王 姣，羅林麗，張 蕓，祝永才，楊嬌一，廖富友，姚炳濃，楊勝林*

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展中心，貴州貴陽 550025）

番鴨體型碩大，身軀長、略扁，前后窄、中間寬，呈紡錘形；具有生長快、耐粗飼、易育肥、瘦肉率高、肉質(zhì)鮮美等特點，是優(yōu)質(zhì)肉鴨品種。家禽的啄羽（FP，F(xiàn)eather Pecking）行為對羽毛的損失、皮膚傷害和死亡負有責任，因此，F(xiàn)P既是一個主要的福利問題，也是經(jīng)濟損失的原因。FP行為在學(xué)術(shù)界有3種理解：一種理解為重定向采食行為，受中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）和多巴胺（DA）的調(diào)控；另一種理解為適應(yīng)不良行為，與動物生存環(huán)境相關(guān)；還有一種理解為病理學(xué)行為，與環(huán)境無關(guān)，主要受遺傳因素的影響。有研究表明，啄食羽毛的潛在動機是吃羽毛，或者這是一般多動癥的結(jié)果。Lutz等人應(yīng)用GWAS技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因和可能與啄羽和攻擊行為有關(guān)。

溶質(zhì)載體家族12成員9（Solute Carrier Family 12 Member 9，）基因?qū)儆诰幋a電子中性陽離子-氯離子轉(zhuǎn)運蛋白的9個基因家族之一。雖然該基因的功能尚不清楚，但已知其他SLC12轉(zhuǎn)運蛋白在控制電化學(xué)氯離子梯度方面至關(guān)重要，且家庭成員之間的氨基酸相似性在19%～76%之間?；蚣易逡恍┏蓡T的缺乏通常會讓小鼠患上巴特氏綜合征、吉特曼綜合征、胼胝體、周圍神經(jīng)病、癲癇等疾病。G蛋白Y2亞基（G protein Subunit Gamma 2，）屬于c亞單位的亞家族II。被確定為一種特定的大鼠幽閉標志，盡管幽閉狀態(tài)的功能意義目前未知，但它的位置和神經(jīng)聯(lián)系表明，它可能在整合構(gòu)成意識感知基礎(chǔ)的信息中發(fā)揮作用。

本研究擬通過對、基因在番鴨不同組織的差異表達分析，以及對具有啄羽行為的番鴨大腦組織進行、基因?qū)崟r熒光定量，比較2個基因的表達差異，探究、基因與番鴨啄羽行為是否相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集 實驗選取正常與啄羽6月齡的番鴨共27只，置于貴州大學(xué)養(yǎng)殖場內(nèi)進行行為學(xué)觀察。實驗動物均勻分為9組，每組3個重復(fù)。鴨籠為1.5 m×1.5 m×0.7 m（飼養(yǎng)方式為平養(yǎng)，以排除空間等因素對番鴨行為的影響）。飼喂期間，日糧營養(yǎng)充沛，自由采食、飲水，按期清掃鴨舍內(nèi)的衛(wèi)生，按期清理糞便、消毒，保證鴨舍內(nèi)飼養(yǎng)環(huán)境優(yōu)良。挑選無FP行為的番鴨3組，采集心、肝、脾、肺、腎、胰、肌胃、腺胃、視丘、大腦和小腦的組織樣品共11個，再挑選出具有FP行為與無FP行為的番鴨各3組采集大腦組織，放進凍存管中并貯存于-80℃。

1.2 主要儀器 紫外可見分光光度計、電泳儀（DYY-2C型）、PCR擴增儀（C1000Touch）、實時熒光定量PCR儀（型號為CFX96 Real-Time System）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hool ll）、-80℃冰箱、-20℃冰箱、4℃冰箱、超凈工作臺。

1.3 主要試劑 RNA提取劑Trizol、液氮（-196℃）、三氯甲烷、0.5×TAE緩沖液、異丙醇、75%乙醇、瓊脂糖；熒光定量試劑2×Ts Master qRT-PCR Mix購自擎科生物科技有限公司；cDNA第1鏈合成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用HiFiScript cDNA Synthesis Kit（康為世紀）。

1.4 實驗方法

1.4.1 組織樣總RNA提取及cDNA合成 實驗采用Trizol法進行心、肝、脾、肺、腎、胰、肌胃、腺胃、視丘、大腦和小腦組織樣總RNA提取，微量紫外分光光度計測定濃度及OD值（每個樣品3次重復(fù)）。將啄羽番鴨與正常番鴨不同組織RNA濃度分別定量至500 ng/μL，然后根據(jù)康為世紀試劑盒說明書步驟進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第1鏈。轉(zhuǎn)錄步驟為：①將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、5×RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free water溶解，并置于冰上；②配制反應(yīng)體系，總體積30 μL：dNTP Mix 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA模板2 μL，RNase-Free water 30 μL；③70℃孵育10 min，迅速冰浴2 min；④短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底；⑤繼續(xù)向以上反應(yīng)體系中加入試劑：5×RT Buffer 4 μL，DTT 2 μL，HiFiScript 1 μL；⑥42℃孵育40 min，85℃孵育5 min；⑦反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。轉(zhuǎn)錄完成后，取1 μL反應(yīng)產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計進行濃度和純度檢測，-20℃保存，備用。

1.4.2 引物設(shè)計與擴增條件優(yōu)化 參照NCBI數(shù)據(jù)庫中的鴨、基因的mRNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計、基因的熒光定量引物。熒光定量內(nèi)參基因為，送上海生工生物工程股份有限公司合成，內(nèi)參、引物信息見表1。

表1 SLC12A9、GNG2基因熒光引物序列、退火溫度及目的片段大小

1.4.3 實時熒光定量PCR 采取SYBR GreenⅠ嵌合熒光法對、基因在正常番鴨11個組織樣中的表達進行實時熒光相對定量分析。熒光染料購自北京康為試劑生物科技有限公司。熒光定量PCR儀采用的系統(tǒng)為BIO-RAD CFX massage，反應(yīng)體系為：2×Ultra SYBR Mixture 5 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL，cDNA 1 ng/μL，ddHO補足10 μL。擴增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，61℃（）/62℃（）退火30 s，68℃延伸30 s，40個循環(huán)；95℃變性5 s；最后由機器自動設(shè)置（基礎(chǔ)溫度60℃，每5 s增加0.5℃擴增至95℃）進行熔解曲線收集。

1.4.4 熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計 運用2法算出、基因在各組織的表達量。計算公式：?Ct=基因的cq值-對應(yīng)樣品內(nèi)參的cq值，??Ct=?Ct值-第1個?Ct值，2=2^-??Ct值，AVERAGE為2值通過平均值函數(shù)求得，STDEVP為根據(jù)2值通過標準差函數(shù)求得；數(shù)據(jù)的差異顯著性利用SPASS軟件比較，最后利用GraphPad Prism v8.0.2.263軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取檢測 從健康番鴨的11個組織中提取總RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計測定，各樣品總RNA的OD/OD都 在1.80～2.01之 間，OD/OD的值均在2.0以上，且各組織樣最大吸收峰值均在260 nm處，說明提取的組織樣總RNA純度良好，無蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)污染，符合進行熒光定量PCR的要求。

2.2 普通PCR檢測、基因 利用上述1.4設(shè)計的、基因以及鴨內(nèi)參基因熒光定量PCR擴增引物，分別對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進行普通PCR擴增，擴增的產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，驗證獲得目的條帶的正確性。電泳結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果表示：擴增的目的產(chǎn)物條帶透明、引物二聚體極弱、特異性好，長度分別為139 bp、122 bp，與預(yù)估目的片段大致相同，可進行下一步熒光定量表達分析實驗。

圖1 SLC12A9基因的PCR擴增圖片

圖2 GNG2基因的PCR擴增圖片

2.3 熒光定量PCR檢測、基因在番鴨各組織的表達差異分析 由圖3可知，基因在番鴨心、肝、脾、肺、腎、胰、肌胃、腺胃、視丘、大腦和小腦11個組織中均有表達，表達量依次為：心>胰>肝>視丘>小腦>腺胃>脾>腎>肺>大腦>肌胃，具有最高表達量的組織為心臟，極顯著高于其他組織，在肌胃中的mRNA表達量最低（<0.01）。

圖3 SLC12A9基因在番鴨各組織間的表達情況

由圖4可知，基因在正常番鴨的肌胃、心臟、肺臟、腎臟、肝臟、腺胃、胰臟、大腦、小腦、視丘、脾11個組織樣中均有表達，小腦與視丘中的mRNA表達量極顯著高于大腦、心、肝、脾、肺、腎、肌胃、腺胃、胰組織，且小腦與視丘之間差異不顯著；基因在番鴨各組織中的mRNA表達量依次為：小腦>視丘>大腦>胰>脾>肺>心>肝>腺胃>腎>肌胃；基因在小腦與視丘的mRNA表達量極顯著高于大腦，且小腦、視丘與大腦均極顯著高于另外8個組織，在肌胃組織的mRNA表達量最低（<0.01）。

圖4 GNG2基因在番鴨各組織間的表達情況

2.4、基因在啄羽番鴨與正常番鴨大腦組織的表達差異分析 由圖5可知，基因在FP番鴨群體與正常番鴨群體的大腦組織中均有表達，正常3組番鴨的mRNA表達量最高，極顯著高于其他5組，且基因在啄羽1、啄羽2、啄羽3及正常2組番鴨大腦組織的mRNA表達量顯著高于正常1組；基因在不同組的mRNA表達量依次為正常3>啄羽3>正常2>啄羽2>啄羽1>正常1。

圖5 SLC12A9基因在啄羽番鴨與正常番鴨大腦組織的表達情況

由圖6可知，基因在啄羽番鴨與正常番鴨的大腦組織中均有表達，且基因在啄羽3組的mRNA表達量極顯著高于其余5組；并且這5組之間基因在大腦組織的mRNA表達量不存在顯著差異；各組的mRNA表達量依次為：啄羽3>正常1>正常3>啄羽1>啄羽2>正常2。

圖6 GNG2基因在啄羽番鴨與正常番鴨大腦組織的表達情況

3 討 論

3.1基因在番鴨不同組織的表達情況及對啄羽行為的影響 本實驗通過實時熒光定量測定基因在正常番鴨各組織的表達情況，結(jié)果表明基因在正常番鴨的心臟組織具有最高表達量，與Hebert等人在人類疾病研究中得到基因家族主要位于心臟、腎臟的結(jié)果相似。本實驗將通過觀察具有啄羽行為的番鴨與正常番鴨的大腦組織進行實時熒光定量，分析基因在啄羽番鴨與正常番鴨的表達量差異，發(fā)現(xiàn)基因在啄羽番鴨與正常番鴨的大腦組織表達量具有顯著差異，與Lutz等人應(yīng)用GWAS技術(shù)在高度啄羽雞和低度啄羽雞的大腦中發(fā)現(xiàn)基因可能與啄羽和攻擊行為有關(guān)的結(jié)果相似。另外，Gagnon等人通過建立小鼠模型探究基因家族對人類疾病的影響中發(fā)現(xiàn)，基因家族的缺乏會引起小鼠的神經(jīng)元興奮、手足癲癇等疾病，與本實驗結(jié)果相似。本實驗中基因在正常番鴨個體出現(xiàn)最高表達量，表明基因與番鴨啄羽行為可能呈反比關(guān)系，Van等人研究表示基因家族可能具有神經(jīng)元保護作用。但本實驗中其他正常番鴨個體的大腦基因表達量沒有顯著高于啄羽番鴨，可能是樣本的選擇誤差，也可能是在處于啄羽的潛伏期，還沒有表現(xiàn)出啄羽行為。其中原因需要進一步探究。

3.2基因在番鴨不同組織的表達情況及對啄羽行為的影響 通過實時熒光定量測定基因在正常番鴨各組織的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因幾乎在正常番鴨的腦組織進行表達，其中在小腦的表達量最高。分析基因在啄羽番鴨與正常番鴨的表達量差異，發(fā)現(xiàn)基因在啄羽番鴨與正常番鴨的大腦組織表達量具有顯著差異，與Lutz等人應(yīng)用GWAS技術(shù)檢測的8個基因在高度啄羽行為雞和低度啄羽行為雞大腦中的不同表達結(jié)果相似，證明候選基因可能與啄羽和攻擊行為有關(guān)。秦洪猛等人研究表示基因的沉默會改善大鼠的認知功能，認知損害通常被認為是神經(jīng)變性疾病的表現(xiàn)。在早些年的一項研究中，GNG2蛋白已被確定為大鼠體內(nèi)的一種特異性幽閉標志，表明基因可能與動物精神疾病相關(guān)。與本實驗基因在啄羽番鴨個體出現(xiàn)最高表達量、基因與番鴨啄羽行為可能呈正相關(guān)的結(jié)果相似。但本實驗中其他啄羽番鴨個體的大腦基因表達量沒有顯著高于正常番鴨，可能是因為樣本挑選的誤差，也可能是啄羽1、2號番鴨的啄羽癥狀較輕，正處于改善時期，其中原因需進一步探究。

4 結(jié) 論

通過實時熒光定量檢測，表明、基因在正常番鴨各組織均有表達，基因在心臟的表達量最高，基因則在小腦組織的表達量最高；實時熒光定量分析結(jié)果表明，、基因均在正常番鴨與啄羽番鴨大腦組織表達，且基因可能與番鴨啄羽行為呈負相關(guān)，基因可能與番鴨啄羽行為呈正相關(guān)。本研究為在分子遺傳方向進一步進行家禽啄羽行為的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。