伊萌 ，楊全軍，琚姝，劉建飛

1.上海三維生物技術(shù)有限公司，上海 200083；2.上海市第六人民醫(yī)院（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院）藥劑科，上海 200083

溶瘤病毒是臨床上的新型腫瘤療法，可精準靶向殺滅腫瘤細胞，早在1904年，有臨床試驗證明，白血病患者在用藥后，體內(nèi)白細胞的數(shù)量迅速減少。因此，病毒成為臨床研究的新研究方向，但由于病毒的種種限制因素，一直未獲得較大進展。直至20世紀90年代后，基因工程技術(shù)逐步成熟，才得以解決上述問題，使得各種具有腫瘤靶向性病毒或天然病毒受到改造后進入臨床試驗，取得了顯著效果[1]。本文就溶瘤病毒調(diào)控腫瘤微環(huán)境的相關(guān)機制及聯(lián)合療法敘述如下。

1 溶瘤病毒和腫瘤微環(huán)境

1.1 溶瘤病毒

溶瘤病毒主要通過改變細胞結(jié)構(gòu)來殺滅腫瘤細胞，P53和胸腺激酶的突變是腫瘤細胞中常見的基因突變，這些基因突變致使腫瘤細胞不僅不會自然凋亡，還會無限增殖。因此，腫瘤細胞中的這些特定突變被用作臨床研究的目標，對相應(yīng)的病毒進行定向修飾，可大量繁殖突變腫瘤細胞，使其殺滅腫瘤細胞。例如，臨床二期中的重組牛痘病毒，通過敲除其DNA中的胸腺激酶基因，可減少低分裂細胞，增加高分裂細胞，從而取得靶向性細胞殺滅能力。例如，P53基因突變或缺失是許多腫瘤中常見的現(xiàn)象，而P53是正常細胞的抗病毒反應(yīng)參與物之一，因此，該基因的突變正適合靶向性地大量復(fù)制溶瘤病毒。此外，在溶瘤病毒靶向殺傷腫瘤細胞的基礎(chǔ)上，還可搭配（interleukin-2,IL-2)/（interleukin-12,IL-12）和（Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等細胞促炎因子，可激活和浸潤免疫細胞，協(xié)同免疫系統(tǒng)共同清除腫瘤細胞[1]。

目前，國際臨床上全面批準上市的溶瘤病毒產(chǎn)品共有4款，包括拉脫維亞Sia Latima公司治療黑色素瘤和其他惡性腫瘤的Rigvir，上海三維生物公司治療鼻咽癌的安柯瑞，美國安進旗下Biovex治療黑色素瘤的 Imlygic（Talimogene laherparepvec）及日本第一三共公司治療膠質(zhì)細胞瘤的Delytact。其中：①Delytact（teserpaturev/G47Δ)是由第一三共和東京大學(xué)Tomoki Todo團隊共同開發(fā)的第三代溶瘤單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus-1，HSV-1），也是首例在人體中測試的第三代溶瘤性HSV-1。該溶瘤病毒產(chǎn)品具有三重突變，在第二代HSV-1 G207的基礎(chǔ)上加入了新的缺失突變（敲除了α47），不但強化了腫瘤細胞中的病毒選擇復(fù)制性和抗腫瘤活性，還保留了G207的用藥安全性。該藥一度被日本厚生勞動省（Ministry of Health, Labour and Welfare，MHLW）授予孤兒藥稱號和先驅(qū)療法認定。Delytact于2021年6月在批準在日本上市，并于8月以每劑143萬日元的價格定價上市。研究此藥的Tomoki Todo博士與東京大學(xué)，曾針對復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤患者，開展單臂2期臨床試驗的結(jié)果，試驗結(jié)果表明：Delytact可有效提高放療和化療的膠質(zhì)母細胞瘤殘留或復(fù)發(fā)患者的1年生存率，試驗結(jié)束后，原本接受了Delytact治療的患者中92%仍然存活，而通常情況下這些患者的1年生存率僅有15%左右。②安進旗下Biovex的Imlygic于2015年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準，專用于黑色素瘤治療，更是獲得FDA批準的首例產(chǎn)品，又于2016年在歐洲和加拿大獲批上市。③首例獲得國際臨床和市場認可的中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA），為2005年批準的三維生物的安柯瑞（H101），臨床上通過利用基因工程技術(shù)，刪減5型腺病毒而制作出的新型溶瘤病毒，經(jīng)多次臨床試驗后，該藥被批準可與化療藥物聯(lián)合使用治療晚期鼻咽癌。此外，還有多項研究顯示，H101在其他腫瘤的治療上，同樣有著不錯的效果［2-3］，例如：肝細胞癌、胰腺癌、非小細胞肺癌等。除了上述幾款獲取批準的溶瘤病毒產(chǎn)品外，還有許多其他溶瘤病毒產(chǎn)品正在進入臨床試驗階段。例如：2020年4月，復(fù)諾健生物自主研發(fā)的全球首個攜帶4個協(xié)同性免疫調(diào)控因子的新型溶瘤病毒產(chǎn)品VG161在澳洲完成了一期臨床的首例病人給藥。2020年5月，深圳亦諾微醫(yī)藥首個產(chǎn)品T3011（瘤內(nèi)注射），在中國和澳洲啟動臨床I期試驗，并獲得美國FDA臨床批準，將在世界知名的4家癌癥中心陸續(xù)開展。

1.2 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境是腫瘤形成和加重的關(guān)鍵條件，可在加強藥物耐藥性的同時引發(fā)免疫逃逸和惡性轉(zhuǎn)移，這對腫瘤的治療進展造成了極大的局限。腫瘤微環(huán)境由腫瘤基質(zhì)（由腫瘤相關(guān)成纖維細胞、免疫細胞和血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成）和細胞外基質(zhì)、氧氣水平及pH值共同構(gòu)成。一方面腫瘤細胞會分泌大量刺激生長因子、細胞因子和趨化因子，可對血管細胞、免疫細胞和基質(zhì)細胞形成有效招募，進而發(fā)生異變，形成器官樣組織[4]。另一方面，腫瘤微環(huán)境中可分泌肝細胞生長因子、纖維母細胞生長因子和趨化因子配體12等細胞生長因子，可在促進惡性腫瘤細胞成長的同時，擴大腫瘤微環(huán)境，造成惡性增殖。

2 溶瘤病毒對腫瘤微環(huán)境的調(diào)控機制

2.1 溶瘤病毒對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的調(diào)控

①溶瘤病毒激活免疫細胞。腫瘤在生長中，腫瘤細胞的衰亡會導(dǎo)致炎癥水平快速增高，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境受到免疫細胞浸潤，從而導(dǎo)致腫瘤細胞轉(zhuǎn)化成生長因子β、白介素10或上調(diào)（cluster of differentiation 47，CD47）/（programmed cell death-Ligand 1,PD-L1）等蛋白質(zhì)表達實現(xiàn)免疫逃逸。同時腫瘤細胞會逐漸促使免疫細胞發(fā)生異變，它向有利于腫瘤生長的方向分化，最終形成一個“永不愈合”的傷口。溶瘤病毒可以針對腫瘤細胞并釋放腫瘤相關(guān)抗原，誘發(fā)內(nèi)源性危險相關(guān)分子模式，以及病毒自身誘導(dǎo)的病原相關(guān)分子模式，為了激活免疫系統(tǒng)，也可以誘導(dǎo)腫瘤細胞表達大量抗原表位以激活腫瘤特異性免疫應(yīng)答[5-6]。而溶血病毒可促進免疫細胞的成熟和浸潤，增強免疫致死率的強特異性。例如，表達GM-CSF的溶瘤性呼吸腸病毒在腫瘤微環(huán)境中激活并促進抗原呈遞細胞的分化和成熟。也有報道稱，裝載溶瘤腺病毒的免疫共刺激分子（clusters of differentiation 40，CD40）、（tumor necrosis factor ligand superfamily member 4，OX40）等胚胎性基因，不僅可靶向殺傷腫瘤細胞，還能刺激分子配體表達，幫助腫瘤部位抗原提細胞，預(yù)警與辨識腫瘤細胞。以此提高免疫細胞靶向性殺傷腫瘤的效率，且聯(lián)合免疫檢查點抑制劑用藥，可取得良好協(xié)同治療效果[7-8]。此外。溶瘤病毒還能通過表達腫瘤壞死引子α、白介素1β和補體等炎癥趨化因子，內(nèi)皮細胞選擇素表達上調(diào)是T細胞侵襲的關(guān)鍵信號。

②溶瘤病毒抑制免疫抑制性細胞。在腫瘤微環(huán)境中，還有不少免疫抑制性細胞，例如，T細胞調(diào)控細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、髓源衍生抑制細胞等。這些細胞在免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中是活躍的，可分泌轉(zhuǎn)化生長因子β、白介素10等免疫抑制因子來抑制效應(yīng)T細胞和自然殺傷細胞及樹突細胞的分化成熟，它還能識別腫瘤抗原。溶血性病毒抑制這些細胞的活性，減少腫瘤微環(huán)境的免疫抑制。例如，有研究報道發(fā)現(xiàn)，小鼠黑素瘤或淋巴瘤模型，瘤細胞呼出的呼出病毒可通過內(nèi)吞作用進入骨髓間充質(zhì)干細胞，（toll-like receptor 3，TLR3）識別病毒的雙鏈裂解細胞,最終誘發(fā)virus-independent復(fù)制刪除MDSCs的免疫抑制功能,從而增強抗腫瘤免疫應(yīng)答[9]。在弱免疫原性小鼠4T1原位乳腺癌模型中，OH等人通過溶瘤腺病毒促進核心蛋白多糖的表達，抑制腫瘤微環(huán)境中Tregs的生長，導(dǎo)致DCN與胰島素樣生長受體結(jié)合，抑制激活（transforming growth factor-β,TGF-β）下游信號通路。這導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制降低。同時，還可協(xié)同表達白介素12來誘導(dǎo)T細胞和NK細胞活化，激活抗腫瘤免疫機制，這也是臨床發(fā)現(xiàn)的另一種增強免疫介導(dǎo)系統(tǒng)的抗腫瘤效應(yīng)，為溶瘤病毒調(diào)控腫瘤微環(huán)境提供了新的思路[11]。

2.2 溶瘤病毒清除腫瘤相關(guān)成纖維細胞

腫瘤相關(guān)成纖維細胞是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的必要條件，可以多途徑方式保護腫瘤細胞，同時還可加速腫瘤細胞增殖與轉(zhuǎn)移。例如，細胞粘附因子（cell adhesion factor，CAF）可上調(diào)肌球蛋白Ⅱ、α5β1整聯(lián)蛋白、血小板源性生長因子受體α的表達，這引發(fā)了收縮和牽引，導(dǎo)致纖維連接蛋白在CAF中的線性排列，從而促進了前列腺癌細胞的定向轉(zhuǎn)移。此外，CAF也保護腫瘤細胞不受T細胞的損傷，因為它不能很好地呈現(xiàn)抗原，同時還可調(diào)高程序性死亡配體2和人凋亡相關(guān)因子配體的表達，以此誘導(dǎo)CD8+T細胞凋亡，并不斷殺滅效應(yīng)T細胞，最終形成免疫機制[12]。

2.3 溶瘤病毒抑制血管生成

腫瘤的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與內(nèi)源性發(fā)生密切相關(guān)。腫瘤細胞分泌大量的血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和外泌體小分子，或刺激形成異常血管。這些血管在為腫瘤細胞供給能量的同時，也會快速地選擇性分化，侵襲性和轉(zhuǎn)移性得到明顯增強，同時還可對免疫細胞的腫瘤破壞性產(chǎn)生相應(yīng)的抵抗性能[13-14]。然而，溶血性病毒直接殺傷腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致血管生成因子表達降低，如：在BMS乳腺癌分級模型中，表達腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白的溶瘤腺病毒可增強對腫瘤細胞的毒性，抑制VEGF和MMP-14的活性，抑制腫瘤血管生成，防止腫瘤細胞發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移。此外，有報道稱，在成髓細胞瘤小鼠模型中，麻疹溶瘤病毒可抑制血管細胞生長，阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移，提高小鼠的存活率[15]。

3 溶瘤病毒聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療

免疫檢查點機制是人體免疫系統(tǒng)的自我保護機制，可避免免疫系統(tǒng)誤殺正常細胞中的重要信號節(jié)點。當(dāng)機體處于健康狀態(tài)時，機體內(nèi)大多只有一個免疫檢查點。然而，在許多惡性腫瘤發(fā)生后，腫瘤細胞中免疫檢查點明顯增多，來混淆免疫系統(tǒng)的檢查機制，導(dǎo)致腫瘤細胞未受到免疫系統(tǒng)節(jié)制，從而大量繁殖。在當(dāng)下的免疫檢查點蛋白質(zhì)研究中，多以PD-L1/PD-1和CRLA-4作為靶點的單克隆抗體藥物為主，在許多案例中取得不錯的用藥效果[16]。此外，淋巴細胞激活因子3、T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白3的抑制劑均已進入臨床試驗。免疫檢查點抑制劑治療雖然屢有效果，但因為腫瘤微環(huán)境的抑制和阻斷機制以及腫瘤細胞的異質(zhì)性和免疫相關(guān)不良反應(yīng)等客觀因素，所以該藥在治療中仍具有一定局限性。例如，在淋巴細胞浸潤少或PD-L1表達水平較低的許多腫瘤疾病中，采用PD1單抗藥物治療，普遍缺乏理想的效果。同時，許多動物研究表明，聯(lián)合使用溶瘤病毒和免疫檢查點抑制劑，可提高總體好轉(zhuǎn)率，因此，臨床上在癌癥治療中，普遍提倡以溶瘤病毒和免疫檢查點抑制劑聯(lián)合治療為主[17-18]。

①溶瘤病毒和PD1/PD-L1抑制劑的聯(lián)合治療。PD1/PD-L1抑制劑是激活抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，也被用于抑制微腫瘤環(huán)境形成，但該療法效果不甚理想，而聯(lián)合溶瘤病毒共同治療可使腫瘤微環(huán)境中不斷吸收T細胞，刺激免疫細胞活化，表達免疫檢查點拮抗抗體，以此加強免疫檢查點抑制劑效果[19-20]。例如，在PD-L1低表達或不表達的結(jié)腸癌小鼠模型中，溶瘤痘苗病毒聯(lián)合PD-L1抑制劑治療可誘導(dǎo)腫瘤中PD-L1的增加。同時，溶瘤病毒可以誘導(dǎo)腫瘤組織中更多的免疫細胞入侵。聯(lián)合PDL1抑制劑治療，腫瘤清除率一般較高。它可為更多腫瘤疾病的治療提供可行性方案。例如，在人類黑色素瘤免疫缺陷小鼠模型中，溶瘤腺病毒在預(yù)移植人骨髓造血干細胞后，幫助小鼠重建免疫系統(tǒng)，聯(lián)合PD-1抑制劑可發(fā)揮重要協(xié)同機制，最大程度上縮減腫瘤體積，提升抗腫瘤效果。臨床實驗中，如轉(zhuǎn)移性黑色素瘤已經(jīng)到達Ⅲ～Ⅳ期，無法切除則可采用T-VEC和PD-1抑制劑聯(lián)合治療，可獲得90%左右的總體緩解率[21-22]。

②溶瘤病毒和CTLA-4抑制劑聯(lián)合治療。除卻PD1/PD-L1抑制劑外，聯(lián)合溶瘤病毒和CTLA-4抑制劑在臨床治療腫瘤疾病也頗有效果，例如在黑色素瘤二期無法切除的臨床實驗中，給予T-VEC和Ipilimumab聯(lián)合治療，患者的總體緩解率高出單一用藥的患者兩倍左右。

綜上所述，在腫瘤疾病治療中，靈活地運用溶瘤病毒調(diào)控腫瘤微環(huán)境，使其產(chǎn)生免疫殺傷機制，再配合免疫檢查點抑制劑藥物，能夠顯著提升抗腫瘤效果，具有可觀的發(fā)展前景。