王 姣，羅林麗，張 蕓，祝永才，楊嬌一，廖富友，姚炳濃，楊勝林*

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展中心，貴州貴陽(yáng) 550025）

番鴨體型碩大，身軀長(zhǎng)、略扁，前后窄、中間寬，呈紡錘形；具有生長(zhǎng)快、耐粗飼、易育肥、瘦肉率高、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，是優(yōu)質(zhì)肉鴨品種。家禽的啄羽（FP，F(xiàn)eather Pecking）行為對(duì)羽毛的損失、皮膚傷害和死亡負(fù)有責(zé)任，因此，F(xiàn)P既是一個(gè)主要的福利問(wèn)題，也是經(jīng)濟(jì)損失的原因。FP行為在學(xué)術(shù)界有3種理解：一種理解為重定向采食行為，受中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）和多巴胺（DA）的調(diào)控；另一種理解為適應(yīng)不良行為，與動(dòng)物生存環(huán)境相關(guān)；還有一種理解為病理學(xué)行為，與環(huán)境無(wú)關(guān)，主要受遺傳因素的影響。有研究表明，啄食羽毛的潛在動(dòng)機(jī)是吃羽毛，或者這是一般多動(dòng)癥的結(jié)果。Lutz等人應(yīng)用GWAS技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因和可能與啄羽和攻擊行為有關(guān)。

溶質(zhì)載體家族12成員9（Solute Carrier Family 12 Member 9，）基因?qū)儆诰幋a電子中性陽(yáng)離子-氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的9個(gè)基因家族之一。雖然該基因的功能尚不清楚，但已知其他SLC12轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在控制電化學(xué)氯離子梯度方面至關(guān)重要，且家庭成員之間的氨基酸相似性在19%～76%之間?；蚣易逡恍┏蓡T的缺乏通常會(huì)讓小鼠患上巴特氏綜合征、吉特曼綜合征、胼胝體、周?chē)窠?jīng)病、癲癇等疾病。G蛋白Y2亞基（G protein Subunit Gamma 2，）屬于c亞單位的亞家族II。被確定為一種特定的大鼠幽閉標(biāo)志，盡管幽閉狀態(tài)的功能意義目前未知，但它的位置和神經(jīng)聯(lián)系表明，它可能在整合構(gòu)成意識(shí)感知基礎(chǔ)的信息中發(fā)揮作用。

本研究擬通過(guò)對(duì)、基因在番鴨不同組織的差異表達(dá)分析，以及對(duì)具有啄羽行為的番鴨大腦組織進(jìn)行、基因?qū)崟r(shí)熒光定量，比較2個(gè)基因的表達(dá)差異，探究、基因與番鴨啄羽行為是否相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集 實(shí)驗(yàn)選取正常與啄羽6月齡的番鴨共27只，置于貴州大學(xué)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行行為學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均勻分為9組，每組3個(gè)重復(fù)。鴨籠為1.5 m×1.5 m×0.7 m（飼養(yǎng)方式為平養(yǎng)，以排除空間等因素對(duì)番鴨行為的影響）。飼喂期間，日糧營(yíng)養(yǎng)充沛，自由采食、飲水，按期清掃鴨舍內(nèi)的衛(wèi)生，按期清理糞便、消毒，保證鴨舍內(nèi)飼養(yǎng)環(huán)境優(yōu)良。挑選無(wú)FP行為的番鴨3組，采集心、肝、脾、肺、腎、胰、肌胃、腺胃、視丘、大腦和小腦的組織樣品共11個(gè)，再挑選出具有FP行為與無(wú)FP行為的番鴨各3組采集大腦組織，放進(jìn)凍存管中并貯存于-80℃。

1.2 主要儀器 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、電泳儀（DYY-2C型）、PCR擴(kuò)增儀（C1000Touch）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hool ll）、-80℃冰箱、-20℃冰箱、4℃冰箱、超凈工作臺(tái)。

1.3 主要試劑 RNA提取劑Trizol、液氮（-196℃）、三氯甲烷、0.5×TAE緩沖液、異丙醇、75%乙醇、瓊脂糖；熒光定量試劑2×Ts Master qRT-PCR Mix購(gòu)自擎科生物科技有限公司；cDNA第1鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用HiFiScript cDNA Synthesis Kit（康為世紀(jì)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 組織樣總RNA提取及cDNA合成 實(shí)驗(yàn)采用Trizol法進(jìn)行心、肝、脾、肺、腎、胰、肌胃、腺胃、視丘、大腦和小腦組織樣總RNA提取，微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及OD值（每個(gè)樣品3次重復(fù)）。將啄羽番鴨與正常番鴨不同組織RNA濃度分別定量至500 ng/μL，然后根據(jù)康為世紀(jì)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第1鏈。轉(zhuǎn)錄步驟為：①將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、5×RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free water溶解，并置于冰上；②配制反應(yīng)體系，總體積30 μL：dNTP Mix 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA模板2 μL，RNase-Free water 30 μL；③70℃孵育10 min，迅速冰浴2 min；④短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底；⑤繼續(xù)向以上反應(yīng)體系中加入試劑：5×RT Buffer 4 μL，DTT 2 μL，HiFiScript 1 μL；⑥42℃孵育40 min，85℃孵育5 min；⑦反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。轉(zhuǎn)錄完成后，取1 μL反應(yīng)產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，-20℃保存，備用。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增條件優(yōu)化 參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的鴨、基因的mRNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)、基因的熒光定量引物。熒光定量?jī)?nèi)參基因?yàn)椋蜕虾Ｉど锕こ坦煞萦邢薰竞铣?，?nèi)參、引物信息見(jiàn)表1。

表1 SLC12A9、GNG2基因熒光引物序列、退火溫度及目的片段大小

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采取SYBR GreenⅠ嵌合熒光法對(duì)、基因在正常番鴨11個(gè)組織樣中的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量分析。熒光染料購(gòu)自北京康為試劑生物科技有限公司。熒光定量PCR儀采用的系統(tǒng)為BIO-RAD CFX massage，反應(yīng)體系為：2×Ultra SYBR Mixture 5 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，cDNA 1 ng/μL，ddHO補(bǔ)足10 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，61℃（）/62℃（）退火30 s，68℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃變性5 s；最后由機(jī)器自動(dòng)設(shè)置（基礎(chǔ)溫度60℃，每5 s增加0.5℃擴(kuò)增至95℃）進(jìn)行熔解曲線收集。

1.4.4 熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì) 運(yùn)用2法算出、基因在各組織的表達(dá)量。計(jì)算公式：?Ct=基因的cq值-對(duì)應(yīng)樣品內(nèi)參的cq值，??Ct=?Ct值-第1個(gè)?Ct值，2=2^-??Ct值，AVERAGE為2值通過(guò)平均值函數(shù)求得，STDEVP為根據(jù)2值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)差函數(shù)求得；數(shù)據(jù)的差異顯著性利用SPASS軟件比較，最后利用GraphPad Prism v8.0.2.263軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取檢測(cè) 從健康番鴨的11個(gè)組織中提取總RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定，各樣品總RNA的OD/OD都 在1.80～2.01之 間，OD/OD的值均在2.0以上，且各組織樣最大吸收峰值均在260 nm處，說(shuō)明提取的組織樣總RNA純度良好，無(wú)蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)污染，符合進(jìn)行熒光定量PCR的要求。

2.2 普通PCR檢測(cè)、基因 利用上述1.4設(shè)計(jì)的、基因以及鴨內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增引物，分別對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，驗(yàn)證獲得目的條帶的正確性。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果表示：擴(kuò)增的目的產(chǎn)物條帶透明、引物二聚體極弱、特異性好，長(zhǎng)度分別為139 bp、122 bp，與預(yù)估目的片段大致相同，可進(jìn)行下一步熒光定量表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。

圖1 SLC12A9基因的PCR擴(kuò)增圖片

圖2 GNG2基因的PCR擴(kuò)增圖片

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)、基因在番鴨各組織的表達(dá)差異分析 由圖3可知，基因在番鴨心、肝、脾、肺、腎、胰、肌胃、腺胃、視丘、大腦和小腦11個(gè)組織中均有表達(dá)，表達(dá)量依次為：心>胰>肝>視丘>小腦>腺胃>脾>腎>肺>大腦>肌胃，具有最高表達(dá)量的組織為心臟，極顯著高于其他組織，在肌胃中的mRNA表達(dá)量最低（<0.01）。

圖3 SLC12A9基因在番鴨各組織間的表達(dá)情況

由圖4可知，基因在正常番鴨的肌胃、心臟、肺臟、腎臟、肝臟、腺胃、胰臟、大腦、小腦、視丘、脾11個(gè)組織樣中均有表達(dá)，小腦與視丘中的mRNA表達(dá)量極顯著高于大腦、心、肝、脾、肺、腎、肌胃、腺胃、胰組織，且小腦與視丘之間差異不顯著；基因在番鴨各組織中的mRNA表達(dá)量依次為：小腦>視丘>大腦>胰>脾>肺>心>肝>腺胃>腎>肌胃；基因在小腦與視丘的mRNA表達(dá)量極顯著高于大腦，且小腦、視丘與大腦均極顯著高于另外8個(gè)組織，在肌胃組織的mRNA表達(dá)量最低（<0.01）。

圖4 GNG2基因在番鴨各組織間的表達(dá)情況

2.4、基因在啄羽番鴨與正常番鴨大腦組織的表達(dá)差異分析 由圖5可知，基因在FP番鴨群體與正常番鴨群體的大腦組織中均有表達(dá)，正常3組番鴨的mRNA表達(dá)量最高，極顯著高于其他5組，且基因在啄羽1、啄羽2、啄羽3及正常2組番鴨大腦組織的mRNA表達(dá)量顯著高于正常1組；基因在不同組的mRNA表達(dá)量依次為正常3>啄羽3>正常2>啄羽2>啄羽1>正常1。

圖5 SLC12A9基因在啄羽番鴨與正常番鴨大腦組織的表達(dá)情況

由圖6可知，基因在啄羽番鴨與正常番鴨的大腦組織中均有表達(dá)，且基因在啄羽3組的mRNA表達(dá)量極顯著高于其余5組；并且這5組之間基因在大腦組織的mRNA表達(dá)量不存在顯著差異；各組的mRNA表達(dá)量依次為：啄羽3>正常1>正常3>啄羽1>啄羽2>正常2。

圖6 GNG2基因在啄羽番鴨與正常番鴨大腦組織的表達(dá)情況

3 討 論

3.1基因在番鴨不同組織的表達(dá)情況及對(duì)啄羽行為的影響 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定基因在正常番鴨各組織的表達(dá)情況，結(jié)果表明基因在正常番鴨的心臟組織具有最高表達(dá)量，與Hebert等人在人類(lèi)疾病研究中得到基因家族主要位于心臟、腎臟的結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)觀察具有啄羽行為的番鴨與正常番鴨的大腦組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，分析基因在啄羽番鴨與正常番鴨的表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)基因在啄羽番鴨與正常番鴨的大腦組織表達(dá)量具有顯著差異，與Lutz等人應(yīng)用GWAS技術(shù)在高度啄羽雞和低度啄羽雞的大腦中發(fā)現(xiàn)基因可能與啄羽和攻擊行為有關(guān)的結(jié)果相似。另外，Gagnon等人通過(guò)建立小鼠模型探究基因家族對(duì)人類(lèi)疾病的影響中發(fā)現(xiàn)，基因家族的缺乏會(huì)引起小鼠的神經(jīng)元興奮、手足癲癇等疾病，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)中基因在正常番鴨個(gè)體出現(xiàn)最高表達(dá)量，表明基因與番鴨啄羽行為可能呈反比關(guān)系，Van等人研究表示基因家族可能具有神經(jīng)元保護(hù)作用。但本實(shí)驗(yàn)中其他正常番鴨個(gè)體的大腦基因表達(dá)量沒(méi)有顯著高于啄羽番鴨，可能是樣本的選擇誤差，也可能是在處于啄羽的潛伏期，還沒(méi)有表現(xiàn)出啄羽行為。其中原因需要進(jìn)一步探究。

3.2基因在番鴨不同組織的表達(dá)情況及對(duì)啄羽行為的影響 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定基因在正常番鴨各組織的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因幾乎在正常番鴨的腦組織進(jìn)行表達(dá)，其中在小腦的表達(dá)量最高。分析基因在啄羽番鴨與正常番鴨的表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)基因在啄羽番鴨與正常番鴨的大腦組織表達(dá)量具有顯著差異，與Lutz等人應(yīng)用GWAS技術(shù)檢測(cè)的8個(gè)基因在高度啄羽行為雞和低度啄羽行為雞大腦中的不同表達(dá)結(jié)果相似，證明候選基因可能與啄羽和攻擊行為有關(guān)。秦洪猛等人研究表示基因的沉默會(huì)改善大鼠的認(rèn)知功能，認(rèn)知損害通常被認(rèn)為是神經(jīng)變性疾病的表現(xiàn)。在早些年的一項(xiàng)研究中，GNG2蛋白已被確定為大鼠體內(nèi)的一種特異性幽閉標(biāo)志，表明基因可能與動(dòng)物精神疾病相關(guān)。與本實(shí)驗(yàn)基因在啄羽番鴨個(gè)體出現(xiàn)最高表達(dá)量、基因與番鴨啄羽行為可能呈正相關(guān)的結(jié)果相似。但本實(shí)驗(yàn)中其他啄羽番鴨個(gè)體的大腦基因表達(dá)量沒(méi)有顯著高于正常番鴨，可能是因?yàn)闃颖咎暨x的誤差，也可能是啄羽1、2號(hào)番鴨的啄羽癥狀較輕，正處于改善時(shí)期，其中原因需進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，表明、基因在正常番鴨各組織均有表達(dá)，基因在心臟的表達(dá)量最高，基因則在小腦組織的表達(dá)量最高；實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明，、基因均在正常番鴨與啄羽番鴨大腦組織表達(dá)，且基因可能與番鴨啄羽行為呈負(fù)相關(guān)，基因可能與番鴨啄羽行為呈正相關(guān)。本研究為在分子遺傳方向進(jìn)一步進(jìn)行家禽啄羽行為的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。