盧改龍 陳文娜 王倩茹 王舒萍 黃君華

（西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710021）

0 引言

細(xì)菌性腦膜炎（Bacterial Meningitis，BM）是一種嚴(yán)重危害新生兒生命的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，病死率高且常有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1，2]，其中尤以肺炎鏈球菌性BM 后遺癥發(fā)生率最高，預(yù)后較差[3]。因此快速鑒定BM 病原菌對降低該病后遺癥發(fā)生率和病死率至關(guān)重要[4]。 目前，BM 的病原學(xué)診斷主要依靠培養(yǎng)，但培養(yǎng)敏感性低，時間長，延誤最佳診療時機(jī)。 本研究以患肺炎鏈球菌性腦膜炎新生兒為研究對象， 旨在應(yīng)用熒光定量PCR （FQ-PCR） 擴(kuò)增腦脊液（Cerebrospinal Fluid，CSF）標(biāo)本中病原菌 DNA，探求腦脊液細(xì)菌載量與臨床表現(xiàn)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)之間的關(guān)系， 探討FQ-PCR 在檢測BM 病原菌中的作用，為判斷患兒預(yù)后和轉(zhuǎn)歸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

采集2020 年1 月至6 月就診于西安市兒童醫(yī)院的15 例經(jīng)16S rDNA 測序鑒定為肺炎鏈球菌BM 新生兒為研究對象，男 6 例，女 9 例，年齡 2～20 天。 其中10 例培養(yǎng)陽性，5 例培養(yǎng)陰性。

1.2 方法

1.2.1 CSF 培養(yǎng)

嚴(yán)格無菌操作采集每位患兒CSF 標(biāo)本2～4 ml，其中1ml 注入BD 公司EDTA-K2 抗凝管， 剩余進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性細(xì)菌經(jīng)VITEK 全自動細(xì)菌生化藥敏鑒定儀鑒定到種。 質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.2.2 DNA 提取

將 1mlCSF 標(biāo)本 12 000 rpm 離心 5 min， 取最下層沉淀，應(yīng)用QIAamp Blood DNA Mini Kit 試劑盒，提取步驟見參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.3 16S rDNA 擴(kuò)增及測序比對

PCR 反應(yīng)體系及條件見參考文獻(xiàn)[6]。 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序， 測序結(jié)果在GenBank 中 BLAST 比對。

1.2.4 FQ-PCR

應(yīng)用伯樂CFX96TMReal-time 定量 PCR 系統(tǒng)，特異性引物參照文獻(xiàn)[7]，5’-ACGCAATCTAGCAGATGAA GCA-3’，5’-TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT-3’， 擴(kuò)增肺炎鏈球菌 lytA 基因。 20 μl 反應(yīng)體系，10 μl SYBR Green Realtime PCR Mix，引物（10 μM）各 0.8 μl，模板2μl，ddH2O6.4 μl。 反應(yīng)程序：95°C 預(yù)變性 5 min，進(jìn)入循環(huán) 95°C 變性 10 sec，60°C 退火 15 sec，72°C 延伸35 sec （采集熒光）。 40 個循環(huán)后分析溶解曲線：Melt curve 65°C→95°C，Increment 0.5°C，5 sec。 最后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（Standard Curve）、溶解曲線（Melt Curve）的 Ct值等數(shù)據(jù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。 計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組間計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎鏈球菌定量結(jié)果

熔解曲線分析為單一峰圖， 無非特異性擴(kuò)增，如圖1 所示。

圖1 肺炎鏈球菌熒光定量PCR 結(jié)果

2.2 15 例臨床樣本培養(yǎng)、FQ-PCR 及相關(guān)指標(biāo)結(jié)果

15 例CSF 樣本的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果如表1 所示， 其中 10 例培養(yǎng)陽性標(biāo)本細(xì)菌載量 Ct 均值為19.52（19.52±4.32），5 例培養(yǎng)陰性標(biāo)本細(xì)菌載量 Ct 均值為 31.32 （31.32±1.74）， 二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.793，P<0.05），說明培養(yǎng)陽性率與 CSF 中細(xì)菌含量有關(guān)。 筆者將10 例培養(yǎng)陽性設(shè)定為“低Ct 值組”，5例培養(yǎng)陰性設(shè)定為“高Ct 值組”，通過分析發(fā)現(xiàn)：“低Ct 值組”發(fā)熱的例數(shù)較“高Ct 值組”多；腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)“低 Ct 值組”72.19（72.19±26.27）與“高 Ct 值組”37.64 （37.64±13.71） 二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=2.725，P<0.05）； 腦脊液蛋白含量 “低 Ct 值組”1.80（1.80±0.77）與“高 Ct 值組”0.86（0.86±0.30）二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.607，P<0.05）；腦脊液葡萄糖含量“低 Ct 值組”1.55（1.55±0.46）與“高 Ct 值組”2.46（2.46±0.80） 二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=-2.825，P<0.05）；外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)“低 Ct 值組”10.52（10.52±3.11）與“高 Ct 值組”6.88（6.88±2.52）二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.313，P<0.05）；而嘔吐、黃疸、驚厥、囟門膨脹、腦膜刺激征、肌張力改變等的表現(xiàn)在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 另外，C-反應(yīng)蛋白（CRP）含量“低Ct值組”4.72（4.72±2.41）與“高 Ct 值組”2.50（2.50±0.97）二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.950，P>0.05）。 （見表 2）

表1 15 例腦脊液標(biāo)本相關(guān)檢測結(jié)果

表2 低Ct 值組與高Ct 值組臨床表現(xiàn)和檢測結(jié)果的比較

3 討論

BM 為病原菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)， 嚴(yán)重危害新生兒生命健康，病死率高[8]，常會引發(fā)不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[9，10]，而尤以肺炎鏈球菌性BM 后遺癥發(fā)生率最高，患兒預(yù)后最差。 目前，BM 的病原學(xué)診斷主要依靠CSF 培養(yǎng)，但培養(yǎng)法敏感性低、耗時久且無法準(zhǔn)確定量，延誤最佳診治時機(jī)，而FQ-PCR 可為快速檢測CSF 中病原菌提供新方法。 本研究利用FQ-PCR 可以定量檢測的優(yōu)勢將定量結(jié)果與相關(guān)臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行比較， 以求探討肺炎鏈球菌載量對患兒的影響，為疾病預(yù)后和轉(zhuǎn)歸提供依據(jù)。

本研究納入的15 例樣本均經(jīng)16S rDNA 測序比對為肺炎鏈球菌性BM，其中10 份培養(yǎng)陽性，5 份培養(yǎng)陰性； FQ-PCR 均得到擴(kuò)增曲線。 定量結(jié)果顯示10份培養(yǎng)陽性標(biāo)本細(xì)菌載量Ct 值在13.1~27.1 （均值為19.52），5 例培養(yǎng)陰性標(biāo)本 Ct 值在 29.3-33.8 （均值為31.32），二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明培養(yǎng)陽性率與腦脊液細(xì)菌含量有關(guān)，一般需達(dá)到103CFU/ml 以上。

兒童肺炎鏈球菌性BM 臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白水平均會增高，腦脊液葡萄糖含量會下降[11]，但上述表現(xiàn)與腦脊液肺炎鏈球菌含量的關(guān)系目前報道較少。 本研究通過將10 例培養(yǎng)陽性設(shè)定為 “低Ct 值組”，5 例培養(yǎng)陰性設(shè)定為“高Ct 值組”，可發(fā)現(xiàn)：臨床表現(xiàn)方面，發(fā)熱的例數(shù)在“低 Ct 值組”較“高 Ct 值組”多，而嘔吐、黃疸、驚厥、囟門膨脹、腦膜刺激征、肌張力改變等的表現(xiàn)在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明新生兒由于囟門和顱骨未閉，其腦膜刺激征等表現(xiàn)不明顯，但發(fā)熱可能與CSF 病原菌含量有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)室檢查方面，“低Ct 值組” 與“高 Ct 值組”在腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)（t=2.725，P<0.05）、腦脊液蛋白含量（t=2.607，P<0.05）和腦脊液葡萄糖含量（t=-2.825，P<0.05）上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明細(xì)菌載量越高，腦脊液白細(xì)胞數(shù)和蛋白含量越高，而葡萄糖含量越低。 值得注意的是，二者在外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)上也有差異（t=2.313，P<0.05），這在無法得到腦脊液標(biāo)本而僅能得到外周血標(biāo)本的病例中有提示意義，外周血白細(xì)胞含量高（>1010）的病例其CSF 細(xì)菌載量也高。另外，CRP 含量“低 Ct 值組”與“高 Ct 值組”間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.950，P>0.05）。 本文針對后遺癥發(fā)生率較高的肺炎鏈球菌性BM 進(jìn)行研究，該細(xì)菌引起新生兒細(xì)菌性BM 的比例較低，因此僅納入10例培養(yǎng)陽性和5 例培養(yǎng)陰性，后續(xù)可收集更多的標(biāo)本以得到更多數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可得到更客觀真實(shí)的結(jié)果。

FQ-PCR 檢測快、敏感度高、定量精確且重復(fù)性好[12]，能夠?qū)崟r動態(tài)監(jiān)測，是一種很好的檢測方法，但本研究僅探討了肺炎鏈球菌引起的腦膜炎，其他病原菌感染是否也存在上述現(xiàn)象，在其他年齡段兒童中是否有不同的表現(xiàn)仍需進(jìn)一步探討。

本研究表明腦脊液培養(yǎng)陽性率與細(xì)菌載量有關(guān)，需達(dá)到103CFU/ml 以上；細(xì)菌載量越高，發(fā)熱表現(xiàn)越明顯，腦脊液相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查值越高，說明病情越嚴(yán)重，預(yù)后越差；實(shí)時FQ-PCR 可用于新生兒細(xì)菌性BM的快速診斷，其定量結(jié)果對患兒臨床表現(xiàn)、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸具有提示作用。