趙海靜，袁萍，黃佳，邱綺，張清學(xué)，王文軍

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心，廣州 510120)

在常規(guī)體外受精(IVF)過程中，原核觀察是目前評(píng)估受精與否的常用方法。通常在授精后16～20 h于倒置顯微鏡下觀察，正常受精卵有兩個(gè)清晰原核(2PN)，不具有2PN的均為異常受精。在光學(xué)顯微鏡下，異常受精的表現(xiàn)形式主要有：零原核(0PN)、單原核(1PN)和多原核(多PN)受精卵。IVF過程中約30%的卵母細(xì)胞表現(xiàn)為0PN受精，其原因可能是卵母細(xì)胞受精失敗，也可能是雌雄原核過早融合，導(dǎo)致原核消失[1]。如未觀察到原核的受精卵在后續(xù)發(fā)育中其卵裂速度及卵裂球形態(tài)與觀察到2PN的受精卵發(fā)育而來的胚胎沒有差異，稱之為0PN來源胚胎[1]。依據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)室指南，不建議移植0PN來源胚胎[2]。然而大量的細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示，部分0PN來源胚胎為二倍體胚胎，并且有4.4%～37.2%的0PN來源胚胎能夠發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚[3-5]。這些研究表明0PN來源胚胎仍具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，我中心對(duì)于0PN來源胚胎(本文中所提及的0PN來源胚胎特指0PN來源卵裂期胚胎)的處理是，如果第3天(D3)發(fā)育到4細(xì)胞及以上，則進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，如D5或D6形成評(píng)分3CC以上囊胚者視為可利用囊胚，進(jìn)行冷凍保存。

近期的一項(xiàng)薈萃分析顯示，無(wú)論是新鮮周期還是凍融周期，D5囊胚移植的種植率、臨床妊娠率及出生率均顯著優(yōu)于D6囊胚[6]。此外，僅對(duì)于整倍體囊胚移植的研究也表明，D5囊胚的移植結(jié)局顯著優(yōu)于D6囊胚[7-8]。這些結(jié)論提示我們，除了內(nèi)膜和染色體因素，還有其他重要因子影響著D6囊胚的潛能和發(fā)育。最近，滋養(yǎng)層細(xì)胞中線粒體DNA(mtDNA)數(shù)量被認(rèn)為是胚胎選擇的另一個(gè)潛在標(biāo)記物。Wu等[9]的研究結(jié)果表明，相同倍性D5囊胚中滋養(yǎng)層細(xì)胞mtDNA數(shù)量顯著多于D6囊胚(P<0.05)；在妊娠結(jié)局相同的情況下，移植的D5囊胚中滋養(yǎng)層細(xì)胞mtDNA數(shù)量也顯著多于移植的D6囊胚(P<0.05)，因此他們認(rèn)為mtDNA數(shù)量可能是影響囊胚發(fā)育速度的一個(gè)關(guān)鍵因素。有趣的是，發(fā)育速度快的D5囊胚中mtDNA數(shù)量顯著多于發(fā)育速度慢的D5囊胚(P<0.05)，D6囊胚中mtDNA數(shù)量亦呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)[10-11]，這進(jìn)一步體現(xiàn)了mtDNA數(shù)量在囊胚發(fā)育速度中的作用。但目前關(guān)于IVF中0PN來源囊胚的mtDNA數(shù)量與其發(fā)育速度之間的關(guān)系尚未見報(bào)導(dǎo)。

近年來，基于滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢的植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)廣泛用于胚胎非整倍體篩查。然而，滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢的局限性在于：(1)對(duì)胚胎的有創(chuàng)活檢可能會(huì)降低其發(fā)育潛能；(2)要求胚胎學(xué)家具有豐富經(jīng)驗(yàn)和嫻熟技術(shù)；(3)活檢操作過程復(fù)雜；(4)由于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)未經(jīng)過檢測(cè)，嵌合體容易導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果；(5)活檢的長(zhǎng)期生物安全性尚未評(píng)估[12-16]。而基于廢棄囊胚培養(yǎng)液的無(wú)創(chuàng)PGT也存在一些缺點(diǎn)，因?yàn)閺U棄囊胚培養(yǎng)液比囊腔液具有更高的母源污染(顆粒細(xì)胞)風(fēng)險(xiǎn)，尤其是囊胚階段的廢棄培養(yǎng)液中會(huì)檢測(cè)到更高水平的母源核DNA[17-18]。在滋養(yǎng)層細(xì)胞連接處進(jìn)行激光打孔以釋放囊腔液或使用注射針抽吸來獲取囊腔液[19-20]，并以囊腔液為樣本進(jìn)行mtDNA數(shù)量檢測(cè)的方法創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)易，還能有效避免母源顆粒細(xì)胞污染。因此，本研究首次以囊腔液為樣本，對(duì)IVF中0PN來源囊胚的mtDNA水平進(jìn)行檢測(cè)及綜合分析，并進(jìn)一步探索0PN來源囊胚中mtDNA水平與其發(fā)育速度之間的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2019年11月至2021年8月在本中心行常規(guī)IVF助孕治療的66對(duì)夫婦的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)D1原核觀察為0PN；(2)D5或D6囊胚評(píng)級(jí)為3CC級(jí)以上；(3)D5或D6囊胚留取囊腔液行整倍體檢測(cè)及mtDNA水平檢測(cè)；(4)男女雙方相關(guān)檢測(cè)及資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)D1的原核觀察為1PN、2PN、3PN或多PN；(2)D1卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察為MI、GV期、出現(xiàn)退化或空透明帶；(3)D5或D6囊胚評(píng)級(jí)為3CC級(jí)及以下。本研究中所有樣本的使用均進(jìn)行了充分地知情告知，并簽署知情同意書，且研究的開展獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批通過。

本研究共納入66個(gè)助孕治療周期中的109枚0PN來源囊胚。根據(jù)囊胚發(fā)育速度不同進(jìn)行分組，分為D5-0PN囊胚組(0PN來源胚胎在D5發(fā)育為可冷凍囊胚者，n=87)、D6-0PN囊胚組(0PN來源胚胎在D6發(fā)育為可冷凍囊胚者，n=22)。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)及取卵：入組患者采用長(zhǎng)方案或拮抗劑方案進(jìn)行促排卵。陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡生長(zhǎng)情況，當(dāng)B超監(jiān)測(cè)有1～2個(gè)卵泡直徑≥18 mm時(shí)給予肌肉注射HCG(珠海麗珠)10 000 U，注射后36～38 h在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。在體視顯微鏡下收集卵泡液中卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物，并置于G-IVF液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)。

2.精液收集及處理：取卵當(dāng)天男方以手淫法采集精液。待精液液化后，通過密度梯度離心及上游法處理，并調(diào)至統(tǒng)一的受精濃度(本中心所用濃度為0.3×106/ml)。

3.體外授精及原核觀察：卵母細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)4～6 h進(jìn)行IVF人工授精。授精16～20 h后進(jìn)行原核觀察，未見原核者記錄為0PN，可見兩個(gè)原核者為2PN。

4.胚胎培養(yǎng)及發(fā)育評(píng)估：D1拆除顆粒細(xì)胞后，將胚胎轉(zhuǎn)移至G1-plus(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液中，置于37℃、6%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。D3將胚胎轉(zhuǎn)移至G2-plus(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。D5和D6分別評(píng)估囊胚發(fā)育，依據(jù)Gardner和Schoolcraft的評(píng)分系統(tǒng)[21]，綜合囊胚擴(kuò)張狀態(tài)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育對(duì)囊胚質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)估。根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚發(fā)育分為6個(gè)時(shí)期：1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔體積小于胚胎總體積的1/2；2期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期：擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期：囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期：正在孵出，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期：孵出囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。處于3～6期的囊胚，還需對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)。其中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分級(jí)：A級(jí)：細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密；B級(jí)：細(xì)胞數(shù)目少，排列松散；C級(jí)：細(xì)胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞分級(jí)：A級(jí)：上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級(jí)：上皮細(xì)胞層由不多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C級(jí)：上皮細(xì)胞層由稀疏的細(xì)胞組成，細(xì)胞很少。本中心可利用囊胚的定義為：透明帶擴(kuò)張程度≥3且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)分為CC以上；優(yōu)質(zhì)囊胚的定義為：透明帶擴(kuò)張程度≥3且內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評(píng)分為BB及以上。

5.囊腔液收集：為了避免母源顆粒細(xì)胞污染，將D3的0PN來源胚胎轉(zhuǎn)移到不同的G2-plus液滴(預(yù)平衡)中潤(rùn)洗多次以除去透明帶上的顆粒細(xì)胞，再移入新的G2-plus液滴中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。D5或D6丟棄最初用于囊胚培養(yǎng)的液滴，將0PN來源囊胚轉(zhuǎn)移到不同的新鮮G2-plus液滴(預(yù)平衡)中潤(rùn)洗3次以再次完全除去透明帶上松散的顆粒細(xì)胞，隨后把0PN來源囊胚轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新鮮的15 μl G2-plus液滴中，用200 μs激光脈沖(LYKOS，Hamilton Thorne，美國(guó))在滋養(yǎng)層細(xì)胞連接處打孔以釋放囊腔液。激光打孔4～6 h后，將0PN來源囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍，收集囊腔液與G2-plus液滴的混合液裝入含有5 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)的無(wú)RNAse/DNAse小管中(江蘇億康基因)(具體收集方法參考Jiao等[19]的方法)，做好樣本標(biāo)記后置于-80℃冰箱保存，之后將冷凍樣本交由江蘇億康基因公司進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。使用未經(jīng)胚胎培養(yǎng)的G2-plus液滴作為陰性對(duì)照。

6.0PN來源囊胚染色體整倍體及mtDNA含量檢測(cè)：使用基于單細(xì)胞的多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(簡(jiǎn)稱MALBAC)對(duì)囊腔液樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(江蘇億康基因)。通過NextSeq550測(cè)序儀(Illumina，美國(guó))進(jìn)行第二代測(cè)序分析，用于全面染色體篩查。以常染色體擴(kuò)增拷貝為基礎(chǔ)，根據(jù)測(cè)序比對(duì)的序列數(shù)和區(qū)域數(shù)來分析單核基因組下線粒體的拷貝。線粒體含量以拷貝數(shù)/核基因組的形式進(jìn)行量化。對(duì)比對(duì)到線粒體基因組的測(cè)序讀取序列進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通過比對(duì)到常染色體的讀取序列計(jì)數(shù)進(jìn)行均一化，參考前期文獻(xiàn)[22]公式計(jì)算每個(gè)核基因組的線粒體拷貝數(shù)。

7.觀察指標(biāo)：記錄兩組患者的年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)生殖激素(FSH、LH、E2)水平、抗苗勒管激素(AMH)、基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)、Gn總量、獲卵數(shù)、精子正常形態(tài)率、頂體酶活性、囊胚整倍體率、優(yōu)質(zhì)囊胚率及囊腔液mtDNA數(shù)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料分析

比較D5-0PN囊胚組與D6-0PN囊胚組患者的基本信息和臨床資料，結(jié)果顯示D5-0PN囊胚組的女方年齡和Gn總量均顯著低于D6-0PN囊胚組(P<0.05)，D5-0PN囊胚組的男方年齡極顯著低于D6-0PN囊胚組(P<0.01)。兩組患者的不孕年限、BMI、基礎(chǔ)生殖激素(FSH、LH、E2)水平等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

二、D5-0PN囊胚與D6-0PN囊胚整倍體率、優(yōu)質(zhì)囊胚率及女方高齡率比較

D5-0PN囊胚和D6-0PN囊胚的整倍體率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；D5-0PN囊胚組的優(yōu)質(zhì)囊胚率極顯著高于D6-0PN囊胚組(P<0.01)。為了排除女方高齡對(duì)mtDNA水平的影響，參照之前的文獻(xiàn)[9，23]選擇40歲作為本研究中高齡女性的界限，比較兩組間來自高齡女性(≥40歲)的囊胚比例，結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者一般資料比較(-±s)

表2 D5-0PN囊胚與D6-0PN囊胚的整倍體率、優(yōu)質(zhì)囊胚率及高齡率比較(%)

三、不同分層下D5-0PN囊胚與D6-0PN囊胚mtDNA水平比較

比較整倍體囊胚與非整倍體囊胚、<40歲與≥40歲女性、優(yōu)質(zhì)囊胚與非優(yōu)質(zhì)囊胚中mtDNA的水平。D5-0PN囊胚中整倍體囊胚35枚，D6-0PN囊胚中整倍體囊胚11枚；在相同倍性(均為整倍體或均為非整倍體)情況下，D5-0PN囊胚的mtDNA水平均略高于D6-0PN囊胚，但尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)。D5-0PN囊胚中來源于<40歲女性者85枚，D6-0PN囊胚中來源于<40歲女性者20枚；在相同的囊胚發(fā)育時(shí)期，<40歲女性與≥40歲女性的0PN來源囊胚中mtDNA數(shù)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；但無(wú)論<40歲或≥40歲女性，其D5-0PN囊胚中mtDNA水平均略高于D6-0PN囊胚(P>0.05)。D5-0PN囊胚中優(yōu)質(zhì)囊胚(評(píng)級(jí)≥3BB)58枚，D6-0PN囊胚中優(yōu)質(zhì)囊胚6枚；在相同發(fā)育時(shí)期，優(yōu)質(zhì)0PN來源囊胚中mtDNA水平略高于非優(yōu)質(zhì)0PN來源囊胚，但尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)；且無(wú)論囊胚質(zhì)量如何，D5-0PN囊胚中mtDNA水平均略高于D6-0PN囊胚(P>0.05)(表3)。

表3 不同分層下D5-0PN囊胚與D6-0PN囊胚mtDNA水平比較(-±s)

討 論

0PN來源胚胎的臨床應(yīng)用價(jià)值一直存在爭(zhēng)議，因?yàn)闊o(wú)法確定0PN來源胚胎源自于正常受精或異常受精[24]。我們中心的常規(guī)策略是將0PN來源胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，若形成可利用囊胚則冷凍保存。在患者無(wú)2PN來源囊胚可移植的情況下，移植0PN來源囊胚以增加妊娠機(jī)會(huì)。考慮到0PN可能為異常受精，所以0PN來源胚胎的移植應(yīng)該盡可能地結(jié)合PGT[5]。目前廣泛應(yīng)用的PGT方法是對(duì)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢，然而這種方法存在活檢工作量大、耗費(fèi)成本較高、有創(chuàng)、取樣有偏倚(只檢測(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞而沒有檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán))等缺點(diǎn)[25]。廢棄囊胚培養(yǎng)液是無(wú)創(chuàng)PGT的首選材料，但具有較高的母源顆粒細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)，并且會(huì)檢測(cè)到更高水平的母源核DNA[17-18]。因此本研究選擇以囊腔液為樣本來分析0PN來源囊胚的染色體狀態(tài)。

滋養(yǎng)層細(xì)胞或培養(yǎng)液中mtDNA數(shù)量被認(rèn)為是胚胎選擇的另一個(gè)潛在標(biāo)記物[9，26]。早期胚胎中mtDNA數(shù)量的差異很可能起源于相應(yīng)的卵母細(xì)胞[22]。有研究表明，卵母細(xì)胞質(zhì)量與其所含有的mtDNA數(shù)量有著內(nèi)在聯(lián)系。卵巢功能下降或高齡女性的卵母細(xì)胞中mtDNA數(shù)量顯著低于卵巢功能正?；蚰贻p女性[27-29]。此外，未受精卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)也顯著低于受精卵母細(xì)胞[30-32]，退化卵母細(xì)胞則含有更少的mtDNA[32]。mtDNA數(shù)量較多的卵母細(xì)胞具有更高的發(fā)育潛能[33]，卵母細(xì)胞中線粒體儲(chǔ)備下降將引起植入前胚胎能量不足，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯[34]。充足的mtDNA水平提示卵母細(xì)胞質(zhì)量好，這不僅有益于成功受精，而且對(duì)后期的胚胎發(fā)育至關(guān)重要。在胚胎發(fā)育過程中，線粒體平均分布于每個(gè)卵裂球，但是在囊胚階段之前，線粒體總數(shù)相對(duì)穩(wěn)定[35]，同樣線粒體的活性也相對(duì)穩(wěn)定[34]。當(dāng)胚胎發(fā)育到囊胚階段時(shí)，mtDNA大量復(fù)制，表明線粒體已完成從靜止到激活的轉(zhuǎn)變[36-37]。因此，我們推測(cè)囊胚期mtDNA數(shù)量也許有著某種重要的意義，同時(shí)啟發(fā)我們關(guān)注囊腔液中mtDNA水平。

Ho等[38]研究認(rèn)為，從活檢的每個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞中獲得的mtDNA拷貝數(shù)與從整個(gè)胚胎獲得的mtDNA拷貝數(shù)相當(dāng)。這一研究證實(shí)了我們以囊腔液為樣本對(duì)0PN來源囊胚中mtDNA數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)及綜合分析的可行性。在Wu等[9]的報(bào)道中，調(diào)整了胚胎倍性、移植結(jié)局、女方年齡和囊胚質(zhì)量這些混雜因素后，D5囊胚中mtDNA數(shù)量仍顯著高于D6囊胚(P<0.05)。我們的研究結(jié)果表現(xiàn)出了相似的趨勢(shì)：在相同倍性、女方年齡、囊胚質(zhì)量的情況下，D5-0PN來源囊胚中mtDNA水平均有高于D6-0PN來源囊胚的趨勢(shì)，雖然尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

有研究表明，囊腔液中游離DNA含量與胚胎等級(jí)呈正相關(guān)[39]，而游離DNA由核DNA(nDNA)和mtDNA組成[40]。此外，Stigliani等[26]對(duì)人類胚胎的研究顯示，D3培養(yǎng)液中較高的mtDNA/nDNA比例提示較高的胚胎發(fā)育潛能。因此我們推測(cè)囊腔液中mtDNA含量可能與胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)。本研究中我們的數(shù)據(jù)顯示，D5-0PN來源囊胚中mtDNA水平略高于D6-0PN來源囊胚，同時(shí)D5-0PN囊胚組的優(yōu)質(zhì)囊胚率極顯著高于D6-0PN囊胚組(P<0.01)；無(wú)論D5或D6，優(yōu)質(zhì)0PN來源囊胚的mtDNA水平均略高于非優(yōu)質(zhì)0PN來源囊胚；這些結(jié)果與我們的推測(cè)相符。

Wu等[9]認(rèn)為影響囊胚發(fā)育速度的關(guān)鍵機(jī)制之一是卵母細(xì)胞中含有的最初mtDNA數(shù)量。那些含有充足mtDNA的卵母細(xì)胞將會(huì)“及時(shí)”形成囊胚，而那些mtDNA數(shù)量相對(duì)少的卵母細(xì)胞則需要額外時(shí)間以完成囊胚的發(fā)育過程。因此他們推測(cè)D6囊胚最初來源于mtDNA數(shù)量相對(duì)少的卵母細(xì)胞，由于能量不充足，所以需要額外1 d的時(shí)間去形成囊胚。這同樣適用于解釋0PN來源囊胚中mtDNA水平與其囊胚發(fā)育速度之間的關(guān)系。

綜上，本研究首次全面分析了囊腔液mtDNA水平與IVF中0PN來源囊胚發(fā)育速度之間的關(guān)系。綜合考慮胚胎倍性、女方年齡和囊胚質(zhì)量等因素后，D5-0PN來源囊胚中mtDNA水平有高于D6-0PN來源囊胚的趨勢(shì)，提示mtDNA數(shù)量可能是影響0PN來源囊胚發(fā)育速度的一個(gè)關(guān)鍵因素，較低的mtDNA水平可能與0PN來源囊胚發(fā)育延遲相關(guān)。本研究的局限性在于樣本量較少，將來需要開展更大樣本量的研究以驗(yàn)證本文的結(jié)論，從而更加深入地闡述0PN來源囊胚中mtDNA水平與其發(fā)育速度之間的關(guān)系。