陳勝兵，張慧敏，金 惠，章紀(jì)玲，董 增

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

花生是我國(guó)重要的油料作物，全國(guó)各地都有種植，每年榨油產(chǎn)生的花生粕產(chǎn)量1 000 多萬(wàn)t，資源極其豐富[1]?；ㄉ墒钦ビ秃蟮母碑a(chǎn)品，主要成分是碾碎的果仁及一些種皮和殼，花生粕粉整體呈淺棕色或深棕色，有淡淡的花生味?；ㄉ蔂I(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，品質(zhì)好的花生粕蛋白質(zhì)含量接近50%，含有人體必需的8 種氨基酸，還有黃酮類、酚類、多糖、三萜類等活性成分及人體必需的礦物元素和維生素，而脂肪含量?jī)H為1%，花生粕是一種高蛋白低脂肪的天然優(yōu)質(zhì)食品資源[1-2]。

花生粕較高的蛋白質(zhì)含量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可以應(yīng)用于強(qiáng)化飼料蛋白、強(qiáng)化食品、植物蛋白飲料和發(fā)酵食品等，開(kāi)發(fā)潛力巨大。水解后的花生蛋白可以使其致敏性降低，制備的花生蛋白肽還具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化、延長(zhǎng)細(xì)胞壽命等作用，且消化吸收性好、食品安全性高，可以作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用于嬰幼兒配方食品、運(yùn)動(dòng)員食品、減肥食品和醫(yī)療食品中[3]?；ㄉ鞍走€可以制作花生蛋白飲料，花生蛋白有淡淡的花生香味，水溶性程度高，酶改性后的花生蛋白能夠提升其在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性，因此可以用來(lái)生產(chǎn)花生飲料[4]。除此之外，花生蛋白還能作為加工煉乳、餅干、面包、牛奶等花生風(fēng)味食品和飲料的原料。

目前，全球的蛋白質(zhì)供應(yīng)中，70%以上是植物蛋白，因?yàn)橹参锏鞍椎臓I(yíng)養(yǎng)價(jià)值與動(dòng)物蛋白相似，且膽固醇含量低，含有多種氨基酸，除上述外，植物蛋白資源豐富、分布廣泛，具有其他蛋白無(wú)法比擬的功能特性，開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景十分廣闊[5]。蛋白質(zhì)常用的方法有超聲輔助提取、浸出法、堿溶酸沉、水劑法、酶法、膜分離技術(shù)等[6]，鹽溶法是使用一定濃度的氯化鈉溶液為提取劑，氯化鈉可以促進(jìn)蛋白的溶解，來(lái)源范圍廣、價(jià)格廉價(jià)，提取的蛋白質(zhì)含量較高，鹽提取法被應(yīng)用于芝麻粕蛋白、牡蠣和辣木葉蛋白的提取中[7-9]。以榨油剩余的花生粕為原料，研究氯化鈉濃度、pH 值、料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度對(duì)花生水溶性蛋白的提取率影響，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白提取工藝，以期更高效地提取花生蛋白質(zhì)，提高其利用率。

1 材料與方法

1.1 材料料與試劑

試驗(yàn)所用主要原料花生粕購(gòu)于宿州市榨油廠，將塊狀花生粕敲成小塊后用粉碎機(jī)粉碎，常溫干燥貯藏，備用。試劑主要有牛白蛋白、考馬斯亮藍(lán)（BR）、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙醇等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以牛白蛋白（BSA） 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：準(zhǔn)確稱取0.5 mg 牛白蛋白溶于50 mL蒸餾水中，即10 mg/mL 原液，在4 ℃下保存，備用。

考馬斯亮藍(lán)G—250 試劑：準(zhǔn)確稱取100 mg 考馬斯亮藍(lán)G—250 試劑，溶于95%的乙醇50 mL 中，加入85%的磷酸100 mL，再加蒸餾水定容至1 000 mL，即得考馬斯亮藍(lán)溶液。取7 支試管，分別取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，并補(bǔ)充蒸餾水至1 mL，隨后向每支試管中加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，靜置2 min 后于波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定各組蛋白質(zhì)的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

1.3 單因素試驗(yàn)

蛋白質(zhì)的溶解度受很多因素的影響，考查了料液比、提取溫度、提取液pH 值、氯化鈉濃度、溫度及時(shí)間等5 個(gè)因素分別對(duì)花生粕蛋白質(zhì)提取率的影響，探究單因素最佳條件的試驗(yàn)，單因素試驗(yàn)條件確定如下：

（1） 確定料液比。固定溫度為60 ℃，pH 值為10，NaCl 濃度0.15 mol/L，時(shí)間為60 min。研究不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25），對(duì)蛋白質(zhì)提取時(shí)影響。

（2） 確定水浴溫度。固定料液比為1∶15，pH值為10，NaCl 濃度0.15 mol/L，時(shí)間為60 min。研究不同溫度（40，50，60，70，80 ℃） 對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響。

（3） 確定pH 值。固定料液比為1∶15，NaCl 濃度0.15 mol/L，溫度為60 ℃，時(shí)間為60 min。研究不同提取pH 值（7，8，9，10，11） 對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響。

（4） 確定NaCl 濃度。固定料液比為1∶15，溫度為60 ℃，pH 值為10，時(shí)間為60 min。研究不同的NaCl 濃度（0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mol/L）對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響。

（5） 確定水浴時(shí)間。固定料液比為1∶15，NaCl濃度0.15 mol/L，溫度為60 ℃，pH 值為10。研究不同提取時(shí)間（30，60，90，120，150 min） 對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響。

提取結(jié)束后，對(duì)提取液抽濾，取1 mL 上清液，加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，靜置2 min 后于波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定吸光度，帶入牛白蛋白標(biāo)準(zhǔn)公式得出粗蛋白含量，根據(jù)公式（1） 計(jì)算得出蛋白質(zhì)提取率。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)中基礎(chǔ)上，對(duì)于鹽沉淀法提取花生粕蛋白質(zhì)工藝試驗(yàn)，選取料液比（A）、鹽濃度（B）、pH 值（C）、溫度（D）、時(shí)間（E） 5 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，根據(jù)設(shè)計(jì)條件進(jìn)一步試驗(yàn)得出結(jié)果，進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)和模型的確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度Y=0.055 5X+0.059 2，該曲線相關(guān)性R2為0.992 2，相關(guān)性很高，可以用來(lái)測(cè)定花生蛋白含量。

2.2 單因素結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖2 可知，在一定范圍內(nèi)，鹽溶性花生粕粗蛋白質(zhì)提取率會(huì)隨著料液比的增加而升高，在1∶15時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最高，為35.25%。隨著料液比的持續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，料液比的增加能促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，溶劑繼續(xù)增加，會(huì)導(dǎo)致其他可溶性雜質(zhì)增多，從而影響了蛋白質(zhì)的溶出和測(cè)定。所以料液比1∶15 為最佳條件。

2.2.2 浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

植物蛋白質(zhì)對(duì)溫度的敏感性很高。由圖3 可知，在60 ℃之前，蛋白質(zhì)提取率呈上升趨勢(shì)，60 ℃后蛋白質(zhì)提取率呈下降趨勢(shì)，造成這種現(xiàn)象的原因可能是隨著溫度升高促進(jìn)了蛋白質(zhì)充分溶脹溶解，進(jìn)一步升高溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性析出，從而使蛋白質(zhì)提取率下降[11]。在60 ℃時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最高為35.19%。

2.2.3 pH 值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

pH 值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH 值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

pH 值的主要作用是改變蛋白質(zhì)的帶電情況，影響蛋白質(zhì)與溶液之間的相互作用，從而使蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生變化。由圖4 可知，在pH 值為7～10 時(shí)，蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，pH 值超過(guò)10 后，提取率下降?？赡茉蚴堑鞍踪|(zhì)在高pH 值條件下，提取液的黏度變大，不利于分離。堿性變強(qiáng)后花生粕中的有機(jī)成分進(jìn)入提取液，干擾了吸光度的測(cè)定。所以最佳pH 值應(yīng)為10，提取率為35.29%。

2.2.4 NaCl 濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

NaCl 濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 NaCl 濃度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

鹽溶液濃度對(duì)蛋白質(zhì)的鹽溶性溶解度有一定影響。當(dāng)鹽溶液濃度較低時(shí)，花生粕中的有機(jī)成分不易析出，且使蛋白質(zhì)表面的電荷增加，蛋白質(zhì)溶解性增強(qiáng)[9]；而當(dāng)鹽溶液較高時(shí)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解不充分，蛋白質(zhì)變性析出[11]。由圖5 可知，鹽溶液濃度在低于0.2 mol/L 時(shí)，蛋白質(zhì)提取率越來(lái)越高，在0.2 mol/L 時(shí)提取率最高，為35.07%，超過(guò)0.2 mol/L后，鹽溶性花生粕蛋白提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，提取花生粕蛋白最佳NaCl 濃度應(yīng)為0.2 mol/L。

2.2.5 浸提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

浸提溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 浸提時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

浸提時(shí)間對(duì)花生粕蛋白提取率的影響雖沒(méi)有其他條件大，但對(duì)提取率也有一定影響，溶劑穿越樣品顆粒接觸蛋白質(zhì)需要一定的時(shí)間。由圖6 可知，浸提時(shí)間在30～60 min 時(shí)，蛋白質(zhì)提取率增長(zhǎng)最快，在60 min 時(shí)達(dá)到最大值，在60 min 后呈緩慢下降趨勢(shì)，浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分解及雜質(zhì)增多。因此，花生粕蛋白質(zhì)提取的最佳浸提時(shí)間為60 min。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照上述試驗(yàn)方法選取5 個(gè)單因素指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，選擇料液比（A）、鹽濃度（B）、溶液pH 值（C）、溫度（D） 和時(shí)間（E） 進(jìn)行五因素三水平的響應(yīng)面分析，得出的花生粕蛋白提取的最優(yōu)工藝[12]。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件Design Expert 8.0.6 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次元回歸擬合，得到蛋白質(zhì)提取率與自變量之間的二次多項(xiàng)式回歸方程[13]：

回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析

試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腇=1 137.46，失擬項(xiàng)0.113 7>0.05 不顯著，模型p＜0.000 1，說(shuō)明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的模型擬合度較好，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，進(jìn)一步說(shuō)明模型具有較好的可信度。

因素A、B，因素平方項(xiàng)A2，B2，C2的p 值均小于0.000 1，表明料液比和鹽濃度對(duì)花生蛋白提取有極顯著影響。因素C＜0.01，說(shuō)明溶液pH 值對(duì)花生蛋白質(zhì)提取率有顯著影響。根據(jù)F 值，對(duì)花生粕蛋白質(zhì)提取率影響大小的排列順序依次為料液比>鹽濃度>溶液pH 值>時(shí)間>溫度。

3 結(jié)論

由試驗(yàn)可知，響應(yīng)面設(shè)計(jì)模擬得到最佳提取工藝為料液比為1∶19.85，鹽濃度0.17，pH 值9.87，溫度58.26，時(shí)間41.8，模擬該條件下的得率為38.92%。考慮到操作的可行性和方便性，選用料液比1∶20，鹽濃度0.17 mol/L，pH 值9.9，溫度58 ℃，時(shí)間為42 min 重新做3 組驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)得出花生粕粗蛋白的提取率平均值為39.03%，與預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明該工藝條件合理可行，可用于花生粕蛋白質(zhì)的提取。