趙發(fā)法，張曉蓉

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學(xué)藥學(xué)院，湖南 吉首 416000)

中草藥應(yīng)用于治療出血、失血歷史悠久，已有文獻報道多達300余種[1-4].中草藥中多種化學(xué)成分具有止血活性，如糖類、生物堿類、萜類、黃酮類、鞣質(zhì)、醌類化合物、香豆素類、脂類、有機酸類、氨基酸類等，這些化學(xué)成分是中藥止血藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)[5-8].

黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)是我國寶貴的民間中藥，具有止血、殺蟲，治療皮膚疥癬、蜂毒、蛇咬傷、燙傷，以及清熱解暑、除蒸、截瘧等藥用功效[9]，作用廣泛.近年來，黃花蒿的藥效成分分析及開發(fā)利用取得較大進展.黃花蒿揮發(fā)油(精油)，主要包括單萜、倍半萜、單萜氧化物等[10-12]，具有殺菌、消炎、抗病毒、殺滅農(nóng)業(yè)害蟲等藥效.倍半萜化合物青蒿素已成功開發(fā)為抗瘧特效藥，臨床使用十分廣泛.作為主要的功能成分，青蒿精油應(yīng)用于香皂、沐浴露、洗頭膏、蚊香等日化產(chǎn)品也已有報道[13-14].黃酮類化合物具有消炎、抗病毒、抗過敏、抗氧化、降尿酸、止咳、祛痰、促進人體激素分泌、抗糖尿病等藥效[15].蒿類植物民間用于止血歷史悠久.目前，用青蒿植物提取物制作的外用止血藥“復(fù)方青蒿噴霧劑”(國藥準字Z20025887)，已有市售.隋婧等[16]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿75%乙醇粗提物經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水等溶劑萃取后，正丁醇萃取部分體外凝血效果顯著，具有凝血時間縮短率高、對凝血時間敏感、血漿凝固較快等特點.基于黃花蒿凝血藥效的民間應(yīng)用，筆者擬對黃花蒿凝血藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究，以揭示其凝血機理并為凝血新藥的開發(fā)提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃花蒿植物，采于吉首市郊；云南白藥、鮮雞血，均為市售.

1.2 儀器與試劑

60-UV-Vis型紫外可見分光光度計(安捷倫科技有限公司)，凝血陶瓷板.無水CaCl2，NaCl，枸櫞酸鈉，卵磷脂，正丁醇，無水乙醇，三氯甲烷，乙酸乙酯，石油醚，四氫硼鈉，乙酸鉛，以上試劑均為分析純(AR).

1.3 實驗方法

1.3.1 凝血活性部位提取 取黃花蒿粗粉各200.0 g，分別用正丁醇、體積分數(shù)70.0%的乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚提取4次，固液比1∶20，輔助超聲提取時間10.0 min，合并提取液，過濾，減壓蒸餾，收集浸膏，揮干溶劑，備用.

1.3.2 體外凝血實驗 5種黃花蒿提取物浸膏以蒸餾水溶解，配置成質(zhì)量濃度為0.01 g/mL的溶液，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯提取液濃縮浸膏加入質(zhì)量濃度為0.02 g/L卵磷脂輔助溶解.云南白藥粉用蒸餾水溶解，過濾，作為體外凝血實驗的陽性對照；以蒸餾水、等質(zhì)量濃度的卵磷脂水溶液為陰性對照.采用凝血板法、試管法以及血漿復(fù)鈣時間測定法進行體外凝血時間的測定.

1.3.3 黃酮化合物分離 取10.0 g黃花蒿正丁醇提取浸膏，以pH值為11.0的NaOH溶液250.0 mL(料液比1∶25)，超聲溶解，抽濾.濾液加體積分數(shù)為10.0%的鹽酸，調(diào)pH值為3.0，低溫沉淀4 h，收集沉淀，余液再調(diào)pH值為3.0，繼續(xù)低溫沉淀4 h，合并沉淀，用正丁醇溶解沉淀，備用.

1.3.4 黃酮化合物理化分析 (1)紫外—可見光譜分析.測定黃酮分離樣品的正丁醇溶液紫外吸收光譜，收集200～500 nm的光譜吸收值.

(2)熒光顯色分析.黃酮粗純化物采用薄層色譜法(TLC)分析，2次展層.第1次展層劑石油醚∶三氯甲烷∶甲醇∶氨水體積比8∶2∶1∶0.15；揮干展層溶劑后，再進行第2次展層，第2次展層劑三氯甲烷∶甲醇∶氨水體積比8∶2∶0.15.于365 nm波長觀察斑點熒光.

(3)顯色反應(yīng).鹽酸—鎂粉反應(yīng)：樣品溶液加入少許鎂粉，搖勻，滴加濃鹽酸幾滴，顏色呈黃色、紫紅色為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng).

四氫硼鈉反應(yīng)：樣品溶液加入體積分數(shù)為2.0%的四氫硼鈉甲醇溶液1.0 mL，1 min后，滴加幾滴濃鹽酸，顏色呈紫紅至紅色為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng).

乙酸鉛反應(yīng)：樣品溶液加入體積分數(shù)為1.0%的中性乙酸鉛水溶液1.0 mL，產(chǎn)生黃色至紅色沉淀為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng).

濃鹽酸反應(yīng)：樣品溶液滴加幾滴濃鹽酸溶液，出現(xiàn)黃色或橙色為陽性結(jié)果，否則為陰性反應(yīng).

1.3.5 萜類化合物分離 (1)正丁醇浸提物中萜類化合物分離.取黃花蒿植物粉末10.0 g，正丁醇過夜浸提，固液比1∶20(g∶mL)，輔助超聲1.0 h.濾液-20 ℃放置過夜，過濾收集浮質(zhì)，少量蒸餾水洗滌，少量正丁醇溶解，備用.

(2)黃花蒿植物精油制備.取黃花蒿葉200.0 g，裝入圓底燒瓶，5倍量蒸餾水浸潤，連續(xù)蒸餾3～4 h，收集上層液，即為黃花蒿精油，備用.

1.3.6 TLC法分析萜類化合物

采用TLC法分析兩種方法制備的萜類化合物，展層劑石油醚∶乙酸乙酯(體積比9∶3)，顯色劑為香草醛、磷鉬酸，對TLC板進行顯色分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 黃花蒿凝血活性部位篩選

采用凝血板法、試管法和血漿復(fù)鈣時間測定法比較正丁醇、體積分數(shù)70.0%乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚5種溶劑對黃花蒿凝血活性物質(zhì)浸提物體外凝血效果，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知：

不同小寫字母表示黃花蒿不同溶劑提取物體外凝血時間差異顯著(P<0.01).圖1 黃花蒿凝血活性部位分析Fig. 1 Analysis of the pharmacodynamics substance in Artemisia annua L.

正丁醇提取物凝血時間最短，凝血板的凝血時間為360.7 s，較蒸餾水和云南白藥的凝血時間分別縮短了287.7 s(約44.37%)和187.0s(約34.14%)；試管法的凝血時間為58.3 s，較蒸餾水和云南白藥的凝血時間分別縮短了28.7 s(約32.9%)和13.4 s(約18.6%)；血漿復(fù)鈣時間測定法的血漿復(fù)鈣時間為101.7 s，較蒸餾水和云南白藥的凝血時間分別縮短了125 s(約55.14%)和65 s(約39%).可見5種溶劑提取物中，正丁醇提取物具有最顯著的體外凝血效果.

體積分數(shù)70%乙醇提取物也具有較好的凝血效果，其凝血板的凝血時間為426 s，較蒸餾水和云南白藥的凝血時間分別縮短了222.3 s和121.7 s；試管法的凝血時間為66.7 s，較蒸餾水和云南白藥的凝血時間分別縮短了20.3 s和5 s；血漿復(fù)鈣時間測定法的血漿復(fù)鈣時間為139 s，較蒸餾水和云南白藥的血漿復(fù)鈣時間分別縮短了87.7 s和27.7 s.

石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯提取物均無凝血效果，其凝血時間與陰性對照幾乎無差異.由于石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯提取物不溶于水，實驗以不同質(zhì)量濃度的卵磷脂為助溶劑，當卵磷脂質(zhì)量濃度為0.020～ 0.025 g/L時，對凝血作用影響較小，因此凝血實驗均采用質(zhì)量濃度為0.020 g/L的卵磷脂作為助溶劑.

綜上所述，正丁醇提取物凝血效果最顯著，因此推測黃花蒿凝血活性部位為正丁醇提取物，該結(jié)果與文獻報道結(jié)果相符.本實驗將選用正丁醇作為凝血活性成分提取溶劑.

2.2 凝血成像

凝血板法、試管法和血漿復(fù)鈣時間測定法檢測黃花蒿正丁醇提取凝血活性物質(zhì)的體外凝血成像如圖2所示.圖2(a)為凝血板法成像，其中1號為自然凝血(未凝)，2號為加入黃花蒿正丁醇提取物浸膏水溶液后，血液呈現(xiàn)凝固現(xiàn)象，用大頭針可推動凝血塊.圖2(b)為試管法實驗成像，其中1號試管為自然凝血(未凝)，2號試管中加入黃花蒿正丁醇提取物浸膏水溶液后，傾倒試管，血塊凝固于管底.圖2(c)為血漿復(fù)鈣時間測定法成像，其中1號試管未出現(xiàn)白色纖維蛋白絲(對照組)，2號試管抗凝血漿加入黃花蒿正丁醇提取物浸膏水溶液后，可見彌漫性白色纖維蛋白絲，出現(xiàn)凝血現(xiàn)象.由此可知，黃花蒿的正丁醇提取物具有良好的凝血效果，為黃花蒿的凝血活性部位.

(a)(b):1—未凝固血;2—凝固血;(c):1—凝血漿;2—彌漫性白色纖維蛋白絲凝固血漿.圖2 黃花蒿正丁醇提取物體外凝血成像Fig. 2 Coagulation Imaging of the Butyl Alcohol Extract in vitro

2.3 黃酮化合物分析

2.3.1 光學(xué)活性分析 以堿溶酸沉淀法分離正丁醇浸提物中黃酮化合物，光譜活性檢測如圖3所示.圖3(a)為堿溶酸沉淀分離的黃酮化合物的紫外可見光譜，在330 nm處有明顯吸收峰，在250 nm及268 nm處有微弱峰，沉淀收集后余液無吸收峰.圖3(b)為黃酮粗純化物的TLC熒光顯色分析結(jié)果.黃酮粗純化物存在8個熒光斑點，余液有4個微弱的斑點.由此可見，正丁醇浸提物存在大量黃酮化合物，堿溶酸沉淀法可較為完全地分離浸提物中黃酮化合物，正丁醇浸提物中至少含有8個黃酮化合物組分.

圖3 黃酮化合物紫外可見光譜及TLC熒光成像Fig. 3 Ultraviolet-Visible Spectroscopy and Fluorescence Imaging of the Flavone Compounds by TLC

2.3.2 顯色反應(yīng)鑒定 對正丁醇浸提物分離的黃酮化合物進行還原反應(yīng)、絡(luò)合反應(yīng)以及酸堿顯色反應(yīng)鑒定.由表1及圖4結(jié)果可知，黃酮粗分離化合物鹽酸—鎂粉、四氫硼鈉、濃鹽酸、乙酸鉛的顯色反應(yīng)均為陽性反應(yīng)，沉淀分離后，余液顯色未見變化，均為陰性反應(yīng).沉淀物為黃酮類化合物，余液幾乎不含或僅含微量黃酮化合物.由顯色反應(yīng)進一步推測，分離物含有大量黃酮化合物，并具有黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮等化學(xué)結(jié)構(gòu).

表1 黃酮類化合物顯色反應(yīng)結(jié)果

圖4 黃酮化合物顯色反應(yīng)成像Fig. 4 Imaging of the Color Reaction of the Flavone Compounds

2.4 萜類化合物分析

采用TLC法分析了低溫法分離的正丁醇提取物中萜類化合物以及水蒸汽蒸餾法提取的植物揮發(fā)油中萜類化合物.香草醛和磷鉬酸顯色結(jié)果如圖5所示.圖5(a)為低溫法分離的正丁醇提取物中萜類化合物，香草醛顯色有紅色與藍色共5個斑點，磷鉬酸顯色可見6個藍色斑點.圖5(b)為水蒸汽蒸餾法提取的萜類化合物，磷鉬酸顯色可見7個藍色斑點.由此可見，黃花蒿的正丁醇提取物中至少存在5種萜類化合物.

圖5 萜類化合物的TLC分析Fig. 5 TLC Analysis of the Terpenoids Compounds in the Butyl Alcohol Extract

3 結(jié)語

黃花蒿植物在民間用于凝血，歷史悠久，藥效顯著.本研究采用溶劑法對黃花蒿凝血藥效物質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)黃花蒿凝血藥效活性部位為正丁醇提取物，實驗結(jié)果與文獻報道一致[16].本研究中，凝血板法、試管法、血漿復(fù)鈣時間測定法3種體外凝血方法測定結(jié)果表明，正丁醇提取物體外凝血藥效與自然凝血比較效率分別提高了44.37%，32.9%，55.14%，與云南白藥凝血效果比較，藥效分別提高了34.14%，18.6%，39%，凝血效果顯著.

對黃花蒿植物正丁醇浸提物化學(xué)組分分析表明，提取物中含有大量黃酮類化合物.采用堿溶酸沉淀法分離正丁醇浸提物，分離物具有黃酮化合物典型的熒光特征.紫外光譜掃描分析可見330 nm處吸收峰以及250，268 nm處微弱峰等黃酮特征吸收峰.TLC分析顯示，黃花蒿正丁醇浸提物中至少含有8個黃酮化合物組分.通過對分離物進行還原反應(yīng)、絡(luò)合反應(yīng)以及酸堿顯色反應(yīng)實驗，發(fā)現(xiàn)鹽酸-鎂粉、四氫硼鈉、濃鹽酸、乙酸鉛與樣品溶液反應(yīng)均為陽性反應(yīng)，可推斷分離的黃酮化合物具有黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮等化學(xué)結(jié)構(gòu).此外，采用低溫法從正丁醇浸提物中分離得到萜類化合物，采用香草醛和磷鉬酸顯色分析分離物的TLC展層結(jié)果，可見明顯的萜類化合物斑點，與植物精油中萜類顯色一致.

此外，筆者對已有文獻報道的藥用植物中發(fā)現(xiàn)的凝血活性化學(xué)組分[17-19]，如生物堿、多糖、甾體類化合物等組分也進行了檢測，發(fā)現(xiàn)黃花蒿植物含微量的生物堿類物質(zhì)，幾乎不含可溶性糖類物質(zhì)以及甾體類化合物，正丁醇浸提物檢測不到此3類化合物.有關(guān)黃酮化合物及萜類化合物的凝血藥效研究，筆者將另文報道.