梁嬌，張鷹，劉曉彤，趙文紅，錢敏，白衛(wèi)東

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣東 廣州 510225）

蓮子心（Plumula nelumbinis）又名蓮薏、薏，是睡蓮科水生草本植物蓮的成熟種子的胚根，長約1.0 cm～1.5 cm，直徑約2 mm，呈綠褐色，質(zhì)脆，易折斷，橫截面為小孔狀，是一種中草藥[1]。蓮子心在亞熱帶和溫帶地區(qū)均有產(chǎn)出，在我國黑龍江、海南等地均有種植。

蓮子心氣微，味苦、微寒，歸心、腎經(jīng)，是我國的傳統(tǒng)中藥之一，據(jù)《本草綱目》記載，蓮子心具有清心安神、交通心腎和澀精止血的功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，蓮子心含有生物堿、黃酮、甾醇、揮發(fā)油和微量元素等化學成分；植物甾醇的生物學活性和功能頗多，具有抗氧化[3]、降血脂[4]、消炎退熱[5-6]、抗腫瘤[7-8]和類激素[9]等多種生理功效。對甾醇的提取主要通過索氏提取法、超聲輔助提取法[10]、微波輔助提取法[11]、超臨界流體萃取法[12]等，其中索氏提取法具有能耗低、操作簡便、得率高等優(yōu)點[13]。因此，為了促進蓮子心資源的開發(fā)利用和深入研究，本文以蓮子心為原料，采用響應面法優(yōu)化索氏提取甾醇工藝。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

蓮子心：湖南蓮美食品股份有限公司；β-谷甾醇、N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷（99%+1%）、脂肪酸甲酯混標：上海安譜實驗科技股份有限公司；丙酮、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、無水乙醇、濃硫酸、乙酸酐、正庚烷（均為分析純）：上海國藥試劑集團。

1.2 試驗儀器

LHS-160CL電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技儀器有限公司；UV3000PC紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；8890 GC-5977B MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、7820A GC氣相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蓮子心粉的制備

原料預處理：采用電熱恒溫鼓風干燥箱在65℃下將蓮子心烘干至恒重，將風干后的蓮子心倒入高速粉碎機中打磨成粉狀，將蓮子心粉末分別過20、40、60、80目篩，備用。

1.3.2 蓮子心粉中甾醇的提取

精密稱取10.00 g蓮子心粉，以丙酮為溶劑，用索氏提取器提取一定時間，得到溶劑提取液，70℃下旋蒸除盡溶劑，置于105℃烘箱中干燥至恒重，得蓮子心油脂浸膏。

1.3.3 Liebermann-Burchard法測定甾醇含量

精密稱取β-谷甾醇標準品10 mg，用乙酸酐溶解，定容至10 mL，使其濃度為1.0 mg/mL。依次吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 容量瓶，乙酸酐補足至刻度線，定容，搖勻。然后依次滴加50 μL濃硫酸反應10 min后，在660 nm測定吸光度，以β-谷甾醇標準濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。得到回歸方程：y=10.831x-0.002 6，相關系數(shù)R2=0.999 1。根據(jù)方程可知β-谷甾醇標準曲線的回歸性較好，可進行定量分析。

取蓮子心油脂浸膏5 mg，用乙酸酐溶解并定容至10 mL，在50℃恒溫水浴中超聲波振蕩30 min，取出冷卻至常溫（30℃），滴加50 μL濃硫酸，振蕩搖勻，放置約10 min后，于660 nm處測定吸光度。根據(jù)線性回歸方程計算甾醇濃度C，再通過公式（1）計算得出蓮子心的甾醇得率Y[14]。

式中：Y為蓮子心的甾醇得率，mg/g；C為提取浸膏的甾醇濃度，mg/mL；V 為定容體積，mL；m1為蓮子心提取出的浸膏總質(zhì)量，g；m2為稱取的浸膏質(zhì)量，mg；M為蓮子心粉總質(zhì)量，g。

1.3.4 氣相色譜-聯(lián)用質(zhì)譜分析蓮子心中的單體甾醇

參考王多嬌等[15]的方法并加以改進：稱取50 mg蓮子心浸膏于離心管中，加入2 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液5 mL，室溫（30℃）下超聲混勻5 min；于60℃烘箱中皂化60 min。冷卻至室溫（30℃）后，加入4 mL水和5 mL正己烷，渦旋混合振蕩提取2 min，4 500 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上層有機相至15 mL離心管中；向上述50 mL離心管中加入5 mL正己烷，再次提取，合并兩次提取液，加入1.5 g無水硫酸鈉，靜置至澄清透明。轉(zhuǎn)移1 mL上清液至反應瓶中，用氮氣吹干溶劑后加入100 μL N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷，密封后于105℃烘箱中反應15 min，冷卻至室溫（30℃）供分析。甾醇定量采用面積歸一化法，按公式（2）計算甾醇相對含量。

氣相色譜（gas chromatography，GC）條件：色譜柱HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣氦氣；流速0.7 mL/min；進樣量1 μL；進樣口溫度320℃；程序升溫為起始溫度180℃，以4℃/min升至300℃，保持 25 min；分流比 60∶1。

質(zhì)譜（mass spectrum，MS）條件為 Agilent 5977B 質(zhì)譜檢測器，傳輸線溫度250℃；離子源溫度230℃；電子電離模式；溶劑延遲時間10 min；全掃描模式（full scan）；分子離子碎片掃描范圍m/z 50～650。

1.3.5 氣相色譜分析蓮子心中的單體脂肪酸

參考李玲芳等[16]方法并加以改進：稱取10 mg蓮子心浸膏于離心管中，加入2 mL正庚烷，4 mol/L KOH-甲醇溶液，室溫（30℃）渦旋3 min，靜置分層，取1 mL正庚烷溶液層稀釋至10 mL，取1 mL稀釋液過0.22 μm孔有機相濾膜，進氣相色譜分析。根據(jù)樣品色譜峰保留時間與標準品保留時間比較判定單體脂肪酸種類，脂肪酸定量采用面積歸一化法，按公式（3）計算脂肪酸相對含量。

GC分析條件：Agilent 7820A氣相色譜儀；色譜柱為TR-FAME（100 m×0.25 mm×0.2 μm）；進樣口溫度260℃；進樣量1 μL；分流比 10∶1；載氣氮氣（99.999%）；流量1 mL/min；檢測器溫度：260℃；升溫程序為起始溫度60℃，保持1 min，以20℃/min升至160℃，再以4℃/min升至200℃，保持10 min，再以2℃/min升至240℃，保持10 min。

1.3.6 蓮子心油脂浸膏提取單因素試驗設計

以甾醇得率為指標，通過單因素試驗對影響得率的各因素進行考察。單因素試驗選定料液比[1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21（g/mL）]、提取時間（2、4、6、8、10 h）、提取溫度（66、70、74、78、82 ℃）、物料粒徑（0、20、40、60、80目）4個因素。

1.3.7 響應面試驗設計

在1.3.6的單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken中心組和設計，以蓮子心的粗甾醇得率為響應值（Y），選取料液比、提取時間、提取溫度和物料粒徑為自變量，采用四因素三水平的響應曲面分析方法，因素與水平見表1。

表1 響應面設計因素水平Table 1 Factors and levels of response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮子心索氏提取甾醇單因素結(jié)果分析

2.1.1 料液比的選擇

料液比對蓮子心中甾醇得率的影響如圖1所示。

圖1 不同料液比對甾醇得率的影響Fig.1 The effect of different material-liquid ratio on sterol yield

由圖1可知，隨著溶劑比例的增加，浸提溶液中的甾醇得率降低，固液兩相甾醇濃度梯度增加，使得甾醇溶出速度提升，得率增大。當料液比為1∶15（g/mL）時，甾醇得率高達18.682（mg/mL），而后隨著溶劑用量增大而減少，則應選擇料液比為1∶15（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.1.2 提取時間的選擇

提取時間對蓮子心中甾醇得率的影響如圖2所示。

圖2 不同提取時間對甾醇得率的影響Fig.2 Effect of different extraction time on sterol yield

由圖2可知，提取時間小于6 h時，蓮子心甾醇得率隨著提取時間延長而提高，這是由于提取時間過短，甾醇溶解不充分，溶劑對甾醇的溶解能力未達到飽和，提取不完全。但當提取時間大于6 h時，蓮子心甾醇得率隨著提取時間延長而降低，原因是隨提取時間增長可能提取出其他成分，造成蓮子心甾醇得率降低，則應選擇提取時間6 h進行后續(xù)試驗。

2.1.3 提取溫度的選擇

提取溫度對蓮子心中甾醇得率的影響如圖3所示。

圖3 不同提取溫度對甾醇得率的影響Fig.3 The effect of different extraction temperature on sterol yield

由圖3可知，提取溫度小于74℃時，甾醇得率隨著提取溫度的升高而迅速增加，這是由于一定溫度范圍內(nèi)，溶劑在蓮子心粉末中擴散速度加快，分子間碰撞幾率增加，甾醇得率增加。提取溫度大于74℃時，溫度接近丙酮沸程頂端，丙酮回流速度過快，其在提取管中時間過短，難以充分提取甾醇，使甾醇得率降低，則應選擇提取溫度74℃進行后續(xù)試驗。

2.1.4 物料粒徑的選擇

物料粒徑對蓮子心中甾醇得率的影響如圖4所示。

圖4 不同物料粒徑對甾醇得率影響Fig.4 The effect of different raw material meshes on sterol yield

由圖4可知當物料粒徑低于40目時，蓮子心甾醇得率隨目數(shù)增大而提高，蓮子心粉末與溶劑接觸面增大，使甾醇得率增高。當物料粒徑高于40目時，蓮子心甾醇得率隨著目數(shù)增加而平緩降低，應選擇40目的物料粒徑。

2.2 響應面分析法優(yōu)化工藝

2.2.1 響應面試驗設計及結(jié)果

在單因素試驗的基礎上，采用Design-Expert 11.0軟件對響應曲面試驗進行分析設計，以蓮子心植物甾醇得率為指標（Y），提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、物料粒徑（D）4個響應因素，Box-Behnken試驗設計與結(jié)果見表2。

表2 響應面設計及結(jié)果Table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析

用Design-Expert 11.0軟件對試驗結(jié)果進行回歸分析，得到提取溫度、提取時間、物料粒徑和料液比對蓮子心甾醇得率影響的二次多項式回歸模型方程：Y=17.65+0.09A+0.88B+5.07C+0.56D-1.34AB+0.82AC+0.18AD+0.28BC-1.36BD+0.63CD-1.03A2-2.01B2-6.26C2-0.94D2。

方差分析結(jié)果如表3所示。

對模型進行方差分析，方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映各因素對響應值的影響程度。由表3可知，模型的P＜0.000 1，說明回歸方程極顯著，失擬項P=0.181 8＞0.05（不顯著），說明回歸方程與實際情況有較好的吻合，試驗誤差小。由R2=0.984 5，R2adj=0.969 0，表明本試驗擬合程度較高，能夠較好地預測蓮子心甾醇的優(yōu)化條件。由F檢驗可知，影響蓮子心甾醇得率的主次因素順序為物料粒徑（C）＞提取時間（B）＞料液比（D）＞提取溫度（A）。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

方差分析P值結(jié)果可知，D、A2的P＜0.05，說明這些因素對蓮子心甾醇得率影響顯著；B、C、AB、BD、B2、C2的P＜0.01，說明這些因素對蓮子心甾醇得率影響極顯著；其余因素均對蓮子心甾醇得率不顯著。

2.2.3 響應曲面分析

響應曲面圖能直觀地反映任意兩因素對甾醇得率的影響，具體交互影響結(jié)果見圖3。

由圖5可知，提取溫度和提取時間、提取時間與料液比交互作用等高線呈橢圓形，說明兩因素間交互作用顯著；提取溫度與物料粒徑、提取溫度與料液比、提取時間與物料粒徑、物料粒徑與料液比兩因素交互作用不顯著。

圖5 響應面因素交互作用3D曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface factor interaction 3D surface map and contour map

2.2.4 最佳工藝的預測和驗證

利用模型進行預測，所得蓮子心甾醇的最佳提取工藝為提取溫度75.056℃、提取時間6 h、物料粒徑48.914 目、料液比 1∶15.946（g/mL），此時蓮子心甾醇得率可達18.924 mg/g。結(jié)合上述分析與實際試驗操作，將最優(yōu)提取條件修正為提取溫度75℃、提取時間6 h、物料粒徑40目、料液比1∶16（g/mL）。修正后的試驗進行3次平行試驗，最終得到平均甾醇得率為（18.690±0.034）mg/g，與理論值相差0.234 mg/g，差距較小，證明該工藝穩(wěn)定可靠，具有實際應用價值。陳佳麗等[17]通過溶劑攪拌法提取蓮子心中甾醇，蓮子心總甾醇得率為（1.67±0.11）%，本法與該研究相比甾醇得率略有提高但是時間耗費較多，在實際操作中操作簡便且溶劑用量較小。Bukhanko等[18]研究也說明索氏提取法更便于從從云杉樹皮中提取甾醇和萜烯、從云杉球果中分離提取物。Koz?owska等[19]研究發(fā)現(xiàn)Folch法相對于索氏提取法甾醇得率略高10%左右，但Folch法使用的溶劑是氯仿和甲醇，其危險性和費用相對較高。

2.3 甾醇相對含量分析

通過GC-MS對蓮子心中甾醇成分進行分析，其總離子流圖見圖6。經(jīng)NIST17.L標準質(zhì)譜圖檢索并采用峰面積歸一化法確定甾醇組成及相對含量見表4。

表4 甾醇組成及相對含量Table 4 Sterol composition and relative content

圖6 蓮子心甾醇總離子流圖Fig.6 Total ion current diagram of sterols from Plumula nelumbinis

蓮子心浸膏中鑒定的甾醇共有10種，其中含量最高的是β-谷甾醇，占甾醇含量的48.32%，其次是巖藻甾醇（21.91%）和菜油甾醇（13.76%），其它甾醇含量相對較低。Chanioti等[20]對橄欖渣油中的甾醇含量測定，其中主要的甾醇為β-谷甾醇、菜籽甾醇和豆甾醇。Dabrowski等[21]也在亞麻籽油中測得β谷甾醇和環(huán)羊毛甾醇-23-烯-3，25-二醇的含量較高，還發(fā)現(xiàn)菜油甾醇、豆甾醇，可見不同種子油中的甾醇種類和含量存在差異。明確蓮子心中甾醇的組成，有助于蓮子心活性成分的評價。

2.4 脂肪酸含量分析

脂肪酸混合標樣與蓮子心中脂肪酸檢測結(jié)果見圖7，脂肪酸組成及相對含量見表5。

如圖7所示，各脂肪酸甲酯組分在混合標樣中均有良好的分離度。結(jié)合表5看，蓮子心中主要的脂肪酸單體是亞油酸（56.75%）和棕櫚酸（19.85%）。Wang等[22]將文冠果、扁桃、翅果油樹、牡丹4種種子和茶籽油中的脂肪酸種類鑒定為油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸。與蓮子心中主要的脂肪酸種類相似。

表5 脂肪酸組成及相對含量Table 5 Fatty acid composition and relative content

圖7 脂肪酸標準品總離子流圖和蓮子心脂肪酸總離子流圖Fig.7 Fatty acid standard total ion current chart and Plumula nelumbinis fatty acid total ion current chart

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎上，采用響應面法進行優(yōu)化，確定蓮子心中甾醇最優(yōu)提取工藝為提取溫度75℃、提取時間 6 h、物料粒徑 40 目、料液比 1∶16（g/mL），最終平均甾醇得率為（18.690±0.034）mg/g。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定蓮子心中主要單體甾醇為β-谷甾醇、巖藻甾醇和菜油甾醇；其相對含量分別為13.76%、48.32%和21.91%。采用氣相色譜測定蓮子心中主要的單體脂肪酸為亞油酸（56.75%）和棕櫚酸（19.85%），本研究應用響應面法優(yōu)化索氏提取蓮子心中總甾醇的提取工藝，同時分析了蓮子心中總甾醇的種類，并對蓮子心中脂肪酸種類進行了初步鑒定，為蓮子心資源充分利用的進一步研究提供參考。