吳曉芳,陳 凱,張德坤
(1 中國礦業(yè)大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院,江蘇 徐州 221116;2 中國礦業(yè)大學(xué) 材料與物理學(xué)院,江蘇 徐州 221116)
近年來因外傷、炎癥或退變等導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷在臨床上十分常見,并伴有關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)畸形、甚至關(guān)節(jié)功能障礙等明顯癥狀,嚴(yán)重影響著病人的健康狀況和生活質(zhì)量[1-2]。由于關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、淋巴管和神經(jīng)支配,一旦發(fā)生磨損或創(chuàng)傷,很難恢復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。此外,軟骨缺損和損傷可引起創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎(OA),增加了軟骨損傷愈合的難度[3-5]。因此,關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)一直是臨床的重大難題之一。
傳統(tǒng)治療方法如微骨折、鑲嵌成形術(shù)、自體軟骨細(xì)胞移植和同種異體骨/軟骨移植等可以減輕疼痛并改善關(guān)節(jié)功能,然而,這些方法產(chǎn)生的新生軟骨通常構(gòu)成I型膠原,缺乏Ⅱ型膠原的透明軟骨特性,遠(yuǎn)期臨床效果欠佳[6-8]。人工關(guān)節(jié)置換則存在假體磨損、腐蝕及松動(dòng)等問題,且適用人群有限[9-12]。因此目前針對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)方法都只是暫時(shí)緩解癥狀,而不是治愈,沒有再生功能軟骨。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)進(jìn)入了一個(gè)新高度[13-15],該技術(shù)主要包括種子細(xì)胞、支架材料及細(xì)胞生長因子3個(gè)要素,其中支架材料用來模擬細(xì)胞外基質(zhì),為缺損部位細(xì)胞的生長、增殖和分化提供適宜的微環(huán)境,利用細(xì)胞和生物分子之間相互作用的天然生物過程促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)再生[16-18]。因此,組織工程的成功很大程度上依賴于支架在結(jié)構(gòu)和成分方面模仿相應(yīng)組織的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的程度。
在所有的生物材料中,水凝膠因具有與細(xì)胞外基質(zhì)相似的特性受到了廣泛的關(guān)注,特別是作為軟骨和骨組織工程的支架材料[19-21]。縱觀近年來的研究,將可降解水凝膠用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)再生的研究主要集中在三個(gè)方面:一是利用可注射水凝膠進(jìn)行原位修復(fù),將具有生物降解性的可注射水凝膠包裹藥物/細(xì)胞注入關(guān)節(jié)軟骨缺損部位進(jìn)行原位成型,這種微創(chuàng)手術(shù)造成的疤痕較小,可減少患者的疼痛[22-25];二是通過傳統(tǒng)方法制備組織工程支架進(jìn)行植入修復(fù),即采用模具澆鑄、顆粒浸出、冷凍干燥、氣體發(fā)泡等傳統(tǒng)工藝制造三維多孔的組織工程支架,植入關(guān)節(jié)軟骨缺損部位以模擬實(shí)際體內(nèi)高度多孔且孔隙連通的微環(huán)境,為細(xì)胞或生長因子的結(jié)合提供合適的機(jī)械支撐和理化刺激[26-27];三是直接3D打印關(guān)節(jié)軟骨支架進(jìn)行植入修復(fù),即采用3D打印技術(shù)將生物材料、細(xì)胞和活性生物分子逐層沉積,制備用于軟骨組織工程的功能仿生支架,從而實(shí)現(xiàn)缺損軟骨的功能性再生和修復(fù)[28-30]。本文系統(tǒng)概述了近年來用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)再生的可注射水凝膠以及傳統(tǒng)方法制造的三維多孔支架,重點(diǎn)歸納了3D打印的軟骨支架和骨/軟骨一體化支架在軟骨組織工程領(lǐng)域的最新進(jìn)展,并將多材料、多結(jié)構(gòu)、多誘導(dǎo)的高仿生梯度支架作為未來軟骨功能再生和修復(fù)的研究方向。
近年來,可注射水凝膠作為軟骨修復(fù)的候選材料受到了廣泛的關(guān)注。其宗旨是將負(fù)載有細(xì)胞或生長因子的水凝膠前驅(qū)液直接注入關(guān)節(jié)軟骨的缺損部位進(jìn)行原位填充,然后在短時(shí)間內(nèi)快速聚合形成固體凝膠(圖1)[31]。這種策略的優(yōu)勢(shì)在于可以通過微創(chuàng)手術(shù)很容易地填充不規(guī)則形狀的缺損,不僅能夠與缺損部位融合良好,而且細(xì)胞和生物活性因子可以均勻地結(jié)合在水凝膠中。
圖1 可注射水凝膠用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)示意圖[31]Fig.1 Schematic diagram of injectable hydrogel for articular cartilage repair[31]
糖胺聚糖(GAG)和膠原蛋白是關(guān)節(jié)軟骨的主要細(xì)胞外基質(zhì)成分,其在支持軟骨形成和調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了在組成上模擬天然軟骨組織,各種各樣的多糖類生物材料和蛋白類生物材料已被用來制備可注射水凝膠,其中多糖類生物材料主要包括殼聚糖、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸、肝素、硫酸軟骨素等,蛋白類生物材料主要包括明膠(GT)、膠原蛋白、纖維蛋白、彈性蛋白等[32]。由于單一組分水凝膠材料在性能上往往存在不足,因此一些研究者將多糖類和蛋白類生物材料組合使用以改善可注射水凝膠的性能。例如,Hwang等[33]采用海藻酸鹽顆粒和纖維蛋白基質(zhì)開發(fā)了一種新的可注射混合水凝膠體系,將海藻酸鹽顆粒引入到纖維蛋白基質(zhì)中,增強(qiáng)了細(xì)胞的流動(dòng)性和增殖、體積保持和血管化,從而使該混合水凝膠體系成為軟骨組織工程應(yīng)用的理想材料。Park和Lee[34]制備了一種可注射、可生物降解的氧化藻酸鹽/透明質(zhì)酸水凝膠,在小鼠體內(nèi)注射含有原代軟骨細(xì)胞的水凝膠后6周,可觀察到有效的軟骨再生。Balakrishnan等[35]在硼砂存在條件下通過自交聯(lián)高碘酸鹽、氧化藻酸鹽和明膠生成了一種無需有毒交聯(lián)劑、能夠快速凝膠的可注射水凝膠。這種自附水凝膠與軟骨組織結(jié)合良好,并能促進(jìn)軟骨細(xì)胞向基質(zhì)內(nèi)部遷移,是一種很有前途的可注射水凝膠材料。Kontturi等[36]將軟骨細(xì)胞和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)封裝到Ⅱ型膠原/透明質(zhì)酸混合物中形成了一種可原位注射的力學(xué)性能良好而穩(wěn)定的水凝膠,通過對(duì)體外培養(yǎng)7天期間細(xì)胞活力、增殖、形態(tài)、糖胺聚糖的產(chǎn)生和基因表達(dá)的研究,表明該復(fù)合水凝膠能維持軟骨細(xì)胞的活性和特性。
為了進(jìn)一步提高可注射水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性,一些研究者將微球粒子(如明膠[37]、海藻酸鈉(SA)[38]、殼聚糖微球[39])、納米顆粒(如羥基磷灰石[40]、金屬粒子[41]、黏土[42])和納米纖維(如白蛋白[43]、靜電紡絲PCL[44]、二氧化硅納米纖維[45])等填充劑加入作為可注射水凝膠材料用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)[46]。Liao等[47]開發(fā)了一種新型可注射三維海藻酸鹽水凝膠,負(fù)載可生物降解的多孔聚(己內(nèi)酯-乙二醇-己內(nèi)酯)(PCEC)微球作為葡萄糖酸鈣的容器,隨著葡萄糖酸鈣的釋放,使得軟骨細(xì)胞/海藻酸鹽懸浮液和多孔微球轉(zhuǎn)化為凝膠,可有效模仿細(xì)胞外基質(zhì)的架構(gòu),結(jié)果表明,該復(fù)合水凝膠具有孔隙連通、壓縮模量高、成型性好、降解性適中等優(yōu)良特性,是一種適合軟骨組織工程的基質(zhì)。Fan等[48]通過乳液交聯(lián)的方法制備了負(fù)載牛血清白蛋白(BSA)的殼聚糖微球(CMs),并將其嵌入水溶性羧甲基殼聚糖(CMC)和氧化硫酸軟骨素(OCS)的水凝膠中,生成復(fù)合CMs/凝膠支架。結(jié)果表明,植入CMs可以顯著改善凝膠支架的力學(xué)性能和生物活性,且比未添加CMs的對(duì)照凝膠支架表現(xiàn)出更低的溶脹率和更慢的降解速度。Adedoyin等[49]利用功能性雜化無機(jī)氧化鐵(Fe3O4)納米粒子與聚異丙基丙烯酰胺(pNiPAAm)、可降解聚酰胺(PAMAMs)高分子共價(jià)結(jié)合得到了一種可注射納米復(fù)合水凝膠,不僅縮短了凝膠化時(shí)間,而且具有響應(yīng)控制特性。Eslahi等[50]提出一種基于礦物納米黏土(laponite)、纖維蛋白(keratin)、三嵌段共聚物(pluronic)和殼聚糖生物聚合物的新型可注射熱響應(yīng)水凝膠用于關(guān)節(jié)軟骨組織工程,加入6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)laponite 可使其黏彈性能提高6倍,同時(shí)觀察到凝膠化溫度降低,孔徑顯著減小,溶脹率和降解性也隨之降低。Rampichová等[51]將可注射的膠原/透明質(zhì)酸/纖維蛋白復(fù)合水凝膠與PCL納米纖維混合開發(fā)了一種新型功能化水凝膠,觀察到PCL納米纖維的加入減緩了水凝膠的降解,提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性,實(shí)現(xiàn)軟骨修復(fù)所需的降解時(shí)間。這些研究表明加入合適的填充劑不僅會(huì)顯著提高可注射水凝膠的力學(xué)性能,還會(huì)改變水凝膠的其他性能[52],如凝膠時(shí)間/溫度、可注射性、內(nèi)部孔徑、降解率、溶脹率和生物學(xué)性能,這主要得益于納米微粒優(yōu)異的理化性質(zhì)(納米微米級(jí)的外形尺寸、增大的比表面積和粗糙度),增加了與聚合物鏈之間的物理或共價(jià)作用,提高了可注射水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和黏彈性能,同時(shí)由于納米粒子的嵌入能有效改善水凝膠網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)特性和孔隙尺寸,因此能夠在一定程度上增加細(xì)胞附著位點(diǎn),進(jìn)而刺激細(xì)胞生長和引導(dǎo)組織再生。
盡管可注射水凝膠具有類似天然ECM的理化性質(zhì),并具有良好的生物相容性,有助于促進(jìn)軟骨組織再生,但制備可注射水凝膠原位成型的化學(xué)交聯(lián)方法卻限制了它的廣泛應(yīng)用??勺⑸渌z的化學(xué)交聯(lián)方法主要包括光聚合、酶交聯(lián)、click化學(xué)反應(yīng)、希夫堿反應(yīng)、Michael加成反應(yīng)等,其中光聚合通常需要一種光敏劑和長時(shí)間的照射,酶介導(dǎo)的水凝膠交聯(lián)體系種類有限,click化學(xué)反應(yīng)和希夫堿反應(yīng)則需要有毒的交聯(lián)劑(如戊二醛、碳二亞胺、genipin、己二酰二肼等),Michael加成反應(yīng)的凝膠化過程緩慢[53]。這些化學(xué)交聯(lián)方法不僅會(huì)對(duì)體內(nèi)造成一定的毒性,而且較長的交聯(lián)時(shí)間不能滿足臨床應(yīng)用所需的凝膠化速率,因此成為可注射水凝膠形成原位軟骨支架發(fā)展的主要障礙。
組織工程已成為修復(fù)軟骨組織缺損的一種有前途的策略。一般來說,工程化組織由支架、細(xì)胞和必要的生長因子組成。理想的組織工程支架不僅要有良好的生物相容性和適宜的生物可降解性,還應(yīng)具有貫通的多孔結(jié)構(gòu)和適宜的孔隙率,以促進(jìn)細(xì)胞的滲透和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。為了生產(chǎn)出具有理想孔徑范圍和孔徑形態(tài)的工程支架來滿足軟骨組織再生的需求,各種支架制造技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來。目前傳統(tǒng)的制造工藝主要包括顆粒浸出、氣體發(fā)泡、熱致相分離和冷凍干燥等[54]。
顆粒浸出法已被廣泛用于軟骨組織工程制造多孔支架,它主要是將固體致孔劑(如氯化鈉晶體、蔗糖晶體、明膠顆粒等)加入聚合物溶液中共混后倒入模具,待聚合物溶液固化后,通過諸如水或乙醇等溶劑的溶解濾掉致孔劑材料,從而形成一種多孔結(jié)構(gòu)聚合物支架[55-57]。Kanimozhi等[58]為了改善殼聚糖和PVA聚合物的性能,采用鹽浸法以NaCl晶體為致孔劑制備了多孔雜化支架。這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單,適用于多種聚合物材料,而且支架的孔徑尺寸和孔隙率可以通過改變致孔劑顆粒的大小和數(shù)量進(jìn)行調(diào)控。然而,這種方法制備的支架厚度較小,表面易形成致密的皮質(zhì)層,影響支架的孔隙連通性。
氣體發(fā)泡法是采用氣體作為發(fā)泡劑,首先在高壓下將CO2等氣體施加于壓鑄或澆鑄制備的固體盤狀聚合物,待CO2飽和后降低壓力,使溶解的CO2由于熱力學(xué)不穩(wěn)定性形成氣體核生長,從而在聚合物基質(zhì)中產(chǎn)生孔洞[59-60]。Nam等利用碳酸氫銨作為高效的氣體發(fā)泡劑和顆粒致孔鹽,制備了用于組織再生的高開孔可生物降解聚乳酸支架[59]。這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是無須使用苛刻的化學(xué)溶劑,從而消除了制造過程的浸出步驟,減少了支架的制造時(shí)間。然而,通過氣體形成的孔洞多數(shù)為封閉的孔結(jié)構(gòu),無法保證孔隙的連通性和控制孔徑的大小。
熱致相分離法是首先將聚合物溶解在高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的溶劑中形成均相溶液,然后放入模具中快速冷卻直到溶劑凍結(jié),使得體系形成以聚合物為連續(xù)相、溶劑為分散相的相分離結(jié)構(gòu),最后再選用適當(dāng)?shù)膿]發(fā)性試劑把溶劑萃取出來,從而獲得具有多孔結(jié)構(gòu)的聚合物支架[61-63]。Sultana等[64]采用熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)制備了用于骨組織工程的三維多孔殼聚糖-羥基磷灰石復(fù)合支架。這種方法不需要額外的浸出步驟,但需要添加的有機(jī)溶劑(如甲醇、丙酮、環(huán)己烷等)可能會(huì)產(chǎn)生毒性,從而影響支架材料的細(xì)胞相容性。
冷凍干燥法的原理是利用冰的真空升華現(xiàn)象,即通過冷凍降溫的方法使聚合物溶液中的水凍結(jié)成冰,然后在真空條件下使冰直接干燥升華變成氣相,從而導(dǎo)致孔隙的形成[65-66]。這種方法制備的支架孔徑和孔隙率在很大程度上取決于水與聚合物溶液的比例,而且通過改變冷凍溫度可以調(diào)控支架的孔隙結(jié)構(gòu)。Sultana等[67]將納米羥基磷灰石(HA)粒子與聚羥基丁酸-共戊酸(PHBV)結(jié)合,采用冷凍干燥技術(shù)制備出具有相互連通多孔結(jié)構(gòu)的HA/PHBV支架。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是既不需添加有毒的化學(xué)溶劑,也不需要額外的瀝濾清洗步驟,但這種直接冷凍干燥方法制備的支架孔徑較小,且冷凍干燥過程難以控制,會(huì)出現(xiàn)非均勻凍結(jié)現(xiàn)象。表1[55-57,59-63,65-66]列舉出了幾種傳統(tǒng)工藝方法制造關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架的優(yōu)缺點(diǎn)。
表1 傳統(tǒng)工藝方法制造關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架的優(yōu)缺點(diǎn)[55-57,59-63,65-66]Table 1 Advantages and disadvantages of traditional technologies for fabricating articular cartilage tissue engineering scaffolds[55-57,59-63,65-66]
基于各種傳統(tǒng)工藝單一制造方法的局限性,研究者將兩種或三種方法結(jié)合起來制造多孔組織工程支架[68]。Ribeiro等[69]結(jié)合顆粒浸出和冷凍干燥的方法將辣根過氧化物酶(HRP)介導(dǎo)交聯(lián)的高濃度絲素水溶液(16%)制備成新型多孔的絲素蛋白支架,且具有較高的孔隙率(89.3±0.6)%和連通率(95.9±0.8)%。Xin等[70]將超臨界CO2發(fā)泡與顆粒浸出方法相結(jié)合,采用三種不同尺度的NaCl顆粒(100~250 μm,<75 μm,<10 μm)分別作為致孔劑,制備出了具有大孔(100~300 μm)和微孔(<10 μm)雙峰孔結(jié)構(gòu)的PLGA支架,且隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加(60%~90%),支架的孔隙率從(68.4±0.6)%提升到(88.7±0.4)%。Lei等[71]采用熱致相分離和冷凍干燥結(jié)合的方法,將二氧化硅相在分子水平上均勻分布在明膠納米纖維中,成功制備出納米纖維明膠-硅雜化支架,并獲得了優(yōu)異的力學(xué)性能和生物性能。Yang等[72]采用熱致相分離和顆粒浸出工藝相結(jié)合的方法,以蔗糖顆粒作為致孔劑制備出了孔徑范圍約為20~400 μm的多孔聚乳酸羥基乙酸(PLGA)支架。Salerno等[73]選用生物相容性和可生物降解性的明膠顆粒作為固體致孔劑,基于熱致相分離、顆粒浸出和超臨界CO2發(fā)泡相結(jié)合的方法,制造出具有大孔互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)和納米級(jí)纖維孔壁結(jié)構(gòu)的PLA支架,該支架的總孔隙率高于95%,平均孔徑為(171±62)~(440±60) μm。相比于兩種工藝結(jié)合的制備方法,由三種工藝結(jié)合的制備方法比兩種工藝結(jié)合的制備方法顯著提高了軟骨支架的孔隙率,這是由于三種工藝相結(jié)合能夠更充分發(fā)揮各種工藝的優(yōu)勢(shì),在最大程度上彌補(bǔ)單工藝方法帶來的不足,從而制備出具有微米級(jí)大孔和納米級(jí)小孔相互連通的多級(jí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。眾所周知,較高的孔隙率和孔間連通性對(duì)組織工程支架來說至關(guān)重要,因?yàn)檩^高的孔隙率可以增加支架的比表面積,有利于細(xì)胞在支架上的大量黏附,而相互的孔間連通性則有利于水分和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸,為細(xì)胞的代謝生長和增殖分化提供三維的微環(huán)境。由此分析可知,三種工藝相結(jié)合制備的多孔支架更接近理想的軟骨組織工程支架。然而,盡管利用傳統(tǒng)工藝相結(jié)合的方法能夠制造出具有精確孔結(jié)構(gòu)和高孔隙率的軟骨支架,但在一定程度上還存在著內(nèi)部孔洞分布不均的問題,因此距離理想情況下軟骨組織工程支架的內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)還有很大的挑戰(zhàn)。
一個(gè)理想的關(guān)節(jié)軟骨支架需要具備大量的結(jié)構(gòu)特征來滿足細(xì)胞增殖和營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散,如高孔隙率、足夠的孔徑和孔間連通性[74-77]。另外,還需要具有一定的力學(xué)特性來提供最初的機(jī)械穩(wěn)定性和支持細(xì)胞活動(dòng)的三維環(huán)境[78-80]。然而,傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)在制造支架時(shí)面臨著諸多限制,包括精度和分辨率較低,無法控制幾何形狀和內(nèi)部孔隙等。近年來,先進(jìn)的3D生物打印技術(shù)的出現(xiàn)為軟骨組織工程帶來了革命性的變革,該技術(shù)能夠通過簡潔的程序打印出高精度、高效率、可定制的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。
3D生物打印技術(shù)的關(guān)鍵是生物墨水的選擇,良好的生物墨水不僅應(yīng)具有一定的力學(xué)性能以滿足組織修復(fù)的要求,而且還應(yīng)具有良好的生物相容性以支持細(xì)胞的黏附與增殖。因此,一些天然聚合物材料如明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、絲素蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽和瓊脂糖等由于其良好的生物相容性而被廣泛用于3D打印關(guān)節(jié)軟骨支架。例如,Xia等[81]在明膠和透明質(zhì)酸混合墨水中加入甲基丙烯酸酐和光引發(fā)劑,通過光固化3D打印和凍干技術(shù)成功制備出具有精確外觀形狀、孔隙結(jié)構(gòu)和良好降解率的多孔支架,并將該支架與軟骨細(xì)胞結(jié)合,在體內(nèi)外均成功再生出具有典型腔隙結(jié)構(gòu)和軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的成熟軟骨。Ni等[82]開發(fā)了一種由SF和羥丙基甲基纖維素(HPMC)組成的雙網(wǎng)絡(luò)(DN)水凝膠墨水,并負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)3D打印出雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠支架,研究結(jié)果表明該支架可以保證組織工程中足夠的營養(yǎng)供應(yīng)和巨大的生化支持能力。Yang等[83]采用Ⅰ型膠原(COL)或瓊脂糖(AG)與SA混合作為3D生物打印墨水。結(jié)果表明,與單獨(dú)使用SA相比,SA/COL和SA/AG組的機(jī)械強(qiáng)度均有提高,且三種支架中SA/COL較其他兩組更明顯促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖,增強(qiáng)軟骨特異性基因的表達(dá)。Wu等[84]將納米羥基磷灰石(n-HA)添加到SF和GT混合溶液中作為3D打印墨水,不僅提高了復(fù)合墨水的打印精度,且增強(qiáng)了SF/GT/n-HA復(fù)合支架的彈性模量。由于天然聚合物材料作為生物墨水具有較弱的力學(xué)性能,因此一些由合成聚合物材料組成的生物墨水也被應(yīng)用到3D打印組織工程支架的領(lǐng)域,包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羥基乙醇酸(PLGA)、β-磷酸三鈣(β-TCP)和羥基磷灰石(HA)等。例如,Jiao等[85]采用3D打印技術(shù)制備了HA-聚己內(nèi)酯(PCL)支架,并探討了其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能,結(jié)果表明納米HA/PCL支架具有相互連通且均勻分布的三維多孔結(jié)構(gòu),其抗拉強(qiáng)度和抗彎強(qiáng)度分別高達(dá)23.29 MPa和21.39 MPa。相比而言,這種由合成聚合物材料作為生物墨水3D打印的組織工程支架具有機(jī)械強(qiáng)度高的優(yōu)點(diǎn),在力學(xué)性能方面更接近于天然的原生組織。然而,盡管3D打印軟骨支架在組織工程領(lǐng)域取得了重大的進(jìn)展,但這些3D打印的軟骨支架在組成和結(jié)構(gòu)上都是單層均質(zhì)同性的,不能實(shí)現(xiàn)原始軟骨結(jié)構(gòu)的理想再生,因?yàn)樗鼈冊(cè)谥亟ㄌ烊卉浌墙M織中各向異性組成和結(jié)構(gòu)方面的能力有限。
考慮到天然關(guān)節(jié)軟骨是由淺表層、中間層和深化層組成的特殊層次結(jié)構(gòu)[86],為了充分仿生天然軟骨組織梯度的組成成分、機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞分布,最近研究人員專注于對(duì)多層支架進(jìn)行研究,以模擬天然軟骨的復(fù)雜分層結(jié)構(gòu)和理化特性。Klein等[87]提出區(qū)域特性打印構(gòu)造的概念,即在逐層3D打印過程中,將幾種類型的活細(xì)胞、生長因子和生物材料整合到不同層中,從而形成具有多層區(qū)域特性的組織工程結(jié)構(gòu),通過產(chǎn)生具有帶狀變化的軟骨外基質(zhì)來改善對(duì)軟骨組織的修復(fù),這為3D打印提供了一種重現(xiàn)天然軟骨梯度特征的機(jī)制。Xu等[88]以聚乳酸-乙醇酸(PLGA)-細(xì)胞外基質(zhì)作為生物墨水,采用3D打印技術(shù)制備了具有三層梯度結(jié)構(gòu)的軟骨支架,并通過定向冷凍技術(shù)構(gòu)建了軟骨支架的微觀孔結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明所制備的支架具有仿生的、梯度的微結(jié)構(gòu)取向和孔隙尺寸,對(duì)軟骨修復(fù)具有重要意義。Zhou等[89]以不同比例的GelMA和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)作為打印墨水,采用立體光刻3D打印機(jī)制備出三層梯度支架,然后涂上賴氨酸功能化納米管(RNTK)進(jìn)行生物激發(fā),結(jié)果表明三層梯度軟骨支架GelMA-PEGDA-RNTK與對(duì)照組GelMA-PEGDA支架相比能更好地促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化。相比而言,這種三層梯度仿生軟骨支架比單層均質(zhì)同性軟骨支架在軟骨組織修復(fù)方面表現(xiàn)出了更優(yōu)的效果。分析原因,主要是由于三層梯度軟骨支架在結(jié)構(gòu)上模仿了天然軟骨從表層區(qū)、中間區(qū)到深化區(qū)這三層復(fù)雜的組織構(gòu)造,這些梯度分層結(jié)構(gòu)不僅有利于增加比表面積,促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖,而且有利于支架植入后與周圍原生組織的整合,從而促進(jìn)細(xì)胞在結(jié)構(gòu)體和天然組織之間的遷移。因此,三層梯度軟骨支架在未來的軟骨修復(fù)和再生方面具有更大的應(yīng)用前景。
一般情況下,輕度的軟骨缺損只涉及兩層以上軟骨或全厚度軟骨的損傷,但隨著缺損程度的增加,會(huì)粘連延伸至下方的軟骨下骨層,從而導(dǎo)致骨/軟骨缺損。因此,迫切需要骨/軟骨一體化支架以實(shí)現(xiàn)軟骨和軟骨下骨的同時(shí)修復(fù)和再生。Gong等[90]采用數(shù)字光處理技術(shù)(DLP)打印了載有白細(xì)胞介素(IL-4)的GelMA支架作為軟骨層,并用熔融沉積成型技術(shù)(FDM)打印了多孔的聚己內(nèi)酯和羥基磷灰石(PCL-HA)支架作為軟骨下骨層,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,該支架的下層能促進(jìn)成骨的分化和再生,上層負(fù)載的IL-4可緩解炎癥,因此是一種既具有仿生性能又具有抗炎活性的雙層支架。Gao等[91]開發(fā)了一種可生物降解的高強(qiáng)度超分子聚合物增強(qiáng)型水凝膠PACG(聚丙烯酰甘氨酸),并與GelMA混合作為打印墨水,制備了上層含有Mn2+下層含有生物活性玻璃的雙層支架,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,該支架能顯著促進(jìn)大鼠模型軟骨和軟骨下骨的同步再生。Gao等[92]將活性生長因子TGF-β1加入到PNT水凝膠(NAGA/THMMA共聚物)中誘導(dǎo)軟骨分化,并將β-TCP納米顆粒加載到PNT水凝膠中增強(qiáng)與宿主骨的生物活性結(jié)合,通過3D打印制備出一種雙層骨/軟骨一體化支架,結(jié)果表明β-TCP的引入不僅改善了支架的理化性質(zhì),而且促進(jìn)了hBMSCs的增殖、ALP活性和分化。同時(shí),添加TGF-β1可以促進(jìn)hBMSCs的生長和軟骨分化。另外,Wang等[93]也將轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1加入Collagen Ⅰ中作為軟骨層的打印墨水,并以成骨肽/磷酸三鈣/聚乳酸羥基乙酸(Peptide/TCP/PLGA)復(fù)合材料作為軟骨下骨的打印墨水,采用低溫3D打印技術(shù)制備了雙層骨/軟骨支架,結(jié)果表明該支架具有非均勻的微觀結(jié)構(gòu)和梯度的力學(xué)性能,為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組裝和分化提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。盡管這些雙層支架對(duì)骨/軟骨缺損具有一定的修復(fù)效果,但仍不能將受損組織恢復(fù)到正常狀態(tài),因此,構(gòu)建三維仿生的骨/軟骨支架實(shí)現(xiàn)軟骨與軟骨下骨的同時(shí)修復(fù)和再生仍具有很大的挑戰(zhàn)性。
為了充分了解骨/軟骨缺損的再生策略,有必要了解天然關(guān)節(jié)軟骨的組織結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。事實(shí)上,成熟的關(guān)節(jié)軟骨除了空間分布的軟骨區(qū)和下骨區(qū),中間還存在一層異質(zhì)性的鈣化軟骨作為兩者的過渡區(qū)。為了模擬骨/軟骨組織的復(fù)雜分層結(jié)構(gòu),多層多相支架可能是同步軟骨形成和成骨的可行方法。因此,人們對(duì)多層骨/軟骨一體化支架的設(shè)計(jì)與構(gòu)建進(jìn)行了大量的研究。Zhu等[94]采用多噴嘴3D打印技術(shù)構(gòu)建了一種三層梯度骨/軟骨支架。三層支架均使用SA作為主要成分,對(duì)于中間鈣化層和軟骨下骨層,引入介孔生物活性玻璃(MBG)與SA形成復(fù)合材料,結(jié)果表明所有層中相同的SA組成通過額外的Ca2+交聯(lián)整合在一起,提高了各層間界面的結(jié)合強(qiáng)度,且MBG的添加改善了整個(gè)骨/軟骨支架的機(jī)械強(qiáng)度。Liu等[95]將不同比例的n-HA引入到GelMA中進(jìn)行多噴嘴3D打印,制備了一種包含軟骨層(15%GelMA)、中間界面層(20%GelMA+3%n-HA)和軟骨下骨層(30%GelMA+3%n-HA)的三層梯度支架。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,使用三層支架與周圍組織的融合更好,可以觀察到更多軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)和Ⅱ型膠原的沉積。Zhang等[96]基于鈣化軟骨或軟骨下骨中n-HA含量很高(>65%)的理念,使用SA和聚丙烯酰胺(PAM)作為3D打印墨水的基礎(chǔ)材料,設(shè)計(jì)并制備了一種三層梯度骨/軟骨一體化支架,其中包含上層軟骨層(SA-PAM)、中間鈣化層(SA-PAM-40%n-HA)和軟骨下骨層(SA-PAM-70%n-HA)。結(jié)果表明這種梯度結(jié)構(gòu)能夠提供良好的機(jī)械支撐,并在體內(nèi)植入12周后呈現(xiàn)出良好的修復(fù)效果。相比來說,三層骨/軟骨一體化支架比雙層骨/軟骨一體化支架在結(jié)構(gòu)上更接近于天然關(guān)節(jié)骨/軟骨組織,其包含的軟骨層、鈣化層和下骨層具有梯度的力學(xué)性能,能夠承受人類關(guān)節(jié)從軟骨到下骨快速變化的高負(fù)荷要求。此外,三層骨/軟骨一體化支架中每個(gè)支架層的孔隙結(jié)構(gòu)、成分組成及理化特性均可根據(jù)天然骨/軟骨組織的屬性進(jìn)行仿生調(diào)整,從而達(dá)到與周圍組織的更好融合。這不僅有利于細(xì)胞在工程支架與原生組織之間的自由遷移,而且有利于每層支架中的細(xì)胞進(jìn)行區(qū)域特異性生長、增殖和分化,最終實(shí)現(xiàn)缺損關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的理想再生。
綜合以上研究現(xiàn)狀,目前通過3D打印制備的骨/軟骨組織工程支架主要分為兩大類:純軟骨支架和骨/軟骨一體化支架(圖2)。其中,純軟骨組織工程支架的發(fā)展經(jīng)歷了從單層均質(zhì)同性到三層梯度的巨大跨越,在宏觀層次上更加接近于天然關(guān)節(jié)軟骨的組織構(gòu)造,但在微觀層面,天然軟骨組織各層的定向異性結(jié)構(gòu)特征仍需進(jìn)一步仿生構(gòu)建,因此未來對(duì)純軟骨組織工程支架的研究重點(diǎn)應(yīng)集中于三層定向異構(gòu)的仿生軟骨支架。對(duì)于骨/軟骨一體化支架,由于鈣化層的引入能夠?qū)㈥P(guān)節(jié)軟骨層與軟骨下骨層牢固結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了從雙層支架到三層支架的重大突破,這對(duì)深度缺損的骨/軟骨組織修復(fù)具有重要意義。為了進(jìn)一步模擬構(gòu)建體內(nèi)的刺激環(huán)境,需要在支架內(nèi)添加生長因子進(jìn)行生物誘導(dǎo),并施加一定的力學(xué)刺激進(jìn)行機(jī)械誘導(dǎo),從而賦予支架結(jié)構(gòu)生物活性,促使支架結(jié)構(gòu)功能化。
圖2 目前3D打印軟骨/軟骨組織工程支架的研究現(xiàn)狀及未來研究方向Fig.2 Current research status and future research directions of 3D printed bone/cartilage tissue engineering scaffolds
可注射水凝膠因其最小的侵入性和匹配不規(guī)則缺陷的能力,成為關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)再生的潛在工具。由于純可注射水凝膠不能滿足較高的力學(xué)要求,研究人員將納米填料摻入水凝膠構(gòu)建出可注射納米復(fù)合水凝膠,以改善其力學(xué)性能,使之能與天然軟骨組織相匹配。雖然可注射水凝膠在軟骨組織工程領(lǐng)域取得了較大的進(jìn)展,但可注射水凝膠往往缺乏宏觀孔隙和復(fù)雜的微血管系統(tǒng),從而導(dǎo)致種子細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)物質(zhì)和信號(hào)分子的運(yùn)輸而喪失相當(dāng)大的活力和功能。傳統(tǒng)工藝方法制造的組織工程支架克服了可注射水凝膠缺乏宏觀孔隙的局限,通過顆粒浸出、冷凍干燥、氣體發(fā)泡和熱致相分離等多種技術(shù)結(jié)合,構(gòu)建出了具有高孔隙率和適宜孔徑大小的三維多孔支架,但這種支架的內(nèi)部孔洞多數(shù)為封閉的孔結(jié)構(gòu),無法保證孔隙的連通性,這不利于營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物和氧氣的擴(kuò)散以及細(xì)胞的浸潤、遷移和組織的生長。
與傳統(tǒng)工藝方法相比,3D打印技術(shù)的出現(xiàn)為軟骨組織工程帶來了里程碑的發(fā)展?;?D打印技術(shù)能夠逐層打印、精準(zhǔn)調(diào)控的優(yōu)點(diǎn),生物3D打印的骨/軟骨組織工程支架實(shí)現(xiàn)了從單層到多層的推進(jìn),以及從純軟骨到骨/軟骨一體化的跨越,既模擬了天然軟骨組織的多相材料,又模仿了天然骨/軟骨組織復(fù)雜的層次結(jié)構(gòu)。而且TGF,IGF,BMP等活性因子也逐漸被研究者加入3D打印墨水中進(jìn)行生物刺激,從而誘導(dǎo)支架中不同分層的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)區(qū)域特異性分化和生長,以達(dá)到最佳的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)效果。然而,天然關(guān)節(jié)軟骨組織在結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜性不僅體現(xiàn)在宏觀的梯度分層結(jié)構(gòu),還需滿足各分層中微觀的定向結(jié)構(gòu),因此,有必要進(jìn)一步研究制備梯度分層、定向異構(gòu)的多尺度關(guān)節(jié)軟骨支架。另外,天然關(guān)節(jié)軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境是一個(gè)非常復(fù)雜的微環(huán)境,既有生長因子等化學(xué)刺激,又有一定的機(jī)械力學(xué)刺激,因此,需要構(gòu)建模擬體內(nèi)的刺激環(huán)境,賦予支架結(jié)構(gòu)生物活性,促使支架結(jié)構(gòu)功能化??傊?,開展多材料、多尺度、多誘導(dǎo)的高仿生梯度支架是未來關(guān)節(jié)軟骨組織工程的一個(gè)重要研究方向,這對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)再生治療以及支架向臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。