應(yīng)敏麗 王佳曦 徐旭群

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，也是全球女性第四大常見腫瘤[1]。卵巢癌發(fā)病隱匿，進(jìn)展較快，病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位，5年生存率低于50%[2]。據(jù)2018年的報道，全球每年有22萬患者死于卵巢癌，有23萬患者被診斷為卵巢癌，并有逐年增長的趨勢[3]。上皮性卵巢癌是卵巢癌的主要類型，包括了來自卵巢上皮的不同類型的漿液性囊腺瘤、黏液性囊腺瘤和卵巢內(nèi)膜樣腫瘤，這些常見類型的上皮性卵巢癌約占卵巢癌的90%[4]。即便現(xiàn)在診療技術(shù)不斷發(fā)展，上皮性卵巢癌患者的5年生存率仍沒有實質(zhì)性提高，表現(xiàn)為高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率[5]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。microRNA是微小的單鏈、非編碼的RNA，其主要作用是與目的基因的3'UTR端結(jié)合發(fā)揮翻譯作用[6-7]。microRNA參與卵巢癌的發(fā)生、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移過程[8]。有文獻(xiàn)報道，microRNA-29a在腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，能夠有效抑制實體瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖[9]，這一作用與其介導(dǎo)的能量代謝有關(guān)[10-11]?；谏鲜霰尘?，本研究擬探討microRNA-29a在上皮性卵巢癌增殖及能量代謝中的作用，并分析其表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 組織和細(xì)胞 選取2009年1月至2018年12月在浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院行卵巢癌根治術(shù)或減瘤術(shù)治療患者的術(shù)后標(biāo)本（冷凍組織或石蠟組織），共51例卵巢癌組織及配對的癌旁正常組織?；颊吣挲g 35～70（55.71±7.76）歲；瘤徑≤5 cm 者 19 例，＞5 cm者32例；腫瘤組織為中高分化者22例，低分化者29例。所有患者術(shù)前未予輔助治療，組織標(biāo)本的使用取得患者或家屬的知情同意。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。另外，自中國科學(xué)院細(xì)胞庫及美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）購入卵巢癌 SKOV3、Caov3、CP70、OVCAR3細(xì)胞及正常卵巢IOSE細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中以備下述實驗。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌組織與癌旁正常組織、卵巢癌細(xì)胞與正常卵巢細(xì)胞microRNA-29a表達(dá)水平檢測 采用熒光定量PCR技術(shù)。冷凍組織與石蠟組織采用不同方法提取細(xì)胞RNA。冷凍組織標(biāo)本經(jīng)0.9%氯化鈉溶液清洗，將組織在液氮中磨碎，每50～100 mg組織加入1 ml TRIzo（l美國Invitrogen公司，批號：15596018），用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。采用TRIzol提取細(xì)胞RNA。石蠟組織切片先通過刮取石蠟組織至離心管中，加入二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，后用無水乙醇去除二甲苯，并在溶液中加入蛋白酶消化裂解3 h，后按Ambion試劑盒（美國Ambion公司，批號：AM1556）中說明書要求提取細(xì)胞RNA。通過Invitrogen SuperScriptⅣ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛公司，批號：18090200）合成cDNA，再通過羅氏SYBR Green熒光定量試劑盒（美國羅氏公司，批號：4887352001）于PCR儀（美國羅氏公司，型號：Roche480）進(jìn)行定量檢測和分析。microRNA-29a引物：正向5'-CGGCGGTAGCACCATCTGAAAT-3',反向5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3'。U6引物：正向5'-GGAGAGTGTTTCCTCGTCCC-3'，反向 5'-ATGAAGGG GTCGTTGATGGC-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，73℃延伸30 s，重復(fù)循環(huán)38次，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，計算每次結(jié)果的平均值。采用2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量，其中ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，ΔΔCt=ΔCt-ΔC（t對照）。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 卵巢癌 SKOV3、Caov3、CP70、OVCAR3細(xì)胞及正常卵巢IOSE細(xì)胞在37℃，5% CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑及其陰性對照購自杭州億徠生物科技有限公司。采用Lipofectamine3000試劑（美國Invitrogen公司）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用胰酶（美國Gibco公司）消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，每孔1×106個細(xì)胞，細(xì)胞融合度至70%～90%時轉(zhuǎn)染。用兩份 125 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋 3.75 μl和 7.5 μl Lipofectamine 3000試劑，同時各用250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋上述microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑及其陰性對照核苷酸，各取125 μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋的DNA及稀釋的Lipofectamine3000，室溫孵育5 min，將上述稀釋液混合，輕輕混勻，室溫靜置20 min，將制備好的轉(zhuǎn)染液加入每孔細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染4～6 h后細(xì)胞換液，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染入microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μl/孔），將培養(yǎng)板放置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，后向每個孔中加入10 μl CCK-8溶液（美國艾博抗公司，批號：ab228554），再將96孔板置于培養(yǎng)箱中靜置1 h，再用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡能力檢測 采用膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測。將轉(zhuǎn)染入microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后，800 r/min，4℃離心5 min收集細(xì)胞。按說明書要求準(zhǔn)備好試劑盒中的Annexin V溶液、PI染色溶液和1×緩沖液。用預(yù)冷的PBS洗兩次消化下來的細(xì)胞，然后4℃離心，1 500 r/min，7 min，吸棄 PBS，加入 100 μl 1×緩沖液沖洗并重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V溶液和10 μl PI染色溶液，輕輕混勻，避光、室溫反應(yīng)15 min。最后再加入400 μl 1×緩沖液，混勻后放置于冰上，樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。PI染色溶液用波長為535 nm熒光顯微鏡觀察統(tǒng)計細(xì)胞量。用Flowjo軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點圖。

1.2.5 細(xì)胞外酸化率水平檢測 采用Seahorse法。在實驗前1天用儀器所配備的校準(zhǔn)液（1 ml/孔）水化底層24孔板，然后鋪上24孔水分補充板（Hydro Booster板），最后蓋上24孔感受盒（Sensor Cartridge），形成含有檢測探針及感受器的24孔板以備細(xì)胞進(jìn)入檢測。將組合好的24孔板放入無CO2的培養(yǎng)箱，37℃過夜，使校準(zhǔn)液能浸沒在感受盒中。分別將轉(zhuǎn)染microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑、陰性對照核苷酸的卵巢癌細(xì)胞用100 μl培養(yǎng)液收集，按最佳細(xì)胞密度重懸細(xì)胞（10 000～80 000個細(xì)胞/孔）。在組合好的24孔板中，每孔接種100 μl細(xì)胞懸液，背景校正孔不接種細(xì)胞形成24孔細(xì)胞板。將細(xì)胞板室溫靜置在超凈臺上1 h。后將細(xì)胞板放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中讓細(xì)胞貼壁5～6 h，細(xì)胞貼壁后，每孔加入150 μl RPMI 1640培養(yǎng)基，總體積為250 μl，將細(xì)胞放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。第2天吸去培養(yǎng)液至每孔剩余50 μl，用1 ml XF檢測液（源于儀器所配備XF細(xì)胞線粒體壓力測試盒，美國海馬公司）洗細(xì)胞2次，每孔加入檢測液至終體積為500 μl/孔。將細(xì)胞板置于37℃無CO2培養(yǎng)箱中1 h。根據(jù)XF細(xì)胞線粒體壓力測試盒要求配置 Oligomycin（寡霉素）、FCCP（羰基-氰-對-三氟甲氧基苯肼）及Rotenone/Antimycin A（魚藤酮/抗霉素A）溶液，依次加入各孔中并于Seahorse海馬能量代謝檢測儀（美國海馬公司，型號：Seahorse XFe）上進(jìn)行檢測，并經(jīng)附機軟件進(jìn)行分析和導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

1.2.6 細(xì)胞代謝物質(zhì)變化檢測 采用液相質(zhì)譜技術(shù)。分別收集轉(zhuǎn)染microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑、陰性對照核苷酸的卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，備所需流動相，用0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣20 min。根據(jù)待測樣品的需要更換合適的色譜柱和定量環(huán)。配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45 μm濾膜過濾。設(shè)置參數(shù)，同時進(jìn)樣分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism v9.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示表示，兩組比較采用配對t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用ROC曲線分析microRNA-29a高低表達(dá)的截斷值。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存曲線的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織與癌旁正常組織、卵巢癌細(xì)胞與正常卵巢細(xì)胞microRNA-29a表達(dá)水平比較 與癌旁正常組織相比，卵巢癌組織microRNA-29a表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與正常卵巢細(xì)胞相比，卵巢癌SKOV3、Caov3、CP70、OVCAR3細(xì)胞microRNA-29a表達(dá)水平均降低（均 P＜0.05），且卵巢癌 SKOV3和 OVCAR3細(xì)胞 microRNA-29a表達(dá)水平最低，約為正常卵巢細(xì)胞的0.44倍和0.41倍。見圖1。

圖1 卵巢癌組織與癌旁正常組織、卵巢癌細(xì)胞與正常卵巢細(xì)胞 microRNA-29a表達(dá)水平比較（a：組織；b：細(xì)胞）

2.2 轉(zhuǎn)染microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑的卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡能力比較 與轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸的卵巢癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染microRNA-29a抑制劑的卵巢癌細(xì)胞增殖能力增強（P＜0.05），凋亡能力減弱（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染microRNA-29a模擬物的卵巢癌細(xì)胞凋亡能力增強（P＜0.05），增殖能力減弱（P＜0.05）。見圖 2。

圖2 轉(zhuǎn)染microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑的卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡能力比較（a、b：增殖能力比較；C：凋亡流式細(xì)胞圖比較）

2.3 轉(zhuǎn)染microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑的卵巢癌細(xì)胞外酸化率及代謝物質(zhì)水平比較 與轉(zhuǎn)染陰性對照核苷酸的卵巢癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染microRNA-29a抑制劑的卵巢癌細(xì)胞外酸化率升高（P＜0.05），提示細(xì)胞代謝明顯增強，進(jìn)一步提示腫瘤細(xì)胞生長能力旺盛，磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸及乳酸等水平也隨microRNA-29a活性的抑制而升高（均P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染microRNA-29a模擬物的卵巢癌細(xì)胞外酸化率降低（P＜0.05），提示細(xì)胞代謝能力減弱，進(jìn)一步提示腫瘤細(xì)胞生長受到抑制，磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸及乳酸等水平也降低（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染microRNA-29a模擬物、microRNA-29a抑制劑的卵巢癌細(xì)胞外酸化率及代謝物質(zhì)水平比較（a、b、c、d為細(xì)胞外酸率比較；e、f為代謝物質(zhì)水平比較）

2.4 上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織microRNA-29a表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)51例患者microRNA-29a表達(dá)水平的ROC曲線，結(jié)合約登指數(shù)，獲得microRNA-29a表達(dá)水平判斷患者預(yù)后的截斷值為1.98（AUC=0.99，P＜0.05），見圖 4。以截斷值為界將患者分組，microRNA-29a高表達(dá)（≥1.98）患者5年生存率高于低表達(dá)（＜1.98）患者（54.4%比 22.9%，P＜0.05），5年無進(jìn)展生存率亦高于低表達(dá)患者（55.23%比20.89%，P＜0.05）。見圖 5。

圖4 microRNA-29a表達(dá)水平判斷上皮性卵巢癌患者預(yù)后的ROC曲線

圖5 microRNA-29a高表達(dá)與低表達(dá)上皮性卵巢癌患者生存曲線比較（a：總生存曲線；b：無進(jìn)展生存曲線）

2.5 microRNA-29a高表達(dá)與低表達(dá)上皮性卵巢癌患者臨床病理特征比較 microRNA-29a表達(dá)水平與患者腫瘤大小、組織分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期均有關(guān)（均P＜0.05），但與年齡無關(guān)（P＞0.05）。microRNA-29a高表達(dá)患者腫瘤較小、組織分化較好、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低、腫瘤分期較早，見表1。

表1 microRNA-29a高表達(dá)與低表達(dá)上皮性卵巢癌患者臨床病理特征比較[例（%）]

3 討論

microRNA是一類短的（通常在17到25個核苷酸之間）非編碼單鏈RNA，在進(jìn)化上是保守的。microRNA在細(xì)胞代謝、增殖、分化、凋亡等與病毒感染相關(guān)的生物學(xué)過程以及心血管疾病、神經(jīng)、肌肉及腫瘤等疾病的發(fā)生、診斷和治療等眾多方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。microRNA還在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤的進(jìn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成[7]。microRNA-29a本身是一種保守的microRNA，參與調(diào)節(jié)影響不同生物學(xué)過程的幾個協(xié)同轉(zhuǎn)錄后程序。其可抑制多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的翻譯，microRNA-29a的缺失會導(dǎo)致幾種組織的纖維化，同時調(diào)節(jié)骨髓分化[12]。有研究報道m(xù)icroRNA-29a在肺癌[13]、胰腺癌[14]及結(jié)腸癌[15]中發(fā)揮了重要的抗癌作用，同時與臨床腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-29a在卵巢癌組織中低表達(dá)，在癌旁正常組織中高表達(dá)。在卵巢癌SKOV3與OVCAR3細(xì)胞中microRNA-29a低表達(dá)較明顯。在臨床分析中發(fā)現(xiàn)患者microRNA-29a表達(dá)水平與腫瘤大小、組織分化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期存在密切關(guān)系。與低表達(dá)患者相比較，高表達(dá)患者5年生存率明顯升高，5年無進(jìn)展生存率也明顯升高，高microRNA-29a表達(dá)水平意味著低復(fù)發(fā)風(fēng)險以及較好的預(yù)后。本研究同時分析了microRNA-29a的截斷值，可為后續(xù)的臨床研究診療提供幫助。本研究還發(fā)現(xiàn)，microRNA-29a高表達(dá)能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，同時抑制癌細(xì)胞的糖代謝水平，說明microRNA-29a能夠調(diào)控卵巢癌的代謝，由此促使細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸水平發(fā)生改變，最終影響腫瘤微環(huán)境。

綜上所述，microRNA-29a在卵巢癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，與卵巢癌腫塊大小、組織分化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期存在密切關(guān)系，其高表達(dá)提示較好的預(yù)后和低復(fù)發(fā)風(fēng)險，或可為患者臨床預(yù)后判斷提供重要參考。microRNA-29a作為抑癌基因能夠抑制卵巢癌的增殖，同時能夠抑制癌細(xì)胞的能量代謝，但microRNA-29a調(diào)控卵巢癌發(fā)展的代謝微環(huán)境機制仍需進(jìn)一步研究。