷凍在ART中的應(yīng)用背景

在上世紀(jì)80年代，“玻璃化冷凍”技術(shù)首次問世。Rall等[2]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度冷凍保護(hù)劑及極速降溫的方法可減少小鼠胚胎在冷凍過程中冰晶形成，避免冰晶對(duì)胚胎損傷，從此開啟了世界各國對(duì)動(dòng)物及人類胚胎及配子玻璃化冷凍的實(shí)驗(yàn)研究及探索。隨著冷凍保護(hù)劑的不斷改善以及冷凍技術(shù)的進(jìn)步，玻璃化冷凍已廣泛應(yīng)用于卵裂期及囊胚期胚胎冷凍，也是臨床生育力保存中的主要應(yīng)用技術(shù)[1，3-4]。卵母細(xì)胞因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)特殊性導(dǎo)致玻璃化冷凍的臨床應(yīng)用時(shí)間及范圍遠(yuǎn)不及胚胎，近幾十年卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)已不斷改進(jìn)，取得了質(zhì)的飛躍。陳子江教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了我國第1例卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍復(fù)蘇后受精，患者成功受孕并分娩一對(duì)雙胞胎[5]。孫賢等[6]通過回顧其中心玻璃化冷凍卵母細(xì)胞行卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)經(jīng)玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞可獲得與新鮮卵母細(xì)胞相近的臨床結(jié)局。雖然卵母細(xì)胞及胚胎玻璃化冷凍相比于過去的程序化冷凍有較好的臨床結(jié)局，但由于卵母細(xì)胞及胚胎的玻璃化冷凍過程中需使用高濃度的冷凍保護(hù)劑以及許多人為干預(yù)操作，因此玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量、臨床結(jié)局和子代的安全性是否有不良影響而備受關(guān)注和重視。

二、卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對(duì)胚胎及子代的影響

1999年，Kuleshova等[7]首次報(bào)道運(yùn)用開放式拉細(xì)麥管對(duì)人類卵母細(xì)胞玻璃化冷凍及復(fù)蘇，再行ICSI獲得可移植胚胎并使患者順利分娩一健康子代。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，相較于傳統(tǒng)程序化冷凍，小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后存活率更高，保存效果更好；而玻璃化冷凍卵母細(xì)胞解凍后更容易形成8細(xì)胞期胚胎和囊胚[8]。

1.卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對(duì)胚胎的影響：與新鮮卵母細(xì)胞相比較，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇過程會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞損傷[3，9]。卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后可出現(xiàn)空泡增多、線粒體-平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體-囊泡復(fù)合物聚集以及皮質(zhì)顆粒增多等超微結(jié)構(gòu)改變[10]。Cobo等[11]研究顯示，玻璃化冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞發(fā)育到囊胚期的速度減慢，但胚胎著床率并無明顯改變。在胚胎發(fā)育質(zhì)量與發(fā)育潛能上，小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后其卵裂率和囊胚率下降[12]。近期研究結(jié)果顯示，人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇后再行ICSI治療，冷凍組優(yōu)質(zhì)胚胎率較新鮮組明顯下降[13]，說明卵母細(xì)胞玻璃化冷凍可能會(huì)降低胚胎發(fā)育潛能。Chamayou等[14]使用植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)技術(shù)對(duì)玻璃化冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育的囊胚進(jìn)行整倍體分析，結(jié)果表明其囊胚整倍體率和非整倍體率與新鮮卵母細(xì)胞發(fā)育囊胚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.卵母細(xì)胞玻璃化冷凍對(duì)子代的影響：因?yàn)槿祟惵涯讣?xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用時(shí)間較短，目前并沒有其相關(guān)兒童健康的長期跟蹤研究，因此分析圍產(chǎn)期結(jié)局以及出生兒童發(fā)育有利于排除該項(xiàng)技術(shù)對(duì)后代的不利影響。國內(nèi)外研究顯示，經(jīng)玻璃化冷凍卵母細(xì)胞出生兒童與新鮮卵母細(xì)胞出生兒童相比，其出生體重、新生兒出生缺陷率、圍產(chǎn)兒死亡率等結(jié)局均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[11，13]。

總之，以往研究雖然顯示卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后其超微結(jié)構(gòu)、胚胎發(fā)育速度及發(fā)育潛能有所改變，但妊娠結(jié)局、新生兒情況與新鮮卵母細(xì)胞相比無顯著差異，且卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后胚胎形成和胚胎質(zhì)量優(yōu)于程序化冷凍，這些也初步證明了卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的安全性及有效性。當(dāng)然，玻璃化冷凍技術(shù)在人類卵母細(xì)胞的應(yīng)用仍是近10～20年的事情，其遠(yuǎn)期風(fēng)險(xiǎn)不詳，仍需要進(jìn)一步密切觀察評(píng)估。

三、胚胎玻璃化冷凍對(duì)妊娠結(jié)局及子代的影響

人類胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的開展稍早于卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)。1998年日本學(xué)者M(jìn)ukaida等[15]已經(jīng)報(bào)道了世界首例通過玻璃化冷凍技術(shù)凍存并復(fù)蘇人類胚胎從而使患者獲得成功妊娠及胎兒分娩。

1.胚胎玻璃化冷凍對(duì)胚胎發(fā)育的影響：目前研究顯示，不同時(shí)期小鼠胚胎經(jīng)玻璃化冷凍對(duì)胚胎的存活率影響不一。與新鮮胚胎相比，2細(xì)胞期小鼠胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后胚胎發(fā)育速率較低，但是囊胚形成率沒有顯著下降[16]。而8細(xì)胞期胚胎經(jīng)玻璃化冷凍可導(dǎo)致小鼠胚胎存活率下降[17]。與程序化冷凍相比，人類胚胎經(jīng)玻璃化冷凍可顯著提高胚胎復(fù)蘇率和胚胎利用率，胚胎存活率通常高于95%，并且可以從受精卵到囊胚期的任何階段進(jìn)行玻璃化冷凍保存，但最有效且對(duì)患者最有利的冷凍保存階段是囊胚期[3，18]。重要的是，人類胚胎玻璃化冷凍復(fù)蘇后移植并不增加胚胎染色體核型異常的發(fā)生率[19]。

2.胚胎玻璃化冷凍對(duì)妊娠結(jié)局的影響：與新鮮胚胎移植組比較，胚胎玻璃化冷凍組在胚胎著床率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、流產(chǎn)率等臨床結(jié)局上均無明顯差異，甚至有更高的胚胎著床率和臨床妊娠率，而胚胎玻璃化冷凍組單胎分娩新生兒早產(chǎn)率較新鮮胚胎移植組增高[3，20]。

3.胚胎玻璃化冷凍對(duì)子代的影響：目前關(guān)于玻璃化冷凍復(fù)蘇胚胎移植對(duì)子代影響的研究尚存在較多分歧。有研究顯示，與新鮮胚胎移植比較，玻璃化冷凍復(fù)蘇胚胎移植并未增加子代出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)[19]。另一項(xiàng)研究結(jié)果則認(rèn)為，玻璃化冷凍復(fù)蘇胚胎移植會(huì)增加子代巨大兒發(fā)生率[21]。而小鼠胚胎研究顯示，凍胚移植子代小鼠在性成熟期脂肪含量高于鮮胚移植或自然交配產(chǎn)生的子代小鼠[22]。

綜上所述，相較于新鮮胚胎移植，胚胎經(jīng)玻璃化冷凍復(fù)蘇后移植并未降低胚胎著床率，未增加胚胎染色體異常發(fā)生率，但對(duì)子代出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)尚不明確，并且有可能對(duì)子代后期的生長發(fā)育存在負(fù)面影響。除此之外，胚胎玻璃化冷凍是否會(huì)對(duì)母嬰結(jié)局有其他影響需加強(qiáng)后續(xù)子代的長期隨訪研究。

四、玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞、胚胎影響的相關(guān)表觀遺傳學(xué)改變

為了更透徹的認(rèn)識(shí)卵母細(xì)胞及胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后對(duì)胚胎質(zhì)量、生育結(jié)局及子代的影響，研究者們從分子層面探索玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎的影響機(jī)制。目前研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍不會(huì)引起DNA序列的改變，但可導(dǎo)致核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下基因表達(dá)水平的可遺傳變化即表觀遺傳修飾的變化，這種基因表達(dá)水平的改變可以在一生中都非常穩(wěn)定，或只在生長發(fā)育過程中發(fā)生短暫變化[23]。胚胎形成期表觀遺傳修飾的改變是目前研究的熱點(diǎn)。常見的表觀遺傳修飾改變包括但不限于DNA甲基化、基因組印跡、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、非編碼RNA調(diào)控等一系列DNA和染色質(zhì)修飾[24]，最常見的是DNA甲基化和組蛋白修飾，而基因組印跡的分子機(jī)理與DNA甲基化、組蛋白修飾密切相關(guān)。

1.DNA全基因組甲基化：在受精卵到囊胚的發(fā)育過程中，母本和父本基因組均不可避免的經(jīng)歷DNA去甲基化到再次建立DNA甲基化的過程，而配子和胚胎玻璃化冷凍與其關(guān)系密切。

目前卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后是否引起胚胎全基因組甲基化水平改變尚無定論。De Munck等[25]發(fā)現(xiàn)，與新鮮卵母細(xì)胞比較，經(jīng)玻璃冷凍后人類卵母細(xì)胞以及發(fā)育至第3天的胚胎其全基因組甲基化水平均無明顯改變。然而一些研究結(jié)果則相反，顯示小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍會(huì)導(dǎo)致其DNA甲基化水平顯著下降[26-27]。

與卵母細(xì)胞不同，多項(xiàng)研究結(jié)果均顯示，胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后其整體甲基化水平發(fā)生顯著變化。Movahed等[16]研究顯示，小鼠2細(xì)胞胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后，囊胚形成率沒有顯著下降，但胚胎DNA甲基化水平穩(wěn)步下降。Yao等[28]研究表明，小鼠8細(xì)胞胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后其囊胚形成率沒有顯著下降，但8細(xì)胞胚胎及囊胚DNA甲基化水平明顯下降。

2.基因組印跡：基因組印跡又稱為遺傳印跡、親代印跡或配子印跡，是指在配子或合子發(fā)生期間，來源于親本染色體或等位基因發(fā)生的獨(dú)特改變和修飾，使父本或母本的某一方等位基因被沉默，導(dǎo)致其子代體細(xì)胞中來自于父本和母本等位基因出現(xiàn)表達(dá)活性差異。因此，具有這種差異的基因被稱為印跡基因?；蚪M印跡的分子機(jī)理與DNA甲基化、組蛋白修飾密切相關(guān)。

H19基因是父源印跡而母源表達(dá)的印跡基因，胰島素樣生長因子2(IGF2)基因是母源印跡基因并與H19基因緊密相連，受同一個(gè)差異性甲基化區(qū)域(DMR)調(diào)控[29]。大量實(shí)驗(yàn)研究證明，玻璃化冷凍會(huì)影響配子及胚胎基因組印跡水平[29-30]。在胚胎早期發(fā)育過程中，印跡首先在初級(jí)生殖細(xì)胞中被擦除，在配子發(fā)生期間重新建立，然后在后期的胚胎發(fā)育以及胎兒生長至成年保持不變[31]。因此在受精卵形成至胚胎早期，H19基因與IGF2基因表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。玻璃化冷凍胚胎會(huì)導(dǎo)致H19和IGF2基因異常甲基化。H19基因異常低甲基化狀態(tài)或高甲基化狀態(tài)均可導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常，與胎兒生長受限綜合征(SRS)及胎兒生長過度綜合征(BWS)密切相關(guān)[32]。Wang等[29]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠桑椹胚經(jīng)玻璃化冷凍復(fù)蘇后移植可導(dǎo)致胎鼠H19基因甲基化水平下降。而另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明，玻璃化冷凍小鼠胚胎可導(dǎo)致胚胎存活率較新鮮胚胎下降，著床后胚胎H19基因表達(dá)水平明顯增高；但H19基因水平變化并未出現(xiàn)在后期胎盤組織中，并且玻璃化冷凍并未改變小鼠胚胎及胎盤H19基因甲基化水平[17]。卵母細(xì)胞及早期胚胎的玻璃化冷凍是否會(huì)導(dǎo)致H19基因異常甲基化狀態(tài)，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

母源性印跡、父源性表達(dá)印跡基因Peg3、Peg10與參與促進(jìn)胎盤發(fā)育的C2H2型鋅指蛋白生成密切相關(guān)[33]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后Peg3甲基化水平無明顯改變，但其囊胚Peg3-DMR甲基化水平顯著下降[30]；而小鼠卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后Peg10表達(dá)水平顯著上升，相反IGF2R基因表達(dá)水平明顯下降[34]。同樣是母源性印跡、父源性表達(dá)的小核核糖核蛋白N(Snrpn)印跡基因，與細(xì)胞分化、增殖、胚胎正常發(fā)育有關(guān)[35]。印跡基因Snrpn的異常甲基化狀態(tài)與Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征有關(guān)[36-37]。姚建鳳等[35]發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠婦女分娩后胎盤組織比較，接受IVF-ET治療的婦女新鮮周期組和玻璃化冷凍組胎盤組織Snrpn mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均表達(dá)增高，但新鮮周期組和玻璃化冷凍組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)研究顯示，玻璃化冷凍一定程度上可影響卵母細(xì)胞、胚胎甚至胎盤中Peg3、Peg10、Snrpn等印跡基因的表達(dá)。

3.組蛋白修飾：基因被組蛋白包裹會(huì)影響其與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，影響基因轉(zhuǎn)錄。若想開啟基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，需要改變組蛋白修飾狀態(tài)，使其和DNA的結(jié)合變得松弛才能實(shí)現(xiàn)。常見的組蛋白修飾包括乙?；⒓谆?、泛素化、磷酸化等[38]，而目前研究與卵母細(xì)胞和胚胎玻璃化冷凍相關(guān)的組蛋白修飾主要為組蛋白乙?；图谆?/p>

組蛋白乙?；航M蛋白乙酰化是組蛋白表觀修飾方式之一，組蛋白乙?；腿ヒ阴；癄顟B(tài)主要由組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HATs)與去乙?；?HDACs)這兩類乙?；揎椕腹餐饔枚_(dá)到平衡。當(dāng)組蛋白乙酰化與去乙?；ATs和HDACs之間的平衡異常，則會(huì)影響DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育異常。有文獻(xiàn)報(bào)道，玻璃化冷凍會(huì)增加小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞中組蛋白H4K12[39]和H3K9[40]的乙酰化水平，降低小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞HDAC1[40]水平。相對(duì)較低組蛋白乙?；绞遣ＡЩ鋬雎涯讣?xì)胞成熟能力的關(guān)鍵，低HDAC6水平的小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后存活率、卵裂率和囊胚形成率均降低，用HDAC6反義轉(zhuǎn)染卵母細(xì)胞可顯著提高卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的存活率、卵裂率和囊胚率[41]。也有其他研究報(bào)道，玻璃化冷凍小鼠2細(xì)胞期胚胎可增加其卵裂期及囊胚期胚胎組蛋白H3K9乙?；絒42]。總體上來說，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞、胚胎會(huì)促進(jìn)卵母細(xì)胞和早期胚胎組蛋白乙?；咚奖磉_(dá)，這與玻璃化冷凍導(dǎo)致HATs和HDACs之間的平衡異常以及早期胚胎基因組激活較少有關(guān)，但是否會(huì)導(dǎo)致囊胚期組蛋白乙酰化水平改變，還需擴(kuò)大樣本量深入研究。

組蛋白甲基化：組蛋白甲基化修飾主要發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，特定的組蛋白甲基化修飾可以調(diào)控早期胚胎的命運(yùn)，并對(duì)維持胚胎多功能性起著重要作用。早期胚胎組蛋白低甲基化水平與胚胎異常形態(tài)有關(guān)[43]，有可能是胚胎發(fā)育不良的預(yù)測指標(biāo)。H3K9甲基化水平在胚胎發(fā)育過程中非常重要，相對(duì)較高H3K9甲基化水平可提高囊胚形成率[24]。研究表明，玻璃化冷凍小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞H3K9甲基化水平增高，繼續(xù)體外培養(yǎng)至2細(xì)胞期及4細(xì)胞期胚胎，發(fā)現(xiàn)卵裂期胚胎H3K9甲基化水平降低，而胚胎繼續(xù)發(fā)育至囊胚期，H3K9甲基化水平恢復(fù)至正常水平[43]。以此推測，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后發(fā)育成囊胚過程中，可能主動(dòng)調(diào)整了卵母細(xì)胞及早期卵裂期胚胎的異常組蛋白甲基化水平，這些異?？梢酝ㄟ^某些機(jī)制在早期卵裂期胚胎中得到部分糾正，胚胎最終發(fā)育到囊胚階段。

五、結(jié)語

卵母細(xì)胞和胚胎玻璃化冷凍及復(fù)蘇技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于各生殖中心，玻璃化冷凍技術(shù)相較于程序化冷凍不僅有著安全、經(jīng)濟(jì)、便捷的優(yōu)勢，還可提高胚胎的復(fù)蘇率和利用率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，經(jīng)玻璃化冷凍復(fù)蘇的胚胎產(chǎn)生的子代其體重及脂肪含量增加，但是卵母細(xì)胞、胚胎玻璃化冷凍是否會(huì)對(duì)母嬰結(jié)局有其他影響仍需加強(qiáng)后續(xù)子代的長期隨訪研究。目前研究結(jié)果表明，雖然卵母細(xì)胞和胚胎玻璃化冷凍不改變哺乳動(dòng)物DNA序列，但可導(dǎo)致基因表觀遺傳修飾水平的變化進(jìn)而影響其靶基因表達(dá)水平，包括DNA甲基化和組蛋白修飾等復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的改變。廣泛、深入、系統(tǒng)地研究卵母細(xì)胞和胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后所造成的表觀遺傳學(xué)改變，可以為改善玻璃化冷凍卵母細(xì)胞及胚胎技術(shù)、了解玻璃化冷凍對(duì)妊娠結(jié)局及子代長遠(yuǎn)影響的機(jī)制提供理論依據(jù)。