陳國(guó)立, 張瑞平, 許衛(wèi)猛, 孫 佩, 魏常敏, 邢永鋒

(1.周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河南 周口 466001; 2.新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 45300)

玉米是糧、經(jīng)、飼兼用型的農(nóng)作物，具有不可取代的作用[1]，玉米持有量是檢驗(yàn)畜牧業(yè)和人民生活質(zhì)量的主要指標(biāo)[2-3]。種子是農(nóng)業(yè)的芯片，玉米種子質(zhì)量問(wèn)題不僅關(guān)系著農(nóng)民的切身利益，而且關(guān)系著我國(guó)糧食安全[4]。近年來(lái)，我國(guó)玉米種植面積不斷擴(kuò)大，玉米新品種數(shù)量也逐年增多，但是我國(guó)玉米種質(zhì)資源來(lái)源相對(duì)集中，遺傳基礎(chǔ)狹窄，導(dǎo)致一些玉米新品種性狀相似，田間表型性狀很難區(qū)分[5]。因此，從分子水平上建立準(zhǔn)確有效的玉米品種真實(shí)性鑒定技術(shù)體系顯得非常必要[4]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)[6]在真核生物基因組中分布隨機(jī)且廣泛[7-8]，呈共顯性，具有多態(tài)性高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低[9]，在玉米品種真實(shí)性鑒定和指紋圖譜構(gòu)建中有著廣泛應(yīng)用[10]。王鳳格等[11]利用篩選出的40對(duì)SSR核心引物對(duì)3998份中國(guó)審定的品種建立了DNA指紋庫(kù)[1]；倪維晨等[12]從30對(duì)SSR引物中篩選出10對(duì)引物，初步構(gòu)建了常熟市10份糯性鮮食小玉米自交系指紋圖譜；王蕾等[13]利用17對(duì)SSR引物對(duì)32份黃瓜品種進(jìn)行分析，為每一份材料建立了一份獨(dú)特的DNA指紋圖譜，為黃瓜新品種選育及品種鑒定提供了重要依據(jù)；高閏飛等[14]利用兩對(duì)多態(tài)性好的引物構(gòu)建了73份紫心甘薯品種的指紋圖譜；邱紅波等[15]從34對(duì)核心引物中選出6對(duì)，建立了喀斯特山區(qū)玉米自交系的指紋圖譜。

北青340是鄭州北青種業(yè)有限公司用BQ 58-2×JG 67培育而成的優(yōu)良玉米雜交種，于2018年通過(guò)國(guó)家審定(國(guó)審玉20180106)。本研究用40對(duì)玉米核心引物，通過(guò)SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)北青340以及其父、母本進(jìn)行分析，從中篩選出條帶清晰且互補(bǔ)的引物構(gòu)建成北青340以及其親本的指紋圖譜。同時(shí)用數(shù)字“0”和“1”建立數(shù)據(jù)庫(kù)，將圖譜數(shù)字化，并根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算出現(xiàn)相同指紋的概率，為快速有效鑒定市場(chǎng)流通的北青340種子的真實(shí)性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和主要試劑

北青340及其親本來(lái)自鄭州北青種業(yè)有限公司。CTAB、2×PCR Mix、丙烯酰胺等藥品購(gòu)買(mǎi)于上海生工股份有限公司。40對(duì)玉米核心引物序列來(lái)自玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.maizegbd.org/ssr.php),并通過(guò)上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1DNA提取

于苗期取北青340及其親本的葉片適量，于液氮中快速研磨至粉末狀，用CTAB方法提取總DNA[16]，加400 μL TE緩沖液，4 ℃?zhèn)溆茫?20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.2PCR及電泳分析

PCR反應(yīng)總體積為15 μL，2×PCR Mix 7.5 μL，DNA 1 μL，引物1 μL，滅菌超純水5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性6 min，94 ℃ 40 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min[17]。

在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL上樣緩沖液，于微孔板離心機(jī)中混勻。于8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠上樣4 μL，電壓150 V電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。最后用銀染顯色，相機(jī)拍照保存并分析圖片。

1.2.3指紋圖譜構(gòu)建及數(shù)字化

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，篩選帶型穩(wěn)定、清晰且親本互補(bǔ)的引物，用于構(gòu)建北青340及其親本的指紋圖譜，并用數(shù)字“0”和“1”表示在相同遷移位置條帶的“無(wú)”和“有”兩種情況，將北青340及其親本的指紋圖譜數(shù)字化。并根據(jù)公式P=1/2n計(jì)算相同指紋圖譜有可能出現(xiàn)的概率[16-17]，其中公式中“2”為相同遷移率位點(diǎn)上等位基因“有”和“無(wú)”兩種情況；“n”表示等位基因的數(shù)目；2n表示檢測(cè)n個(gè)等位基因時(shí)可能涉及的所有玉米自交系的數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選

40對(duì)玉米SSR核心引物中有7對(duì)引物帶型清晰、穩(wěn)定，此7對(duì)引物可以用來(lái)構(gòu)建雜交種北青340及其親本指紋圖譜。結(jié)果顯示，這7對(duì)引物檢測(cè)出等位基因25個(gè)，平均每對(duì)引物檢測(cè)到3.57個(gè)等位基因，從圖1可看出,這些等位基因片段大小在100～500 bp之間，且這7對(duì)引物分布在5條染色體上(表1)。

表1 用于構(gòu)建北青340指紋圖譜引物信息

注：父為父本JG67;340為北青340；母為母本BQ 58-2，下方是對(duì)應(yīng)的引物，M為Mark。

2.2 北青340及其親本指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)40對(duì)核心引物在北青340及其親本的擴(kuò)增結(jié)果中挑選出7對(duì)引物用于構(gòu)建北青340的指紋圖譜(圖1)，分別是：umc 1147 y 4、bnlg 1671 y 17、umc 1999 y 3、phi 299852 y 2、umc 1936 k 4、umc 2163 w 3、bnlg 2291 k 4。由圖1可看出，這7對(duì)引物擴(kuò)增的帶型清晰，且父母本互補(bǔ)，正好印證了SSR分子標(biāo)記共顯性的遺傳特點(diǎn)[20]。

2.3 指紋圖譜數(shù)字化

根據(jù)篩選出的7對(duì)引物所構(gòu)建的北青340及其親本的指紋圖譜(圖1)，分別用“1”和“0”表示在相同位點(diǎn)有帶和無(wú)帶，將北青340及其親本的指紋圖譜數(shù)字化，并根據(jù)公式P=1/2n計(jì)算與其相同指紋的概率。由表2可知，出現(xiàn)與北青340及其親本指紋圖譜相同圖譜的概率為2.98×10-8，概率極低。結(jié)果證明這7對(duì)引物所構(gòu)建的北青340及其親本的指紋圖譜可用于其真實(shí)性鑒定。

表2 北青340及其親本的數(shù)字化指紋

3 討 論

玉米作為我國(guó)第一大作物，在保障國(guó)家糧食安全和生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位[21]。玉米品種是決定玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素[22]。因此，保護(hù)和創(chuàng)新玉米種質(zhì)資源對(duì)推動(dòng)玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[12]。SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、費(fèi)用相對(duì)較低等特點(diǎn)，在新品種真實(shí)性和純度鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等方面發(fā)揮著重要作用[23]。目前已經(jīng)成功運(yùn)用于棉花[24]、玉米[17]、煙草[25]、梨[26]，甘薯[14]等多種農(nóng)作物的指紋圖譜構(gòu)建。

本研究為構(gòu)建北青340及其親本的指紋圖譜，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)40對(duì)玉米SSR核心引物進(jìn)行分析，從中篩選出7對(duì)帶型清晰穩(wěn)定的引物，并將其所構(gòu)建的北青340及其親本的指紋圖譜數(shù)字化，計(jì)算得出與其相同指紋圖譜的概率為2.98×10-8， 這個(gè)概率是非常低的。因此，這7對(duì)引物所構(gòu)建北青340及其親本的指紋圖譜是特有的，在生產(chǎn)中，可從中隨機(jī)挑選1～2對(duì)用來(lái)鑒定玉米雜交種北青340及其親本的真實(shí)性。