韓 越，李春宇，尹 伊，金 一

（東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002）

外泌體（Exosomes）是一種由細(xì)胞分泌的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，廣泛存在于動(dòng)物血液、卵泡液、尿液、唾液、子宮液和乳汁等各種體液中，其內(nèi)部包含miRNA、mRNA和蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)。外泌體是通過多囊泡內(nèi)體途徑產(chǎn)生的，當(dāng)多囊泡內(nèi)體（MVE）與細(xì)胞表面融合后，外泌體會(huì)通過出芽等方式釋放出來，攜帶這些生物活性物質(zhì)到其他細(xì)胞當(dāng)中發(fā)揮作用，以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息交流。此外，外泌體的囊狀結(jié)構(gòu)還可以保護(hù)其中的內(nèi)含物，比如避免miRNA降解，保持其生物學(xué)穩(wěn)定性，將其有選擇性地運(yùn)送到相應(yīng)的靶細(xì)胞中并調(diào)控相應(yīng)的靶基因。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)外泌體中的內(nèi)含物可以作為卵巢、子宮等疾病的一種診斷標(biāo)志物，且在卵母細(xì)胞正常發(fā)育以及胚胎發(fā)育等方面起到調(diào)控作用。卵泡液是卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟，保持卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要微環(huán)境，目前普遍認(rèn)為分析卵泡液組分可以為卵母細(xì)胞質(zhì)量提供有用的相關(guān)信息，而卵泡液中外泌體作為細(xì)胞間信息傳遞的橋梁，了解其中內(nèi)含物，有利于進(jìn)一步分析和研究卵母細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制。因此本文對卵泡液外泌體在卵母細(xì)胞發(fā)育和胚胎發(fā)育中的研究進(jìn)行了綜述，為進(jìn)一步深入研究外泌體的相關(guān)作用提供參考。

1 外泌體的提取與鑒定

1.1 外泌體的提取方法 外泌體的提取方法包括試劑盒提取法、超速離心法、超濾法、免疫磁珠法和色譜法等。超速離心法是采用低速、高速離心交替進(jìn)行獲取外泌體，該方法目前常與0.22 μm濾過膜結(jié)合使用，是最常見的使用方法，操作方法簡單，可獲得較高純度的外泌體。試劑盒提取法也逐漸開始應(yīng)用，但存在可能混雜其他蛋白的問題。超濾法是利用超濾膜提取外泌體，但純度不高。免疫磁珠法是將包被抗標(biāo)記物（如CD63蛋白）抗體的磁珠與外泌體孵育后結(jié)合獲得外泌體，但不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。色譜法是根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系分離外泌體，但因其需要特殊的設(shè)備所以應(yīng)用較少。

1.2 外泌體的鑒定方法 外泌體的鑒定方法包括透射電子顯微鏡（TEM）、納米粒子跟蹤分析（NAT）和Western印跡等方法。TEM可以直接觀察外泌體的大小和形態(tài)，但不宜進(jìn)行大量快速的檢測。NAT能夠檢測外泌體的粒徑和濃度，但不能區(qū)分外泌體與非外泌體顆粒。Western印跡通過外泌體標(biāo)志蛋白（如CD9、CD63、CD81等）進(jìn)行檢測，但不同來源的外泌體檢測的標(biāo)志物可能不同。目前這3種方法通常聯(lián)合使用。

2 外泌體對卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

2.1 卵泡液外泌體對卵母細(xì)胞發(fā)育的影響 在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，外泌體攜帶各種物質(zhì)進(jìn)入不同細(xì)胞中發(fā)揮作用,來協(xié)調(diào)各種不同細(xì)胞之間的聯(lián)系，從而對卵母細(xì)胞的生長、成熟和排卵有著非常重要的作用。

2.1.1 卵泡液外泌體對顆粒細(xì)胞的影響 最初卵泡中卵母細(xì)胞由單層顆粒細(xì)胞包圍，隨著卵泡生長，顆粒細(xì)胞由單層分裂變?yōu)槎鄬?，?dāng)卵泡腔進(jìn)一步形成，包圍在卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞隆起形成卵丘，稱為卵丘細(xì)胞，緊貼卵泡壁的顆粒細(xì)胞又稱為壁顆粒細(xì)胞，壁顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞參與調(diào)控卵母細(xì)胞成熟的過程。豬卵泡液中大部分的外泌體可能來源于壁顆粒細(xì)胞，也有一部分可能來源于卵巢其他細(xì)胞或者通過血液來源于其他器官的細(xì)胞，卵泡液外泌體中大部分mRNA與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、卵母細(xì)胞成熟及顆粒細(xì)胞增殖（如MAPK-ERK1/2和PI3K-AKT）等信號通路有關(guān)，且外泌體能夠被顆粒細(xì)胞（即壁顆粒細(xì)胞）和卵丘細(xì)胞攝取，改變與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因（如和等）的表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，但不能有效誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)張。Rodrigues，Hung和丁強(qiáng)研究表明，牛和山羊小卵泡液外泌體更有利于顆粒細(xì)胞增殖，而且不同大小卵泡卵泡液外泌體都能夠誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)張，牛卵泡液外泌體還能夠減少熱休克對卵裂和胚泡發(fā)育的消極影響。這種差異可能是由于物種或者培養(yǎng)條件不同所致，具體原因還有待研究。以上研究說明卵泡液中的外泌體有利于顆粒細(xì)胞增殖，雖然對卵丘擴(kuò)張的研究結(jié)果不一致，但顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間存在縫隙連接，所以外泌體可能通過進(jìn)入顆粒細(xì)胞調(diào)節(jié)其中成分從而調(diào)控卵母細(xì)胞的發(fā)育。

2.1.2 不同階段卵泡液外泌體對卵母細(xì)胞發(fā)育的影響不同階段卵泡卵泡液在培養(yǎng)卵母細(xì)胞中表現(xiàn)出不同效果，可能與其中所含物質(zhì)不同有關(guān)，研究其中的差異物質(zhì)可以為卵母細(xì)胞發(fā)育提供參考。在豬中不同直徑卵泡卵泡液外泌體miRNA的表達(dá)具有差異，且與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的差異miRNA的靶基因主要與TGF-等信號通路有關(guān)，其中1～2 mm 小腔卵泡卵泡液（SFF）可提高卵母細(xì)胞直徑、H4K12乙酰化水平和囊胚率，而外泌體耗竭的情況下抵消了這種增長效果，但囊胚率的減少?zèng)]有顯著變化；miR-17b、-92a、-145是從豬大、小卵泡卵泡液外泌體差異miRNA中篩選出的與卵母細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)的外泌體miRNA，miR-92a有利于卵母細(xì)胞直徑增大，增強(qiáng)了H4K12乙酰化水平，miR-17b、-92a、-145增強(qiáng)了染色質(zhì)凝聚，miR-17b、-92a還提高了體外成熟和激活后囊胚期發(fā)育速度。同樣馬不同卵泡期卵泡液外泌體miRNA也存在差異且主要靶向通路也為TGF-通路。相關(guān)研究表明相比于牛4～8 mm完全生長卵母細(xì)胞卵泡液外泌體miRNA，在生長卵母細(xì)胞組外泌體中上調(diào)的miRNA參與泛素介導(dǎo)通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、MAPK信號通路和TGF-信號通路等，這些通路都與卵母細(xì)胞分裂、生長成熟有關(guān)。牛3～6 mm卵泡卵泡液外泌體可以顯著提高囊胚率。另外胡頲還發(fā)現(xiàn)人卵泡液外泌體是影響妊娠的一個(gè)因素。以上研究表明在不同階段卵泡液外泌體中的內(nèi)含物是有差別的，這可能就是不同大小卵泡卵泡液培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)成熟率或者囊胚率存在差異的原因之一。而且在培養(yǎng)過程中單獨(dú)添加外泌體miRNA可以提高卵母細(xì)胞發(fā)育情況，但miRNA對應(yīng)靶基因不同且數(shù)量龐大，所以miRNA的具體作用還有待進(jìn)一步研究。

2.1.3 卵泡液外泌體對卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響 卵母細(xì)胞質(zhì)量直接影響隨后的排卵、受精、著床和胚胎發(fā)育等關(guān)鍵階段。年齡和疾病是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的主要因素，因此研究不同年齡、不同健康程度雌性動(dòng)物卵泡液中外泌體將有利于為選育優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞提供參考。不同年齡馬的卵泡液外泌體miRNA存在差異，其中在老年母馬中差異高表達(dá)的3個(gè)miRNA（miRNA-181a、miRNA-375和miRNA-513a-3p）的靶向通路是TGF-信號通路，而且在年輕母馬中存在抑制素和抑制素-A鏈前體蛋白。這說明外泌體中內(nèi)含物與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)，在老年母馬中差異表達(dá)的miRNA還可以作為研究卵母細(xì)胞質(zhì)量的標(biāo)志物。人卵母細(xì)胞質(zhì)量優(yōu)良和卵母細(xì)胞質(zhì)量不良卵泡液外泌體的差異miRNA在之前的研究中已有部分表明與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)，如miRNA-505-3P過表達(dá)導(dǎo)致卵巢成熟延遲、生育力退化；miRNA-320e過表達(dá)會(huì)抑制顆粒細(xì)胞增殖，影響卵泡發(fā)育；miRNA-1303過表達(dá)與卵巢衰老有關(guān)，而其余microRNA雖然目前研究尚少，但其在卵母細(xì)胞質(zhì)量不良卵泡液外泌體中的高表達(dá)也說明其可能與卵母細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)。多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種女性常見內(nèi)分泌紊亂性疾病，損傷卵泡內(nèi)環(huán)境，表現(xiàn)出排卵障礙等問題。相關(guān)研究表明與非PCOS者相比，在PCOS患者的卵泡液外泌體中存在差異miRNA，而且之前的一些研究中也表明其中的差異miRNA-486-5p與顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)，miRNA-16-5P與卵巢排卵有關(guān)。連一凱等研究顯示非編碼RNA與顆粒細(xì)胞增殖、卵泡閉鎖和卵泡發(fā)育有關(guān)。卵巢儲(chǔ)備功能下降（DOR）目前也是女性生育能力下降的主要因素。與正常卵巢功能組相比，DOR組卵泡液外泌體中差異表達(dá)miRNA的靶基因參與了cAMP和MAPK等通路，而這些通路與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)。PCOS和DOR會(huì)使卵母細(xì)胞受損、影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，而上述對健康人員和患者卵泡液外泌體進(jìn)行的研究也發(fā)現(xiàn)存在與卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)miRNA的差異表達(dá)，因此分析這些miRNA不僅能提高卵母細(xì)胞發(fā)育情況，還能夠?yàn)榧膊〉难芯刻峁┬路较颉?/p>

2.2 其他來源外泌體對卵母細(xì)胞發(fā)育的影響 卵泡液對卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要，但其他來源的外泌體也能夠影響卵母細(xì)胞發(fā)育。狗輸卵管細(xì)胞來源外泌體能夠通過EGFR/MAPK信號通路（細(xì)胞發(fā)育的重要性途徑）有效地改善其卵丘細(xì)胞的生理作用。人羊水干細(xì)胞外泌體（hAFSc-EXO）能夠改善化療導(dǎo)致的大鼠顆粒細(xì)胞損傷。小鼠羊水干細(xì)胞外泌體（AFSc-EXO）、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(HucMSC-exos)和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hAMSC）外泌體均對小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育有影響，其中小鼠AFSc-EXO中高豐富的miRNA-10a有利于防止受損傷的顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖，HucMSC-exos有利于提高老年小鼠卵母細(xì)胞的產(chǎn)量和質(zhì)量，hAMSC-exos的miR-320介導(dǎo)SIRT4信號傳導(dǎo)對卵巢功能的影響中起著關(guān)鍵作用。卵泡液中外泌體可能不單單來源于卵巢顆粒細(xì)胞的分泌，還有通過血液循環(huán)進(jìn)入的其他來源外泌體，但這些具體來源還有待研究，因此對不同來源外泌體的研究將為進(jìn)一步研究影響卵母細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)提供參考。

3 外泌體對胚胎發(fā)育的影響

最近的研究表明，在胚胎發(fā)育以及胚胎植入過程中，外泌體可以參與胚胎與母體組織之間的復(fù)雜通訊，在胚胎發(fā)育發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的作用。

3.1 不同妊娠狀態(tài)外泌體對胚胎發(fā)育的影響 人血漿外泌體濃度隨著妊娠的進(jìn)展而增加，且在妊娠期間存在胎盤源外泌體，外泌體胎盤堿性磷酸酶（PLAP）比率在妊娠早期和妊娠中期相似，在妊娠晚期下降，但也發(fā)現(xiàn)外泌體PLAP比率在妊娠期間呈現(xiàn)上升趨勢。這可能是由于在血漿中分離的外泌體大小不等所造成的。Menon提取血漿外泌體，檢測到了<50 nm、50～150 nm、150～200 nm和>200 nm囊泡的濃度，其中只有50～150 nm囊泡濃度持續(xù)上升，這說明外泌體提取方法還有待改進(jìn)，而且不同大小囊泡可能有不同作用。在奶牛血漿中也發(fā)現(xiàn)了外泌體和胎盤源外泌體濃度一直呈現(xiàn)上升的趨勢，而且在妊娠不同階段血漿外泌體中存在差異miRNA，與未妊娠相比，在妊娠早期高表達(dá)的miRNA參與NF-κB等免疫炎癥信號通路，其中miR-499能提高let-7水平抑制NF-kB信號通路從而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，而子宮免疫微環(huán)境對于胚胎發(fā)育是必須的。相對于未妊娠山羊來說，妊娠山羊血漿外泌體中存在特意ssa-miR-137-3p和novel miR-736等，這些差異miRNA的靶基因富集在Notch、Wnt和Hippo等與胚胎發(fā)育相關(guān)的信號通路。以上研究說明在不同物種不同妊娠階段都存在胚胎源外泌體，且胚胎源外泌體在妊娠階段聯(lián)合母體產(chǎn)生的外泌體為胚胎發(fā)育提供適宜的環(huán)境是不可或缺的。同時(shí)在妊娠階段特意表達(dá)的外泌體miRNA或許可以作為診斷妊娠的一個(gè)指標(biāo)。

3.2 外泌體對胚胎生長和著床的影響 滋養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎植入過程中發(fā)揮著非常重要的作用，能夠分泌一系列細(xì)胞因子和激素使得胚胎對子宮內(nèi)膜發(fā)生黏附和侵入。牛、羊、豬和人的子宮腔液中均含有外泌體?；加凶訉m內(nèi)膜炎牛的子宮腔液中分離出的外泌體會(huì)降低囊胚發(fā)育率，而且子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞衍生(EECs)的外泌體有利于滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和發(fā)育，外泌體的miR-218能夠恢復(fù)子宮內(nèi)膜炎導(dǎo)致的和基因表達(dá)降低，從而對滋養(yǎng)層細(xì)胞造成影響。在牛胚胎體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)更換胚胎培養(yǎng)液會(huì)導(dǎo)致胚胎產(chǎn)生的外泌體丟失，從而影響內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞分化影響胚胎發(fā)育，相反不換液或者再換液時(shí)添加胚胎源外泌體將有利于胚胎后續(xù)發(fā)育。人EEc外泌體miRNA可通過小鼠滋養(yǎng)外胚層進(jìn)入胚胎中，且經(jīng)外泌體的miR-30 d處理后胚胎中與細(xì)胞粘附等相關(guān)的基因（如ITGB3和ITGA7）表達(dá)升高，增加了胚胎黏附能力，有利于胚胎的生長與著床。使用低分子量肝素（LMWH）處理人滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠改變其外泌體miR-18a-3p的含量，進(jìn)而影響濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）的功能，對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）患者提供幫助。還有研究表明羊子宮液外泌體能夠進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層，提高增殖基因，促進(jìn)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖。豬子宮腔液外泌體的miR-125b可調(diào)控胚胎發(fā)育和著床過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)。以上研究說明在胚胎發(fā)育過程中外泌體的存在是尤為重要的，不僅有利于胚胎著床，還有利于胚胎發(fā)育到足月生產(chǎn)。

3 小 結(jié)

隨著研究人員對外泌體認(rèn)知的深入與研究的展開，發(fā)現(xiàn)外泌體對卵母細(xì)胞成熟、顆粒細(xì)胞增殖、受精和胚胎發(fā)育等都具有重要的影響，但具體外泌體所攜帶物質(zhì)的作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。比如外泌體的具體來源尚未明確；外泌體中mRNA和蛋白等其他成分的研究不足；外泌體miRNA與靶基因之間的驗(yàn)證及機(jī)理等研究不充分?？偟膩碚f，外泌體對于維持機(jī)體各方面功能至關(guān)重要，未來需深入研究其作用機(jī)理，以期深入了解家畜繁殖性能，促進(jìn)畜牧進(jìn)一步發(fā)展。