閻來慶，劉雪凝，劉巧香，劉國世*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.北京首農(nóng)食品集團有限公司，北京 100028）

20世紀(jì)80年代末，世界首例完全通過體外受精和體外胚胎發(fā)育的牛獲得成功。隨著科學(xué)家們對牛配子和胚胎在體外生產(chǎn)的進一步研究和理解，牛體外胚胎生產(chǎn)（IVP）技術(shù)取得重大進展。根據(jù)國際胚胎移植協(xié)會（http://www.iets.orgCommittees/Data-Retrieval-Committee）最新發(fā)布的數(shù)據(jù)，2001年以來全世界移植IVP數(shù)量逐年增加，且在2016年移植體外生產(chǎn)胚胎的數(shù)量超過了移植體內(nèi)生產(chǎn)胚胎（IVD），表明牛場胚胎生產(chǎn)正在從傳統(tǒng)的IVD向IVP轉(zhuǎn)變。

在體外胚胎生產(chǎn)過程中，卵母細胞體外成熟、受精（與精子共孵育）、胚胎發(fā)育和冷凍保存等都是在高氧環(huán)境下進行，配子和胚胎的微環(huán)境發(fā)生巨大變化，這直接影響到它們的功能和生存能力。褪黑素可以改善體外培養(yǎng)微環(huán)境并且中和引起細胞損傷的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），降低脂質(zhì)過氧化物濃度和DNA損傷，從而提高生殖細胞和胚胎細胞的活力，可在牛胚胎體外生產(chǎn)中發(fā)揮積極作用。本文對褪黑素在牛胚胎體外生產(chǎn)和保存中的作用進行綜述，以期為后續(xù)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)化研究和推廣應(yīng)用提供參考。

1 褪黑素在牛卵母細胞體外成熟中的作用

卵母細胞成熟包括發(fā)育中卵子的核和胞質(zhì)成熟。卵母細胞核成熟是指在排卵時從第一次減數(shù)分裂前期到第2次減數(shù)分裂中期（MII）的減數(shù)分裂過程。隨著核成熟，卵母細胞內(nèi)細胞器、蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本發(fā)生一系列變化，進而達到卵母細胞質(zhì)成熟。在體外條件下，牛卵母細胞通常會在20～24 h完成核成熟到MII。

哺乳動物卵巢中存在褪黑素的膜受體和核受體，褪黑素在卵巢中的某些作用可能與膜受體有關(guān)。這些受體也存在于顆粒細胞和卵泡膜細胞中，表明褪黑素可直接作用于卵巢細胞，并調(diào)節(jié)卵巢相關(guān)生理活動。褪黑素膜受體mRNAs也存在于牛卵母細胞和牛卵丘細胞中，并對卵母細胞質(zhì)和核的成熟有積極影響。

在體外成熟過程中，氧化應(yīng)激是造成卵母細胞損傷的主要原因之一。體外處理過程中，卵母細胞長時間暴露在光線下，環(huán)境氧氣濃度升高可導(dǎo)致ROS增加。研究發(fā)現(xiàn)在體外成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素可以顯著降低牛卵母細胞的ROS水平，并促進牛卵母細胞的體外成熟。El-Raey等研究發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加10、50 ng/mL褪黑素可促進體外成熟卵母細胞從MI期向MII期的核轉(zhuǎn)變，并且能夠提高卵母細胞胞漿內(nèi)線粒體彌散分布和卵丘細胞擴張的比率，獲得較高的成熟率。Tian等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素受體基因和在卵母細胞、卵丘細胞和顆粒細胞中都有表達，推測褪黑素對卵母細胞成熟的影響是通過受體實現(xiàn)。

褪黑素不但能促進體外牛卵母細胞的成熟，還能夠緩解一些惡劣條件下的卵母細胞體外成熟。褪黑素可以挽救農(nóng)藥百草枯PQ對牛卵母細胞的損傷，通過抑制卵母細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，提高谷胱甘肽GSH和抗氧化相關(guān)基因基因和mRNA水平，使絲裂原活化蛋白激酶信號通路失活，從而使凋亡相關(guān)的mRNA比值發(fā)生有利的變化，從而阻止PQ誘導(dǎo)的細胞凋亡。Yaacobi-Artzi等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過降低ROS水平從而在一定程度上減輕熱休克對牛卵母細胞減數(shù)分裂的影響，雖然熱休克牛卵母細胞發(fā)育的囊胚比例不受褪黑素影響，但線粒體功能相關(guān)基因的表達相對較高。

以上研究表明，無論是在體內(nèi)正常生理條件下，還是在體外應(yīng)激及惡劣條件下，褪黑素對牛卵母細胞成熟都起著積極作用，然而不同條件下褪黑素作用的具體通路和機制還有待進一步研究。

2 褪黑素在牛體外受精過程中的作用

體外成熟完成后，通常對精子進行洗滌和選擇，以去除冷凍液、精漿、碎片和死亡精子，精子與卵母細胞共孵育18～24 h，進行體外受精。牛精液的質(zhì)量和卵母細胞成熟效果對牛胚胎體外受精至關(guān)重要。

褪黑素對牛卵母細胞體外成熟和卵母細胞體外受精起積極作用。在體外受精過程中，皮質(zhì)顆粒（CGs）的胞吐（皮質(zhì)反應(yīng)）是卵母細胞用來防止多精受精的最常見機制之一，CGs的正常分布是確保單精子受精所必需的。Juno蛋白在阻止多精受精方面也起著重要作用。Zhao等研究表明，褪黑素處理組的卵母細胞中CGs的正常分布率更高，表達水平更高，結(jié)果證明褪黑素通過改善細胞器的正常分布，提高細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）和三磷酸腺苷（ATP）水平，增強抗氧化基因表達水平，調(diào)節(jié)受精相關(guān)事件，進而提高受精能力和發(fā)育能力。

精子在體外培養(yǎng)過程中易受氧化應(yīng)激影響，這是因為精子的細胞膜富含多不飽和脂肪酸，對體外培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的ROS很敏感，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化（LPO），接下來產(chǎn)生細胞毒性醛（如丙二醛）等連鎖反應(yīng)。丙二醛可以與蛋白質(zhì)結(jié)合并誘導(dǎo)關(guān)鍵細胞蛋白質(zhì)的氧化修飾，對線粒體功能產(chǎn)生負面影響，并對精子的中段和軸絲結(jié)構(gòu)造成損害。此外，LPO增加和膜功能改變可以通過降低新陳代謝、活力、頂體反應(yīng)、反應(yīng)性和融合能力，以及對精子DNA的氧化損傷從而導(dǎo)致精子功能障礙，這些變化共同導(dǎo)致體外受精能力低下。

孫業(yè)清研究發(fā)現(xiàn)褪黑素處理精子會顯著降低精子細胞內(nèi)的 ROS 水平，質(zhì)膜、線粒體膜和頂體完整的精子比例提高，精液品質(zhì)得到明顯改善。Cheuquemán等報道褪黑素濃度對公牛精子有模式效應(yīng)，在生理濃度下具有獲能調(diào)節(jié)作用和保護作用。隨著牛產(chǎn)業(yè)的逐步發(fā)展，性控精液在牛場繁育過程中扮演者重要角色。褪黑素不但對常規(guī)選擇下的精子起作用，其對性別控制選擇的精液也有著重要作用。Li等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素會顯著降低公牛性別分離精子的ROS水平，提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，抑制磷脂酰絲氨酸外化和丙二醛水平，提高線粒體膜電位?、頂體完整率和受精能力，從而提高體外受精效率。

3 褪黑素在牛早期胚胎發(fā)育中的作用

在體外受精（IVF）后，受精的卵母細胞在體外培養(yǎng) 7 d，20%～40%的受精卵到達囊胚階段。家畜胚胎含有較高含量的脂質(zhì)，在早期胚胎發(fā)育過程中起著重要的能量代謝作用。體外胚胎生產(chǎn)效率較低的原因可能與胚胎暴露在相對較高的氧氣濃度下有關(guān)，這會導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加。ROS的產(chǎn)生被認為是體外胚胎產(chǎn)量低的主要原因，這是由于過量的ROS會與脂質(zhì)相互作用，從而破壞關(guān)鍵的細胞分子，導(dǎo)致膜完整性喪失、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能改變以及核酸損傷。ROS還參與線粒體改變、胚胎阻滯、ATP耗竭和細胞凋亡等進程進而影響胚胎的發(fā)育和著床。

Wang等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素上調(diào)促類固醇基因和表達，促進卵丘-卵母細胞復(fù)合體（COCs）孕酮和雌二醇的分泌；褪黑素通過降低胚胎內(nèi)的ROS水平提高牛的孤雌生殖、雄核胚胎發(fā)育、胚胎卵裂率和桑椹胚、囊胚發(fā)育率。在胚胎體外培養(yǎng)液中添加褪黑素可以促進牛胚胎的體外發(fā)育，上調(diào)牛胚胎發(fā)育過程中抗氧化抗凋亡基因和和發(fā)育相關(guān)重要基因和的表達，同時下調(diào)促凋亡基因和的表達，提高卵裂率和囊胚率。Marques等實驗表明褪黑素處理能提高囊胚發(fā)育效率，減少凋亡細胞數(shù)，增強抗氧化基因和熱休克蛋白HSPB1的表達水平。

褪黑素和AKT（一種絲氨酸/蘇氨酸特異的蛋白激酶）被確定為生殖所必需的幾個細胞過程的調(diào)節(jié)器。El等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以消除AKT抑制劑SH6在牛卵母細胞和胚胎中的抗發(fā)育作用，具體體現(xiàn)在卵裂率和囊胚率的提高以及線粒體形態(tài)的改善；和等成熟、線粒體和卵丘擴張相關(guān)基因表達上調(diào)，相關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)因子和表達下調(diào)。

在明確褪黑素對牛早期胚胎的有益作用后，一些學(xué)者選擇一些更有效的供給褪黑素方式來代替在體外添加。Komninou等研究褪黑素納米膠囊對牛胚胎體外培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)褪黑素脂核納米囊通過下調(diào)和基因的表達，上調(diào)和基因的表達，從而增加胚胎細胞數(shù)，降低細胞凋亡率和活性氧水平，提高胚胎孵化率。

以上研究均證實了褪黑素對牛體外早期胚胎發(fā)育有著重要作用，接下來研究人員轉(zhuǎn)向研究在特殊情況下褪黑素在早期胚胎發(fā)育過程中的作用。Su等將褪黑素添加在體細胞核移植（SCNT）早期胚胎的發(fā)育液中，發(fā)現(xiàn)褪黑素影響凋亡、抗氧化和發(fā)育相關(guān)基因的表達，改變組蛋白H3的K9乙酰化，增加SCNT囊胚的細胞總數(shù)和內(nèi)細胞團細胞數(shù)，減少SCNT胚胎的凋亡和ROS水平，進而提高體細胞核移植牛早期胚胎的妊娠和出生率。Gutiérrez-A?ez等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以改善初情期前的COCs在體外發(fā)育到囊胚的效率，在褪黑素添加后初情期前奶牛COCs的胚胎中胚胎細胞數(shù)達到成年奶牛水平。

4 褪黑素在牛配子和胚胎冷凍中的作用

配子和胚胎冷凍保存是胚胎工程中的重要環(huán)節(jié)，也是動物保種、基因庫建立的必要手段。利用冷凍保存技術(shù)能夠保存珍稀動物品種和優(yōu)良生產(chǎn)性能家畜的遺傳資源，促進轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究方面的發(fā)展，推廣胚胎移植技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。冷凍保存和胚胎移植可以經(jīng)濟、省力地儲存和運輸有價值的遺傳物質(zhì)，在降低疾病風(fēng)險方面也有很大的優(yōu)勢。然而配子和胚胎的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其對低溫十分敏感，配子和胚胎在冷凍解凍過程中也很容易產(chǎn)生ROS和RNS，進而導(dǎo)致配子和胚胎受到氧化應(yīng)激的影響和細胞器的損傷。

精子的存活率、活力和膜完整性會在冷凍過程中下降，冷凍-解凍過程中的冷休克還可能破壞線粒體以及精子的質(zhì)膜和頂體膜。Ashrafi等研究發(fā)現(xiàn)在精液稀釋液中添加褪黑素可以抵消冷凍解凍過程對公牛精子活力、存活率、形態(tài)正常和質(zhì)膜完整性的不利影響。Pang等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素處理牛精子后，精子與體外培養(yǎng)胚胎受精后胚胎發(fā)育到囊胚的比率顯著提高，囊胚的凋亡率顯著降低；褪黑素處理的精子產(chǎn)生的胚胎中和豐度顯著降低，而和轉(zhuǎn)錄豐度顯著升高。Perumal等在牛體內(nèi)埋植褪黑素后采集精液體外冷凍解凍，發(fā)現(xiàn)精液的運動參數(shù)、線粒體膜電位、抗氧化特性、核畸形比率、細胞內(nèi)酶流失以及精子體外透明帶結(jié)合能力指數(shù)均有顯著改善。

玻璃化冷凍會降低哺乳動物卵母細胞的發(fā)育潛力和胚胎的著床能力，這主要是由于玻璃化冷凍導(dǎo)致卵母細胞中ROS活性和凋亡水平異常升高所致。褪黑素可以有效改善此類情況，提高體外卵母細胞和胚胎的冷凍效率。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)在體外成熟液和玻璃化冷凍液中加入褪黑素可降低玻璃化卵母細胞的ROS、線粒體鈣離子、mRNA表達和Caspase3蛋白水平，降低磷脂酰絲氨酸外部化和DNA碎片率，提高線粒體膜電位和mRNA的表達水平，從而提高玻璃化冷凍卵母細胞孤雌激活后的發(fā)育能力。

在褪黑素對牛胚胎冷凍保存方面，Wang等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可顯著提高解凍后24～72 h的囊胚孵化率，顯著降低解凍后48～72 h的死亡率；胚胎培養(yǎng)過程中加入褪黑素，解凍后基因表達顯著增加，基因表達顯著降低，提高牛胚胎的冷凍耐受性，從而提高牛胚胎質(zhì)量。Marques等研究培養(yǎng)液中添加褪黑素和玻璃化冷凍前去除囊胚液體對牛體外胚胎質(zhì)量和存活率的影響，發(fā)現(xiàn)在冷凍保存前添加褪黑素可提高胚胎的孵化率，提高編碼熱休克蛋白基因的表達；此外，在培養(yǎng)液中添加褪黑素對玻璃化冷凍囊胚的形態(tài)質(zhì)量、存活率、升溫后胚胎耐受性以及胚胎存活率都有著積極的作用。綜上研究都表明褪黑素不但對牛配子和胚胎體外正常條件下有著保護和促進作用，而且對牛配子和胚胎冷凍保也存有積極影響。

5 展 望

隨著各種新的輔助生殖技術(shù)在牛場中的應(yīng)用，牛體外胚胎生產(chǎn)對牛場的生產(chǎn)經(jīng)營和發(fā)展變得愈發(fā)重要。在體外胚胎生產(chǎn)過程中的氧化應(yīng)激是限制其發(fā)展的主要因素之一，近些年褪黑素被認為是一種重要的自由基清除劑，它的抗氧化性得到充分關(guān)注。目前已有多項研究表明，褪黑素在牛體外胚胎生產(chǎn)過程中有著積極的作用，然而褪黑素在體外培養(yǎng)不同條件下的添加方式和濃度還需要進一步研究，以及褪黑素在這些過程中的具體作用機制還需要深入探索。