劉 頓， 呂月玲， 駱 漢

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所， 陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

納米材料一般指結(jié)構(gòu)單元尺寸為1～100 nm的材料，由于其具有一系列新的不同于宏觀物質(zhì)的小尺寸效應(yīng)、界面效應(yīng)、量子效應(yīng)等，是材料科學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。納米材料氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是石墨烯的衍生物，是單層碳原子以sp2雜化方式形成的二維結(jié)構(gòu)。與石墨烯不同的是，氧化石墨烯表面含有大量羥基、羧基等含氧基團(tuán)，使得GO比石墨烯具有更大的比表面積和易修飾性。更為重要的是，氧化石墨烯的細(xì)胞親和性優(yōu)于石墨烯，從而在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域使用更為廣泛[5]。但是，隨著越來越多氧化石墨烯被應(yīng)用生活，氧化石墨烯對生物造成的影響引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，一些針對氧化石墨烯對植物生長影響的研究已經(jīng)開展。李婷等[6]用25～100 mg/kg氧化石墨烯處理油菜，發(fā)現(xiàn)油菜根長縮短，經(jīng)過50～100 mg/kg氧化石墨烯處理的油菜鮮根重顯著下降。但氧化石墨烯對種子萌發(fā)和幼苗生長有促進(jìn)作用。

王偉等[7]研究指出，經(jīng)過低濃度氧化石墨烯處理的紫花苜蓿種子，相比于對照組種子萌發(fā)指數(shù)顯著提高。王曉靜等[8]認(rèn)為，經(jīng)過20%氧化石墨烯處理的高羊茅種子，其萌發(fā)率、萌發(fā)勢、萌發(fā)指數(shù)分別提高了6.3%、20.7%、31.6%；株高、地上干重顯著高于對照組。因此，氧化石墨烯對植物種子萌發(fā)和幼苗生長的影響仍不明確，有待進(jìn)一步探討。

紫穗槐是豆科落葉灌木，高1～4 m，枝褐色，葉互生，原產(chǎn)于美國東部，引入我國后，中國東北、西北、華北地區(qū)均有種植。紫穗槐耐貧瘠，耐水濕和輕度鹽堿土，葉量大且營養(yǎng)豐富，含大量粗蛋白、維生素等，是營養(yǎng)豐富的飼料植物。此外紫穗槐郁閉度高，根系發(fā)達(dá)，側(cè)根較多，能截留大量降雨、固結(jié)土體，減少水土流失，在水土保持林草措施中被廣泛應(yīng)用。

為了進(jìn)一步明確氧化石墨烯對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，本試驗以紫穗槐作為研究對象，對比經(jīng)過不同濃度氧化石墨烯溶液處理種子后紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長狀況，探究氧化石墨烯對紫穗槐生長的影響，旨在揭示植物對納米材料的響應(yīng)以及可能存在的其他風(fēng)險，為納米材料的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

氧化石墨烯為黑色粉末，平均厚度3.4～7 nm，片層直徑10～50 μm，層數(shù)5～10層，比表面積100～300 m2/g，純度>90%。供試種子為經(jīng)過挑選的籽粒飽滿的紫穗槐(AmorphafruticosaLinn.)種子，千粒重12 g。玻璃培養(yǎng)皿口徑為12 cm。芽苗移植后的生長基質(zhì)是經(jīng)過過篩(1 mm)、消毒的河沙。

1.2 試驗方法

選擇紫穗槐種子1 000粒，放入配置好的3%H2O2溶液中浸泡48 h消毒，然后在流動的無菌水下沖洗3次，陰干后將種子均分為6組放入蒸餾水沖洗過的干凈培養(yǎng)皿中，加入配置好的濃度分別為0、50、100、150、200、250 mg/L氧化石墨烯溶液，浸泡48 h。

另外準(zhǔn)備6組蒸餾水沖洗干凈的培養(yǎng)皿，每組3個共18個。在培養(yǎng)皿中先鋪一層脫脂棉，上面再鋪一層濾紙，加水使濾紙和脫脂棉充分濕潤，作為發(fā)芽床。待種子在氧化石墨烯溶液中浸泡完畢后，從每組濃度處理的種子中挑選大小一致，長勢均勻的150粒種子，均分為3組并分別放置于培養(yǎng)皿發(fā)芽床上。將所有的培養(yǎng)皿放入光照強(qiáng)度為2 000 lx，溫度26 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，觀察記錄種子發(fā)芽個數(shù)。

再準(zhǔn)備6個干凈培養(yǎng)皿作為幼苗生長試驗培養(yǎng)皿，對采集回來的河沙過1 mm篩，然后用托盤將所有過篩河沙裝入80 ℃烘箱中消毒5 h，將消毒完畢的河沙裝入培養(yǎng)皿中至培養(yǎng)皿深度的2/3處，用噴壺噴灑蒸餾水至濕潤。發(fā)芽試驗完成后，從每個濃度處理組的3個發(fā)芽床中選擇20株長勢均勻的芽苗移栽入新的培養(yǎng)皿中。移栽時先用牙簽在培養(yǎng)基質(zhì)上扎個小穴，然后把芽苗幼根輕輕放入穴內(nèi)，再用濕沙將幼根埋好，并用手輕輕按壓，使幼根和基質(zhì)緊密接觸即可，每個新的培養(yǎng)皿中移栽20株。培養(yǎng)完畢后，觀察并測定各濃度處理下幼苗的苗高、地徑、生物量、根長和根系表面積。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1種子萌發(fā)指標(biāo)測定

本試驗測定的種子萌發(fā)指標(biāo)包括發(fā)芽勢(GE)、發(fā)芽率(GP)和萌發(fā)指數(shù)(GI)。

發(fā)芽勢指在發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到高峰時，發(fā)芽的種子數(shù)占供測樣品種子數(shù)的百分率，一般以發(fā)芽試驗規(guī)定期限的最初1/3期間內(nèi)的種子發(fā)芽數(shù)占供試種子數(shù)的百分比為標(biāo)準(zhǔn)。

GE(%)=(N1/N)×100% (1)

式中，N1代表從發(fā)芽試驗開始到第3天的發(fā)芽數(shù)；N代表供試種子總數(shù)。

發(fā)芽率指測試種子發(fā)芽數(shù)占測試種子總數(shù)的百分比，是檢測種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。

GP(%)=(N2/N)×100% (2)

式中，N2表示到發(fā)芽試驗結(jié)束時正常發(fā)芽的種子數(shù)；N表示供試種子總數(shù)。

萌發(fā)指數(shù)是發(fā)芽終期內(nèi)每天發(fā)芽粒數(shù)除以對應(yīng)天數(shù)的總和，用以表征種子活力，發(fā)芽指數(shù)越高，種子活力越高。

GI=∑Gt/Dt(3)

式中，Gt為時間t天時的發(fā)芽種子總數(shù)數(shù)值；Dt為萌發(fā)實(shí)驗天數(shù)。

1.3.2幼苗生長指標(biāo)測定

種子萌發(fā)試驗結(jié)束后，移栽入新的裝有消毒河沙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)20 d，培養(yǎng)完畢后每盆隨機(jī)選取3株長勢中等，大小均勻一致的幼苗，測量其平均株高。將所選幼苗取出，在流動的蒸餾水下沖洗干凈后，80 ℃烘干至恒重，測量幼苗干重和地徑。隨后刈割，將根系放入WinRHIZO-2013 e根系分析儀中測量根長和根系表面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

對紫穗槐種子萌發(fā)和生長效應(yīng)評價采用隸屬函數(shù)法。隸屬函數(shù)是模糊集合的數(shù)學(xué)工具，表示元素屬于某模糊集合的真實(shí)程度，在本文中用來表示氧化石墨烯對紫穗槐各項生長指標(biāo)的具體效果，計算公式如下：

式中，R(Xj)為隸屬函數(shù)值，Xj為第j個綜合指標(biāo)(j=1,2,3…)，Xmax、Xmin分別為第j個指標(biāo)的最大值和最小值。然后用各個指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加和來計算綜合評定值，計算公式如下：

R(X)=∑R(Xj) (5)

式中，R(X)為各個濃度綜合評定值，R(Xj)為每個濃度下各個指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化石墨烯對紫穗槐種子萌發(fā)的影響

如表1所示，隨著氧化石墨烯溶液濃度升高，紫穗槐種子的發(fā)芽勢總體呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)使用50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L氧化石墨烯溶液處理種子時，紫穗槐種子的發(fā)芽勢為16.67%、28.00%、47.33%，均高于對照組種子萌發(fā)勢；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度繼續(xù)增大時，紫穗槐種子的發(fā)芽勢隨著溶液濃度的升高而持續(xù)降低。在所有處理組中，當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度在50～200 mg/L范圍內(nèi)時，紫穗槐種子發(fā)芽率均顯著高于對照組；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度為250 mg/L時，經(jīng)處理的紫穗槐種子發(fā)芽勢為6.00%，低于對照組但并不顯著。通過對以上數(shù)據(jù)的分析，低濃度氧化石墨烯溶液(0～200 mg/L)對紫穗槐種子的萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用，但濃度繼續(xù)增大時，紫穗槐種子的發(fā)芽勢情況需要進(jìn)一步研究。針對紫穗槐種子發(fā)芽率來說，當(dāng)氧化石墨烯濃度在50～150 mg/L時，經(jīng)過處理的紫穗槐種子發(fā)芽率是84.00%、92.00%、93.33%，高于對照組70%的發(fā)芽率，且差異顯著；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度為200 mg/L，處理種子的發(fā)芽率為70%，與對照組相等；繼續(xù)增大到250 mg/L時，種子發(fā)芽率為52.67%，顯著低于對照組。結(jié)果表明，氧化石墨烯溶液濃度在50～150 mg/L范圍內(nèi)，對紫穗槐種子的發(fā)芽率有顯著促進(jìn)作用，當(dāng)濃度大于200 mg/L時，對發(fā)芽率抑制效果明顯。

表1 氧化石墨烯對紫穗槐種子萌發(fā)的影響

紫穗槐種子萌發(fā)指數(shù)的情況與發(fā)芽勢大致相同，對照組的萌發(fā)指數(shù)為17.56%，當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度以50 mg/L增加到200 mg/L時，紫穗槐種子萌發(fā)指數(shù)分別是27.71%、42.93%、52.16%、23.11%，均顯著高于對照組；當(dāng)繼續(xù)增大到250 mg/L時，種子萌發(fā)指數(shù)為15.45%，略小于對照組的17.56%，但沒有顯著變化。

在3個種子萌發(fā)指標(biāo)均呈先增加后減小的變化趨勢。在濃度為150 mg/L時，各個指標(biāo)達(dá)到最大值，分別為47.33%、93.33%和52.16%；當(dāng)氧化石墨烯濃度繼續(xù)增大，發(fā)芽勢、發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)均逐漸減小。氧化石墨烯溶液濃度增加至250 mg/L時，種子發(fā)芽勢和萌發(fā)指數(shù)下降至與對照組無顯著差異(p<0.05)，而發(fā)芽率則顯著低于對照組。綜合以上結(jié)論，氧化石墨烯溶液對紫穗槐種子的影響可以概括為：低濃度時對紫穗槐種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，隨著濃度的逐漸增大，促進(jìn)作用越來越不明顯，最后逐漸抑制種子萌發(fā)。

2.2 氧化石墨烯對紫穗槐幼苗株高、地徑和干重的影響

經(jīng)過100 mg/L、150 mg/L氧化石墨烯溶液處理過的紫穗槐幼苗的地徑分別為2.54 mm、2.20 mm，均高于對照組的幼苗地徑1.48 mm，并且差異顯著(圖1)；其余處理組的幼苗地徑與對照組差異不明顯，根據(jù)本實(shí)驗所得結(jié)果，氧化石墨烯溶液在100～150 mg/L濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)紫穗槐幼苗地徑的增長，隨著濃度的增加抑制效果并不明顯。

注：同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

對于紫穗槐幼苗干重來說，當(dāng)氧化石墨烯濃度是50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L時，經(jīng)過處理的幼苗干重分別是0.363 g、0.539 g、0.407 g，均顯著高于對照組幼苗干重(0.311 g)，這說明氧化石墨烯溶液濃度在50～150 mg/L之間時，氧化石墨烯可以促進(jìn)紫穗槐幼苗干重增加；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度為200 mg/L時，經(jīng)處理幼苗干重為0.294 g、與對照組差異不明顯；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度繼續(xù)增大到250 mg/L時，經(jīng)處理的紫穗槐幼苗干重為0.223 g，相比對照組顯著下降。

紫穗槐幼苗苗高隨氧化石墨烯溶液濃度增加而發(fā)生變化的情況與地徑基本一致，經(jīng)過50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L處理的紫穗槐幼苗苗高顯著高于對照組，分別是5.19 cm、6.23 cm、5.17 cm；當(dāng)溶液濃度進(jìn)一步增大為200 mg/L、250 mg/L時，幼苗苗高分別為4.33 cm、3.61 cm，與對照組無顯著差異。結(jié)果表明，用濃度為50～100 mg/L的氧化石墨烯溶液處理紫穗槐種子，種子發(fā)育成幼苗的苗高會有顯著增加。

幼苗的苗高、干重、地徑均隨著氧化石墨烯濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(圖2)。在氧化石墨烯濃度為100 mg/L時達(dá)到峰值，分別為6.23 cm、5.39 cm、2.54 cm，比對照組分別提高了50.48%、73.31%和71.62%。經(jīng)過50 mg/L、100 mg/L和150 mg/L氧化石墨烯處理過的幼苗苗高、干重、地徑均顯著大于對照組(p<0.05)；當(dāng)氧化石墨烯濃度>150 mg/L時，幼苗的苗高、干重、地徑減小，與對照組差異不大(p>0.05)。其中當(dāng)氧化石墨烯濃度為250 mg/L時，幼苗干重顯著低于對照組(p<0.05)。

2.3 氧化石墨烯對紫穗槐幼苗根長、根系表面積的影響

由表2可以看出，根長和根系表面積均隨氧化石墨烯濃度的增加呈先增加后減小的變化趨勢，均在濃度為100 mg/L時達(dá)到最大，分別為37.73 cm、3.59 cm。當(dāng)氧化石墨烯濃度大于100 mg/L時，其對根長的促生長作用逐漸減小，200 mg/L濃度時根長已降至與對照組相似(p>0.05)。而當(dāng)濃度達(dá)到250mg/L時，氧化石墨烯表現(xiàn)出對根系生長的抑制作用，根長比對照組減小了6.2%(p<0.05)。對于根系表面積，氧化石墨烯濃度在200 mg/L時體現(xiàn)出抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到250 mg/L時，根系表面積比對照組減小了11.0%。氧化石墨烯處理有明顯的低濃度促進(jìn)生長，高濃度抑制生長的現(xiàn)象。

表2 氧化石墨烯對紫穗槐根系生長的影響

2.4 氧化石墨烯對紫穗槐種子萌發(fā)及幼苗生長影響的評定

采用隸屬函數(shù)法就氧化石墨烯溶液對紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長的影響進(jìn)行評定。最終0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L氧化石墨烯溶液所得分?jǐn)?shù)分別為1.88、4.02、7.25、6.02、2.25、0，氧化石墨烯的影響排序為100 mg/L>150 mg/L>50 mg/L>200 mg/L>250 mg/L(表3)。100 mg/L氧化石墨烯溶液對紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長促進(jìn)效果最明顯，并且濃度范圍在50～200 mg/L時均有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度增大到250 mg/L時，對紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長會有抑制作用。

表3 隸屬函數(shù)分析

3 討 論

種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)都具有隨著氧化石墨烯濃度增加，指標(biāo)數(shù)值呈先增大后減小的趨勢(表1)，均在150 mg/L時達(dá)到峰值。氧化石墨烯濃度在50～200 mg/L范圍內(nèi)時，有明顯的促進(jìn)作用。這與Zhang等[9]針對石墨烯對番茄種子萌發(fā)和幼苗生長情況的研究結(jié)果相一致，石墨烯可以破壞種子表皮，加快種胚吸水，從而使其發(fā)芽速度加快。氧化石墨烯與石墨烯具有同樣鋒利的片層，可以破壞紫穗槐種子表皮的鞣質(zhì)，加快紫穗槐種子的吸水，從而提高紫穗槐種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。

氧化石墨烯也可以顯著增加紫穗槐幼苗苗高、地徑和干重，并且出現(xiàn)低濃度氧化石墨烯促進(jìn)生長，高濃度抑制生長的現(xiàn)象，指標(biāo)數(shù)值呈先增加后降低的現(xiàn)象(圖2)，這與其他學(xué)者研究結(jié)果一致。經(jīng)過納米材料處理的大豆、水稻、小麥、苜蓿和黃瓜均存在這一現(xiàn)象[10-13]，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是納米材料暴露可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞中活性氧化簇的產(chǎn)生，進(jìn)而引起一系列植物防御反應(yīng)，這些防御反應(yīng)主要表現(xiàn)為丙二醛含量升高，抗氧化酶活性改變，葉綠素水平降低和氧化應(yīng)激損傷等現(xiàn)象[14-17]。當(dāng)氧化石墨烯濃度超過某一閾值時，氧化脅迫加劇，對紫穗槐種子細(xì)胞造成不可逆的損傷，從而對以后的生長造成負(fù)面影響。

本試驗中，氧化石墨烯是通過浸泡種子的方式作用于植物，沒有直接接觸植物根系，對于經(jīng)過處理的種子發(fā)育成幼苗后依然出現(xiàn)低濃度促進(jìn)生長，高濃度抑制生長這一現(xiàn)象的原因，可能與種子細(xì)胞內(nèi)的生長素有關(guān)。氧化石墨烯促進(jìn)植物生長的機(jī)制是其通過調(diào)控生長素和脫落酸的合成來影響植物的生長[18-21]。本試驗初期用氧化石墨烯溶液浸種時，滲透進(jìn)紫穗槐種子內(nèi)部的氧化石墨烯分子引起種子中植物激素的有機(jī)酸的含量變化，從而影響根系生長。

4 結(jié) 論

氧化石墨烯溶液濃度在50～200 mg/L之間對紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長均起到促進(jìn)作用，且低濃度溶液的促進(jìn)作用更加顯著。隨著濃度的增高，促進(jìn)作用越來越弱，直至抑制生長。隸屬函數(shù)分析結(jié)果表明，種子萌發(fā)最適宜的濃度為150 mg/L，幼苗生長最適濃度為100 mg/L。綜合比較隸屬函數(shù)值R(100mg/L)>R(150 mg/L)后認(rèn)為，紫穗槐種子萌發(fā)及幼苗生長最適濃度為100 mg/L。