徐惠玲，吳正中，付志紅，張華坤，范晶，李雪梅

(南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院，深圳 518048)

在胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)中，一般活檢1～2個卵裂期細胞或者5～10個囊胚滋養(yǎng)外胚層細胞用于分析。每個細胞大約只含6 pg DNA，如此少的遺傳物質阻礙了下游的基因檢測[1-2]。目前的主流方法是將胚胎活檢細胞進行全基因組擴增(WGA)，包括多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(MALBAC)、多重置換擴增技術(MDA)和簡并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)等方法，將pg級的遺傳物質放大到ng級，然后再進行基因突變的檢測[3-4]。但是在WGA的過程中，容易出現(xiàn)等位基因脫扣(ADO)現(xiàn)象，造成誤診[2]，尤其對于顯性遺傳的突變來說，ADO更是可能直接造成有疾病表型的后代。因此，目前單基因病胚胎植入前遺傳學檢測(PGT-M)主要采用胚胎WGA產物進行目標變異位點檢測結合家系單倍型連鎖分析檢測策略[5]。常規(guī)的家系單倍型連鎖分析需要先證者患兒或是其他核心家系成員，而對于致病位點為新發(fā)突變且未妊娠過患兒的夫妻，常規(guī)的家系連鎖分析無法滿足檢測。

本研究納入的3個家系均為夫妻一方本身為患者而致病變異在其核心家系未找到來源，經遺傳咨詢判定為新發(fā)突變，且夫妻雙方未妊娠過患兒。對于男方為新發(fā)突變患者，我們采用了單精子測序技術構建家系單倍型；對于女方為新發(fā)突變患者，我們采用了胚胎互推策略進行致病性單倍型的確定，以此探討不同的單倍型構建方法在新發(fā)突變家系中的PGT應用性及有效性。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年4月至2021年12月于本生殖醫(yī)學中心就診并接受遺傳咨詢和輔助生殖助孕的患者。共納入了3對，其中一方為遺傳病患者且致病變異未找到來源的夫婦(表1)。家系1中存在突變的為女方，30歲，為雙腎多發(fā)性復雜性囊腫患者，PKD1基因檢測結果發(fā)現(xiàn)Exon 37存在c.10838T>C雜合突變。家系2中存在突變的為男方，32歲，出生后即發(fā)生溶血性貧血，血紅蛋白濃度(HGB) 60～70 g/L，B超提示脾臟腫大，2000年行脾切除術，血涂片顯微鏡檢查疑球形紅細胞增多癥，基因檢測結果為ANK1：c.3641delC，診斷為Ⅰ型球形紅細胞增多癥。家系3中存在突變的為男方，32歲，8年前逐漸出現(xiàn)耳鳴、眩暈、嘔吐、視力障礙，頭顱MRI顯示雙側橋小腦區(qū)結節(jié)狀病變，與雙側聽神經關系緊密，腦干受壓和左側三叉神經受壓，診斷為雙耳神經纖維瘤，后行顱內纖維瘤切除術，術后雙耳聽力喪失，基因檢測結果為NF2：c.861delC。上述3個家系中疾病的遺傳方式均為常染色體顯性遺傳，3個患者的父母此前在外院均未檢測到與患者相同的致病變異，家族中沒有相同癥狀的患者。該3對夫婦要求進行PGT，阻斷疾病在下一代的傳遞。本研究經南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院倫理委員會批準，患者均已簽署知情同意書。

表1 三個家系患者相關資料

二、研究方法

1.體外受精及囊胚活檢：對3個家系女方進行臨床控制性促排卵(COH)，注射HCG 36～38 h后進行取卵。通過卵胞漿內單精子注射(ICSI)進行授精，并于授精后15～18 h觀察原核，評估受精情況。胚胎在溫度為37℃，氣體濃度為5%O2、6%CO2和89%N2的條件下采用序貫培養(yǎng)法(G1、G2，Vitrolife，瑞典)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3天(D3)下午對透明帶進行激光打孔，孔徑為10 μm。囊胚觀察采用Gardner評級標準[7]。選擇D5、D6囊胚腔充分擴張的囊胚用激光法進行活檢，具體操作是持卵針控制胚胎，活檢針控制遠離內細胞團滋養(yǎng)層區(qū)域，在孵出區(qū)域激光擊打使其皺縮，并切割下5～10個滋養(yǎng)層細胞。活檢下的細胞用不含Mg2+和Ca2+的 1×PBS 溶液清洗3次后，保存在含有5 μl細胞裂解液的PCR管中?；顧z后的胚胎均使用玻璃化冷凍試劑盒(VT101，Kitazato，日本)進行冷凍。

2.單精子分離及一代測序分析：家系2和家系3均是男方為新發(fā)突變，我們采用單精子測序的方法構建單倍型。對男方新鮮射出的精液進行梯度密度離心后，用PBS稀釋至適宜濃度，在顯微鏡觀察下使用口吸管挑取單個精子，放置于含有5 μl裂解液的PCR管中短暫離心，共挑取20～30條精子。分離后的單精子和胚胎活檢樣本使用MALBAC的方法進行WGA，WGA產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)300～2 000 bp彌散條帶即為擴增成功。擴增成功后，對胚胎活檢樣本及單精子WGA產物進行致病變異的一代測序驗證。

3.單倍體分析及拷貝數(shù)變異(CNV)檢測：將3對夫婦外周血DNA樣本、活檢胚胎細胞及單精子WGA產物進行高通量靶向Panel測序(100X)，在突變位點兩端選取有效單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點進行單倍型分析。家系2和家系3利用單精子及夫妻外周血的靶向測序結果，即可判斷男方突變所在的染色體，據(jù)此再判斷其胚胎致病變異攜帶狀態(tài)(圖1 A)。家系1中女方為新發(fā)突變患者，采用胚胎互推的策略進行檢測，將一代測序結果為攜帶突變的胚胎作為家系“先證者”，結合夫婦及剩余其他胚胎靶向測序結果進行單倍型綜合分析，判斷胚胎是否攜帶致病變異(圖1 B)。同時，為了避免染色體異常帶來的流產、死胎、畸形患兒的出生，除了致病基因的檢測以外，我們還對每個活檢胚胎進行了CNV的檢測，報告范圍為大于10 Mb及嵌合比例大于30%的CNVs。

A：家系2和家系3采用的單精子測序構建單體型技術；B：家系1采用的胚胎互推策略構建單倍體型技術；“O”代表野生型位點，“X”代表致病變異位點。

4.胚胎植入及產前診斷：根據(jù)基因檢測結果，將染色體正常且不攜帶致病變異的胚胎復蘇后移植入子宮，移植后第10天檢測患者HCG水平；移植后35 d，B超檢測孕囊和胎心，判斷是否妊娠。孕中期進行羊水穿刺驗證PGT結果的準確性。

結 果

一、胚胎培養(yǎng)及活檢情況

3個家系一共獲卵61枚，其中有49枚為成熟卵母細胞，這49枚均正常受精，受精率為100%。D3一共有46枚胚胎進行囊胚培養(yǎng)，達到活檢標準24枚(表2)，囊胚形成率為52.2%，所有胚胎活檢樣本均WGA擴增成功，WGA成功率為100%。

表2 家系胚胎培養(yǎng)及活檢情況

二、單精子分離及一代測序結果

家系2和家系3各有4份單精子樣本擴增成功，均其中2份攜帶男方致病變異位點，2份檢測結果為野生型，其中家系2檢測的是單精子的ANK1：c.3641delC位點(圖2 A)，家系3檢測的是單精子的NF2：c.861delC位點(圖2 B)。

A：家系2單精子測序結果；B：家系3單精子測序結果；紅框內為突變位點。

三、胚胎基因型及CNV檢測結果

3個家系一共檢測了24個囊胚(表3)。其中家系1的E1-5及E1-14號胚胎一代測序結果出現(xiàn)了ADO現(xiàn)象，ADO率為8.3%(2/24)，這也進一步驗證了進行連鎖分析的必要性。CNV的檢測結果顯示，24個囊胚中20個核型為46，XN的胚胎，整倍體率為83.3%(20/24)；有4個染色體片段拷貝數(shù)異常的胚胎，4個均為嵌合體胚胎，嵌合比例為16.7%(4/24)。

表3 三個家系胚胎檢測及處理結果

續(xù)表

四、胚胎移植及隨訪結果

3個家系分別移植了1枚不攜帶致病變異的整倍體胚胎。家系1移植了E1-1號胚胎后第10天，女方β-HCG檢測數(shù)值為254.52 U/L；移植術后第39天，B超檢查可見胎心胎芽；孕19周羊水穿刺檢查結果為：46，XN，且不攜帶PKD1：c.10838T>C變異；孕37周順產一名2 220 g健康女嬰。家系2移植了E2-1號胚胎后第9天，β-HCG檢測數(shù)值為474.45 U/L；移植術后第31天，B超檢查可見胎心胎芽；孕17周羊水穿刺結果為46，XN，且不攜帶ANK1：c.3641delC致病變異，撰稿時為妊娠第24周。家系3移植了E3-1號胚胎后第9天，β-HCG檢測數(shù)值為252.03 U/L，孕18周羊水穿刺結果為46，XN，且不攜帶NF2：c.861delC致病變異，撰稿時為妊娠第20周。

討 論

PGT-M與產前診斷相結合，從理論上講能從源頭阻止患病胎兒的妊娠，避免了妊娠患病胎兒給孕婦帶來的身體傷害、給孕婦家庭及社會帶來的沉重負擔。目前，針對胚胎活檢細胞的WGA方法均存在一定概率的ADO，在單細胞水平，MALBAC擴增的ADO率為4.55%，MDA擴增的ADO率為22.5%，雖然使用5個以上細胞作為起始模板，ADO率會顯著下降，但是仍存在誤診的可能[8]。利用突變位點兩端的短串聯(lián)重復序列(STR)或SNP位點進行家系單倍型連鎖分析是解決ADO的主流方法，而家系成員的缺失及新發(fā)突變無法完成常規(guī)的疾病連鎖分析。

本研究納入的3個家系均為新發(fā)突變。據(jù)報道，新發(fā)突變發(fā)生概率與父親母親年齡、基因組結構、突變類型等因素相關[9-11]。家系1所涉及的常染色體顯性多囊腎屬于新發(fā)突變率較高的一種疾病，該疾病的新發(fā)突變率可達10%～15%[12-13]。據(jù)估計，父母表型正常的球形紅細胞增多癥患兒多達50%是由ANK1新發(fā)突變所導致[14]。NF2基因突變導致的Ⅱ型神經纖維瘤50%由新發(fā)突變導致，剩余患者是從受累的父母中遺傳而來[15]。隨著PGT-M技術的成熟和應用越來越廣泛，如何對攜帶新發(fā)突變夫妻的胚胎進行基因檢測，也需要更多的研究和實踐。

近年來，已有研究探討和解決了新發(fā)突變及家系成員缺失的單倍型連鎖分析。如2021年，Wang等[16]從ADPKD新發(fā)突變患者受累胚胎確定了“高危型”和“低危型”的單倍體，當送檢胚胎一代測序結果顯示無受累胚胎作為“先證者”時，可利用患者單精子或極體測序結果判斷胚胎的致病變異攜帶狀態(tài)。此外，有學者利用Pacbio第三代長讀長測序技術確定了2對攜帶單基因致病突變夫婦的致病突變所在染色體，再與胚胎SNP位點進行單倍體型分析，從而判斷胚胎疾病的攜帶狀態(tài)[17]。第三代長讀長測序在解讀復雜的基因組結構等方面有其優(yōu)越性，比如可以解決多囊腎疾病中的假基因同源性高的問題，但是其成本較高、通量較小、分辨率較低，目前應用還僅處于科學研究階段，并未在實際應用中進行推廣。還有學者利用10X Genomics技術對2對分別攜帶地中海貧血以及Norrie疾病突變基因的夫婦，在不依賴先證者以及相關家系成員的情況下，完成了PGT-M的單倍型連鎖分析，移植后兩對夫婦均獲得了健康的后代[18]。但是該種方法在GC含量高、高度重復等復雜基因組區(qū)域不能保證單倍型分型成功，此外由于成本較高，適用性受到限制。

本研究針對不同性別攜帶的新發(fā)突變采取了兩種單倍型分析策略。家系2、3為男方攜帶新發(fā)突變，我們分離男方單精子進行測序及致病位點的驗證，直接分別鎖定致病突變及野生型位點所在染色體上下游的SNP基因型，然后再分析胚胎中SNP基因分型就能對胚胎致病性進行判斷。由于男性精子數(shù)量龐大，因此單倍型構建成功率高，但是操作較為繁瑣，分離的單精子有WGA失敗的可能。家系1為女方攜帶新發(fā)突變，我們對其胚胎進行相應位點一代測序以及上下游SNP位點的靶向測序，將一代測序結果顯示為攜帶致病變異的胚胎作為“先證者”，與夫妻雙方進行單倍型連鎖分析，之后分析和驗證剩余胚胎的基因型。這種利用胚胎結果互推的策略，需要送檢的樣本中有攜帶致病突變的胚胎，當一代測序均未檢測出異常胚胎時，需要進行第2次促排或者利用極體進行單倍型分析。但是極體活檢存在一定技術難度，極體容易出現(xiàn)碎裂、降解等情況，導致擴增失敗。同時并非所有卵母細胞都能受精發(fā)育到囊胚階段，因此，存在無效活檢的情況[19]。

綜上所述，本研究報道了3例新發(fā)突變的家系，包括c.10838T>C導致的常染色體顯性多囊腎、ANK1：c.3641delC突變導致的Ⅰ型球形紅細胞增多癥，以及NF2：c.861delC導致的Ⅱ型神經纖維瘤，后2個變異位點均為國際首次報道，豐富和拓展了相關疾病的遺傳圖譜。同時針對這3個家系我們采用了突變位點直接檢測加上2種不同的單倍體型分析策略，使3個家系均成功妊娠且通過了產前診斷檢測，其中1個已分娩未攜帶親本致病變異新生兒。實踐證明，利用單精子測序技術和胚胎互推策略可以實現(xiàn)攜帶新發(fā)突變的夫婦或是家族成員不全的家系PGT-M的檢測。