杜曉楠，劉曉娥

（寧夏建投設(shè)計(jì)研究總院（有限公司），寧夏銀川 750000）

食品安全問題關(guān)系國(guó)計(jì)民生。其中，油炸食品中各種抗氧化劑特別是有機(jī)合成類抗氧化劑的合理使用，也是需要關(guān)注的問題[1]。當(dāng)食品暴露在空氣中時(shí)，會(huì)發(fā)生不同的反應(yīng)，而氧化反應(yīng)會(huì)使暴露在空氣中的油脂發(fā)生變性，縮短保質(zhì)期，特丁基對(duì)苯二酚（Tertiary Butylhydroquinone，TBHQ）可以和自由基發(fā)生反應(yīng)，終止氧化過(guò)程，只需要添加少量就可以發(fā)揮有效作用。目前國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定TBHQ的最大使用限量為0.2 g·kg-1[2]，過(guò)量添加對(duì)人體有一定的致癌作用。因此，加大對(duì)油炸食品中抗氧化劑的檢測(cè)尤為重要[3]。

目前市面上的抗氧化劑有人工抗氧化劑和天然抗氧化劑，天然抗氧化劑有從綠茶中提取的茶多酚、迷迭香的花和葉中提取的迷迭香，以及從植物中提取的維生素C、維生素E等。其中維生素、茶多酚等屬水溶性物質(zhì)對(duì)油脂的抗氧化效果一般；維生素E有一定的抗氧化作用，但是提取工藝復(fù)雜，價(jià)格昂貴。油脂中常用的抗氧化劑是TBHQ，在食品中加入少量的TBHQ可以減緩油脂氧化作用，避免產(chǎn)生酸敗現(xiàn)象，使油炸食品能夠長(zhǎng)時(shí)間保存。目前國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)油炸食品中TBHQ的限量要求是不大于0.2 g·kg-1，在此范圍內(nèi)對(duì)人體健康無(wú)害，超出范圍則可能存在導(dǎo)致畸形和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)油炸食品中的TBHQ檢測(cè)研究建立了高效液相色譜法，旨在研究出一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%），北京曼哈格科技生物有限公司；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；正己烷（分析純），國(guó)家計(jì)量科學(xué)研究院；氯化鈉（分析純），廊坊天科生物科技有限公司；薯片，編號(hào)為1、2，市售；薯?xiàng)l，編號(hào)為1、2，市售；方便面，編號(hào)為1、2，市售。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Aglient 1260 DAD），美國(guó)安捷倫科技有限公司；紫外分光光度計(jì)（TU-1810PC），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超聲儀（As3120），天津奧特賽恩斯儀器有限公司；高速離心機(jī)（TGL-16G/TDL80），上海安亭科學(xué)儀表廠；分析天平（CP214），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；漩渦混勻器（MX-F），天津奧特恩斯儀器有限公司；固相萃取裝置（ASE-24），天津奧特賽恩斯儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A），上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

TBHQ 儲(chǔ) 備 液（1 000 μg·mL-1）： 準(zhǔn) 確 稱 取TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g（精確至0.1 mg），將其倒入棕色容量瓶中，用乙腈沖洗殘?jiān)?0 mL容量瓶中并定容至刻度線，搖勻，配制成 1 000 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，于0～4 ℃避光保存。

TBHQ工作液：分別吸取TBHQ儲(chǔ)備液（1 000 μg·mL-1）0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度線，配成 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1L、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

乙腈飽和的正己烷溶液：正己烷中加入乙腈至飽和狀態(tài)。正己烷飽和的乙腈溶液：乙腈中加入正己烷至飽和狀態(tài)。飽和氯化鈉溶液：水中加入氯化鈉至飽和。乙腈甲醇混合液：取100 mL的乙腈和50 mL的甲醇混合。

1.3.2 色譜條件的優(yōu)化

取50 mL的潔凈離心管，加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，加入已知含量的TBHQ的儲(chǔ)備液，渦旋1 min，加入5 mL正己烷飽和的乙腈溶液，渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，收集下層清液，上機(jī)檢測(cè)，分別考察檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱種類、柱溫及進(jìn)樣量、洗脫方式等因素對(duì)測(cè)定的影響，選出最佳的色譜條件。

1.3.3 樣品前處理

樣品的制備：將固體樣品粉碎，混合均勻，用四分法取具有代表的樣品，裝入容器，貼上標(biāo)簽，密封保存。

提?。簻?zhǔn)確稱取1 g制備好的試樣于25 mL比色管中。加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，混勻1 min，然后加入5 mL飽和NaCl溶液，再加用5 mL飽和的乙腈溶液，渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，收集下層清液于離心管，上述操作2次，將3次提取液合并，然后凈化。

凈化：分別用5 mL的甲醇活化C18固相萃取柱，再用乙腈平衡萃取柱，將上述提取液液倒入柱中，棄去初濾液，用5 mL乙腈和甲醇的混合溶液洗脫。收集洗脫液于旋蒸瓶中，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2 mL乙腈溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，供液相色譜儀測(cè)定，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

篩選出合適的色譜條件后，在此條件下對(duì)高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測(cè)定油炸食品中TBHQ的方法進(jìn)行驗(yàn)證，從線性、精密度、檢出限與定量限、樣品的測(cè)定等方面對(duì)該方法進(jìn)行考察。

2 結(jié)果分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

在180～1 200 nm波長(zhǎng)范圍，用紫外分光光度計(jì)對(duì)TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光譜掃描，掃描后發(fā)現(xiàn)TBHQ在280 nm處吸光度最大，所以本次實(shí)驗(yàn)選擇280 nm為TBHQ的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 色譜柱的確定

本實(shí)驗(yàn)分別用 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜柱出峰時(shí)間早于 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，但分離能力不如 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，所以選取后者為本次實(shí)驗(yàn)色譜柱。

2.1.3 柱溫

本次柱溫選擇30 ℃、35 ℃、40 ℃分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中設(shè)置30 ℃接近室溫，到中午天氣升溫，屋內(nèi)溫度大于柱溫，柱溫失效，不利于控制色譜柱溫度，設(shè)置40 ℃時(shí)，TBHQ目標(biāo)峰與梯度洗脫出來(lái)的溶劑峰挨得過(guò)近，不利于分離目標(biāo)化合物，最終實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)35 ℃時(shí)效果最佳。

2.1.4 進(jìn)樣量

本次選擇 5 μL、10 μL、50 μL 3 個(gè)進(jìn)樣量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，最低點(diǎn)的濃度出峰不明顯，低濃度值檢測(cè)不準(zhǔn)確，在進(jìn)樣量為50 μL時(shí)，色譜峰峰型過(guò)寬，容易包峰，導(dǎo)致檢測(cè)不準(zhǔn)。最終發(fā)現(xiàn)10 μL時(shí)進(jìn)樣效果最佳，所以確定柱溫為35 ℃、進(jìn)樣量 10 μL。

2.1.5 洗脫方式

本實(shí)驗(yàn)對(duì)梯度洗脫和等度洗脫進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用梯度洗脫時(shí)，分離效果好、出峰速度快、采用等度洗脫時(shí)出峰時(shí)間較晚且分離度不如梯度洗脫，故選擇梯度洗脫為本次實(shí)驗(yàn)條件，流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫程序見表1。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照確定好的色譜條件，分別配制50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1和 400 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，將配制好的溶液裝入進(jìn)樣瓶中，設(shè)置好色譜條件，依次上機(jī)檢測(cè)，以配制的濃度為橫坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)濃度的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到f（y）=0.002 8x+986、相關(guān)性系數(shù)為0.999 9的線性回歸方程，線性范圍 50～ 400 μg·mL-1，見圖1。

圖1 TBHQ校準(zhǔn)曲線圖

2.2.2 精密度

選取薯片作為基質(zhì)樣品，稱取7份，其中一個(gè)為空白樣品，剩下6個(gè)分別編號(hào)1～6分別加入0.6 mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg·mL-1），按照樣品處理步驟，進(jìn)行樣品處理，然后上機(jī)檢測(cè)，在減去空白值后所測(cè)得含量值分別為 201 mg·kg-1、203 mg·kg-1、202 mg·kg-1、200 mg·kg-1、201 mg·kg-1、202 mg·kg-1，精密度為0.52%，實(shí)驗(yàn)精密度小于2%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。

2.2.3 回收率

稱取18份粉碎好的薯片，分為低中高3組，每組6個(gè)，分別按表2中的添加量加入對(duì)應(yīng)濃度的儲(chǔ)備液，然后按照確定好的方法進(jìn)行前處理，最后上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明薯片中TBHQ的回收率為96%～98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于2%，實(shí)驗(yàn)結(jié)良好，表明方法可靠.

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.2.4 檢出限和定量限

檢出限和定量限結(jié)果如表3所示。

表3 檢出限定量限結(jié)果

2.2.5 樣品的測(cè)定

對(duì)市場(chǎng)上銷售的薯片、方便面、薯?xiàng)l按照所建立方法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)產(chǎn)品是否符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。由表4的數(shù)據(jù)可知，市面上常見的油炸食品TBHQ均未檢出，產(chǎn)品合格。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了HPLC法測(cè)定油炸食品中TBHQ樣品預(yù)處理方法，采用 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，以乙腈和水作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，選取正己烷去油脂，乙腈提取，C18固相萃取柱凈化，紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量，得到TBHQ平均加標(biāo)回收率為97%，精密度為0.52%，檢出限為0.26 μg·mL-1，定量限為 0.79 μg·mL-1。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，具有推廣應(yīng)用價(jià)值。