許文娟 丁葵英 田國寧 劉文鵬 王洪濤 宮小明

濰坊海關(guān) 山東濰坊 261041

氯霉素是一種抑菌性廣譜抗生素，用于治療由傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、流感桿菌、布氏桿菌、肺炎球菌等引起的感染，性質(zhì)極其穩(wěn)定，但因?qū)υ煅到y(tǒng)有嚴(yán)重不良反應(yīng)，故已嚴(yán)格控制使用[1,2]。2019年12月27日發(fā)布的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告(第250號)，已將氯霉素列入食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單[3]。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，是當(dāng)前檢測氯霉素含量的首選方法[4～7]，如國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 20756-2006可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、《GB 29688-2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)牛奶中氯霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》等。

測量不確定度是指“與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，它表征了可以合理的賦予被測量的量值分散程度”[8]。任何定量檢測工作，都會存在系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差，為了使檢測結(jié)果更可靠，準(zhǔn)確識別這些誤差來源，并以不確定度的形式與檢測結(jié)果一起報(bào)告，是必要的[9～11]。CNAS-CL01：2008《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》規(guī)定“開展檢測的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)評定測定不確定度”。

本研究以《GB/T 22338-2008動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》為檢測方法，按照CNAS-CL01-G003《測量不確定度的要求》及CNAS-GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》等文件要求[12,13]，對獸藥實(shí)驗(yàn)室必須掌握的雞肉中氯霉素的檢測方法，進(jìn)行了不確定評定，以期為同行業(yè)研究者提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀1290-6460，美國安捷倫公司；

電子天平XS303S，德國梅特勒公司；

移液槍Eppendorf，德國Eppendorf公司；

均質(zhì)器IKA TA25，德國IKA公司；

振蕩器IKA MSI，德國IKA公司；

高速冷凍離心機(jī)Eppendorf 5810R，德國Eppendorf公司；

氮吹儀N-EVAP-111，美國Organomation公司。

1.2 樣品與試劑

氯霉素陰性雞肉樣品，氯霉素陽性雞肉樣品。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(1 000μg/mL，壇墨)；氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 μg/mL，壇墨)。

1.3 測定方法

本實(shí)驗(yàn)雞肉樣品中氯霉素的含量采用《GB/T 22338-2008動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》方法測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.4.1 外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

吸取購入的1 000μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液100μL，以定容液稀釋到100μg/mL。繼續(xù)分別稀釋成1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液及10ng/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

吸取100μg/mL氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)10μL，以定容液稀釋到1μg/mL，最終稀釋成濃度為20ng/mL的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 測定

儀器條件按照《GB/T 22338-2008》設(shè)定，將標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品定容液分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，用校準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量計(jì)算氯霉素殘留量。本文中用于不確定度評定的氯霉素陽性樣品，進(jìn)行兩次平行實(shí)驗(yàn)，其稱樣量及儀器測定結(jié)果為：測試1，5.011g，0.5423μg/kg；測試2，5.042g，0.5530μg/kg。

1.6 數(shù)學(xué)模型

采用內(nèi)標(biāo)法定量，按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

C為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中待測組分的濃度，單位為ng/mL；

Ci為樣品中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為ng/mL；

A為樣品中待測組分的峰面積；

Asi為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；

V為樣品定容體積，單位為mL；

Csi為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，單位為ng/mL；

Ai為樣品溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；

As為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中待測組分的峰面積；

W為樣品稱樣量，單位為g。

1.7 不確定度來源分析

見表1。

表1 測定雞肉中氯霉素含量的相對不確定度一覽表

從測量過程和數(shù)學(xué)模型分析，本方法測定雞肉中氯霉素的不確定度主要來自：測量的重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品前處理過程(樣品稱重、最終上機(jī)液定容)、校準(zhǔn)曲線，其分量符號及來源分析見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 A類不確定度(重復(fù)性)urel(A)

制備10個空白樣品，添加一定濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行前處理和上機(jī)檢測的完整過程，重復(fù)測量10次，測量結(jié)果見表2。通過標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算測量重復(fù)性引入的不確定度分量。

表2 10次重復(fù)測量的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

(2)

按照相對不確定度公式(3)計(jì)算，

(3)

2.2 天平稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel(B1)

待測樣品平行稱樣量為5.011g和5.042g，按照公式(4)計(jì)算相對不確定度：

(4)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B2)

2.3.1 氯霉素外標(biāo)引入的不確定度

查詢氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，其標(biāo)準(zhǔn)值1 000μg/mL，相對擴(kuò)展不確定度為2%(k=2)，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(5)

2.3.2 氯霉素內(nèi)標(biāo)引入的不確定度

查詢氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，其標(biāo)準(zhǔn)值100μg/mL，相對擴(kuò)展不確定度為3%(k=2)，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(6)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度按公式(7)計(jì)算：

(7)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B3)

器具最大允差及相對不確定度見表3。

表3 器具最大允差及相對不確定度

購入的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為1 000μg/mL液體標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制過程無需稱量，僅使用移液槍和容量瓶進(jìn)行逐級稀釋。按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》(JJG 196-2006)[14]、《移液器檢定規(guī)程》(JJG 646-2006)[15]各器具引入的相對不確定度見表3。

2.4.1 氯霉素外標(biāo)稀釋過程的不確定度

用100μL移液槍吸取1 000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品100μL，用1 000μL移液槍吸取900μL定容液，先后置于1.5mL具塞離心管中，混勻，配制成100μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。此過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為公式(12)：

(12)

用10μL移液槍吸取100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，用1 000μL移液槍吸取990μL定容液，先后置于1.5mL具塞離心管中，混勻，配制成1μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液。此過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為公式(13)：

(13)

用1 000μL移液槍吸取1μg/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液500μL，用50mL容量瓶定容至刻度，稀釋成濃度為10ng/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。此過程產(chǎn)生的相對不確定度為公式(14)：

(14)

綜上，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程的相對不確定度為公式(15)：

urel(B3-1)=

(15)

2.4.2 氯霉素內(nèi)標(biāo)稀釋過程引入的不確定度

購入的氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)濃度為100μg/mL，稀釋到1μg/mL，產(chǎn)生相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.66×10-2(同公式13)。用1 000μL移液槍吸取1μg/mL氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)中間液1 000μL，用50mL容量瓶定容至刻度，稀釋成20ng/mL的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)工作液。此過程產(chǎn)生的相對不確定度為公式(16)：

(16)

因此，氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)配制過程中產(chǎn)生的相對不確定度urel(B3-2)見公式(17)：

urel(B3-2)=

(17)

本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B3)按公式(18)計(jì)算：

(18)

2.5 前處理定容引入相對不確定度urel(B4)

上機(jī)樣品定容使用1 000μL移液槍，產(chǎn)生的相對不確定度按公式(19)計(jì)算：

(19)

2.6 校準(zhǔn)曲線引入相對不確定度urel(B5)

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(c)為橫坐標(biāo)x，氯霉素外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(I)為縱坐標(biāo)y擬合得到校準(zhǔn)曲線，方程為y=21.397258x-0.364913，r2=0.999。校準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)及對應(yīng)的峰面積見表4。

表4 校準(zhǔn)曲線濃度及峰面積

按照公式(20)計(jì)算校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度，計(jì)算過程涉及的參數(shù)見表5。

(20)

表5 校準(zhǔn)曲線不確定度公式對應(yīng)參數(shù)

(21)

計(jì)算得到u(c0)=0.0124μg/kg，由此可按公式(22)計(jì)算urel(B5)：

urel(B5)=u(c0)/c0=0.0226

(22)

2.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc

實(shí)驗(yàn)室實(shí)際測得雞肉樣品中的氯霉素含量為0.548μg/kg，由公式(23)計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定：

(23)

經(jīng)計(jì)算uc為0.042μg/kg。

2.8 擴(kuò)展不確定度UP

取置信水平P=95%，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度為公式(24)：

UP=k×uc=2×0.042=0.084μg/kg

(24)

2.9 結(jié)果報(bào)告

本文中雞肉中氯霉素殘留量的測試結(jié)果報(bào)告為公式(25)：

(25)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定了雞肉中的氯霉素殘留量，并評定了整個過程的測量不確定度。結(jié)果表明，在氯霉素的測定過程中，對最終測量不確定度貢獻(xiàn)最大的是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過程，其次分別為校準(zhǔn)曲線擬合、測量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度和前處理定容過程，天平稱量引入的不確定度在本實(shí)驗(yàn)中可以忽略。因此，實(shí)際檢測中，要采用經(jīng)過檢定的容器進(jìn)行標(biāo)物物質(zhì)的配制和稀釋，且盡量減少稀釋次數(shù)。校準(zhǔn)曲線擬合采用6個以上的校準(zhǔn)濃度，可以降低不確定度。另外，可通過提高儀器穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)人員操作穩(wěn)定性，較少隨機(jī)誤差，降低測定過程重復(fù)性引入的不確定度?？傊?，通過全面評定測量不確定度，可以使報(bào)告結(jié)果更可信，也可針對不確定度分量大小改進(jìn)實(shí)驗(yàn)過程，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。