姬妍茹，楊慶麗，張正海，董艷，石杰，高寶昌，田媛，李國(guó)巍

（黑龍江省科學(xué)院 大慶分院，黑龍江 大慶 163319）

菊芋（jerusalem anichoke）俗稱洋姜，菊科向日葵屬草本植物。菊芋含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維和硒等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和多種生理功能[1]。鮮菊芋多糖（菊糖）是菊芋的主要功效成分，占其干重的70%以上，具有雙向調(diào)控血糖、改善腸道、防治便秘、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、預(yù)防肥胖、降血脂、抗腫瘤和提高免疫力等生理功能[2]。菊芋多糖由果聚糖組成，是已被科學(xué)論證過(guò)的符合益生元定義的不易被人體消化的多糖[3-4]。菊糖在人體的上消化道中不會(huì)發(fā)生消化分解，部分菊糖在結(jié)腸中可被益生菌發(fā)酵產(chǎn)生很少的熱量[5-7]和短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）[8]，能夠發(fā)揮改善腸道微環(huán)境，有效預(yù)防便秘等多種生理功效[9]。菊芋塊莖不耐貯存，通常直接炒食或者腌制成醬菜，口感脆硬，基本無(wú)甜味；黑菊芋是以鮮菊芋為原料，利用獨(dú)特的齒變加熱工藝加工而成的一種類似果脯的新型功能食品。前期研究發(fā)現(xiàn)，菊芋加工成黑菊芋后，糖類的構(gòu)成和含量顯著改變，總糖含量有所降低，果聚糖分解為果糖、葡萄糖、蔗糖和低聚果糖等小分子糖類，還原糖含量顯著增加，占總糖含量的40%以上，是加工前的幾十倍，因而黑菊芋呈現(xiàn)香甜的口感[10]。

菊糖的制備流程一般分為預(yù)處理、提取和純化三步。預(yù)處理主要包括熱燙滅酶和干制，提取方法主要包括熱水浸提法、微波輔助法、超聲輔助法和酶解法，純化方法主要有鹽析法、石灰沉淀法、溶劑萃取法、透析法、離子交換法、色譜法以及酶解法等[11]。鮮菊芋經(jīng)高溫加工成黑菊芋，其中的多酚氧化酶被滅活，多糖組成發(fā)生較大改變。因此，在提取黑菊芋多糖時(shí)，可以取消熱燙滅酶的預(yù)處理步驟。本研究采用超聲波輔助法提取黑菊芋多糖，并通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，通過(guò)傅立葉紅外光譜（Fourier transform infra red，F(xiàn)T-IR）對(duì)得到的多糖組分進(jìn)行表征，并對(duì)多糖的益生活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑菊芋：以紅果菊芋為原料，利用黑龍江省科學(xué)院大慶分院自制設(shè)備加工而成；果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖（均為色譜純）：北京中科儀友化工研究院；植物乳桿菌菌株ZL9、干酪乳桿菌菌株GL6：黑龍江省科學(xué)院微生物所；無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸、3，5-二硝基水楊酸（均為國(guó)產(chǎn)分析純）：上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40SCI）：上海申安醫(yī)療儀器廠；高速離心機(jī)（GT10-1）：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司冷凍干燥機(jī)（VFD-4500）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超聲波清洗儀（KQ3200）：昆山市超聲儀器有限公司；高效液相色譜（LC-15C）：日本島津公司；酶標(biāo)儀（Epoch）：美國(guó) BioTek公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑菊芋多糖的提取

稱取10.0 g黑菊芋，切成1.5 cm左右的薄片，用50mL的蒸餾水80℃恒溫浸提16h，勻漿，然后以150W功率按照一定的超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比進(jìn)行提取，六層紗布過(guò)濾，4 000 r/min離心10 min，取上清，即為黑菊芋粗多糖溶液。

1.3.2 黑菊芋多糖提取工藝優(yōu)化

分別以超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比為影響因子進(jìn)行單因素試驗(yàn)。各因子設(shè)5個(gè)水平，超聲溫度設(shè)為 60、70、80、90、100 ℃，超聲時(shí)間設(shè)為 40、50、60、70、80 min，料液比設(shè)為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。提取液離心取上清液，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[12]，計(jì)算多糖得率，確定單因素最佳條件。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定黑菊芋多糖的最佳提取工藝，多糖得率計(jì)算公式如下。

1.3.3 黑菊芋多糖的純化

向黑菊芋粗多糖溶液中加入氯仿-正丁醇（體積比4∶1）混合液多次萃取除去蛋白，直至兩相間無(wú)乳白色絮狀物。濃縮至初體積的10%，加入乙醇至最終體積分?jǐn)?shù)占比為80%，4℃條件下醇沉12 h，離心除去上清液，然后依次用無(wú)水乙醇、石油醚、丙酮洗滌，凍干，得黑菊芋多糖凍干粉。黑菊芋多糖用S-8大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附脫色除去類黑精，透析、濃縮、醇沉、洗滌、再次凍干。將DEAE纖維素柱用蒸餾水平衡好后，首先以蒸餾水對(duì)黑菊芋多糖進(jìn)行洗脫，然后用0.1 mol/L～0.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速0.6 mL/min，同時(shí)以每管10 mL收集并跟蹤檢測(cè)多糖含量，合并含糖的洗脫液，冷凍干燥得黑菊芋純化多糖，經(jīng)300 Da的透析膜透析后用于益生活性的評(píng)價(jià)。

1.3.4 紅外光譜分析

稱取1.0 mg黑菊芋純化多糖，在瑪瑙研缽中加入100 mg KBr粉末，充分研磨均勻，壓成薄片，用紅外光譜分析儀在4 000 cm-1～400 cm-1進(jìn)行掃描。

1.3.5 紫外掃描分析

黑菊芋純化多糖凍干粉用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的溶液，用紫外分光光度計(jì)在200 nm～400 nm波長(zhǎng)下掃描，觀察記錄在波長(zhǎng)260 nm和280 nm時(shí)，黑菊芋純化多糖的吸光度。

1.3.6 各種糖分含量分析

稱取適量黑菊芋，對(duì)其主要糖分進(jìn)行檢測(cè)分析。采用苯酚-硫酸法檢測(cè)總糖含量[12]，二硝基水楊酸法檢測(cè)還原糖含量[13]；總糖含量減去還原糖含量得菊糖含量；采用GB 5009.8—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》檢測(cè)果糖、葡萄糖、蔗糖的含量[14]。

果糖的檢測(cè)條件：色譜柱為AgilentZORBAXNH2柱（5.0 μm×4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相為乙腈-水（體積比70∶30），等度洗脫，流速為 1 mL/min；進(jìn)樣量 1.0 μL；柱溫30℃。檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative lightscattering detector，ELSD），漂移管溫度 80℃～90℃，氮?dú)鈮毫?50 kPa；撞擊器:關(guān)。

低聚果糖的檢測(cè)[15]，以蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜柱：Agilent ZORBAX NH2柱（5.0 μm×4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相為乙腈-水（體積比 75∶25）。進(jìn)樣量為 5 μL～10 μL。漂移管溫度80℃～90℃，氮?dú)鈮毫?50 kPa；撞擊器:關(guān)。

1.3.7 黑菊芋純化多糖的益生活性評(píng)價(jià)

參試的乳桿菌菌株有2個(gè)，分別為植物乳桿菌ZL9和干酪乳桿菌GL6。將參試乳桿菌活化復(fù)壯備用，配制無(wú)糖的MRS液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值至6.0。按照培養(yǎng)基中葡萄糖的比例分別加入葡萄糖、果糖、低聚果糖、去除單糖的鮮菊芋純化多糖和去除單糖的黑菊芋純化多糖。無(wú)糖的培養(yǎng)基用CK表示，含有葡萄糖、果糖、低聚果糖、去除單糖的鮮菊芋純化多糖和去除單糖的黑菊芋純化多糖的培養(yǎng)基分別用代號(hào)G、F、FOS、RJPS、BJPS表示，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。然后將配制好的液體培養(yǎng)基分裝入瓶中，分裝體積為22.5 mL。以CK培養(yǎng)基作為對(duì)照，菌種接種量1%，37℃條件下厭氧培養(yǎng)，分別于0、24、48 h測(cè)OD值和pH值，計(jì)算益生指數(shù)PI值[16]。

式中：APP0和APP48分別為益生菌培養(yǎng)0、48 h的吸光值（碳源為除葡萄糖外其他糖）；APG0和APG48為碳源為葡萄糖時(shí)益生菌培養(yǎng) 0、48 h的吸光值；APN0和APN48為益生菌在CK培養(yǎng)基上培養(yǎng)0、48 h的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究中的每個(gè)處理均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，表格中的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用DPS V 7.05軟件處理數(shù)據(jù)，組間差異顯著性比較以單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行，并做 Turkey檢驗(yàn)，當(dāng) P＜0.05時(shí)表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑菊芋多糖的提取

2.1.1 單因素試驗(yàn)

不同提取條件對(duì)黑菊芋多糖得率的影響見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 不同超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic time on the yield of polysaccharide

圖2 不同超聲溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharide

圖3 不同料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effects of material liquid ratio on the yield of polysaccharide

由圖1可知，40 min～60 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加，得率逐漸升高，超聲時(shí)間60 min時(shí)，黑菊芋多糖的得率最高。這是由于超聲波的空化效應(yīng)增強(qiáng)了溶劑水進(jìn)入溶質(zhì)內(nèi)部的能力，使多糖更易于從細(xì)胞中釋放出來(lái)，縮短提取時(shí)間，提升提取率。超聲時(shí)間的長(zhǎng)短很關(guān)鍵，時(shí)間太短，原料中的多糖不能充分溶解，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多糖會(huì)降解，甚至其中的五碳環(huán)或六碳環(huán)會(huì)裂解轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁?、寡糖或低聚糖，在醇沉過(guò)程中有所損失，導(dǎo)致提取率的下降[17]。由圖2可知，采用水提法提取黑菊芋多糖，超聲溫度在60℃～70℃時(shí)，多糖的得率隨溫度升高逐漸增加，至70℃達(dá)到最高值，之后逐漸下降。原因可能是隨著溫度升高多糖的溶解度逐漸升高，前期多糖得率有所上升，但是隨著溫度的持續(xù)升高，多糖會(huì)發(fā)生分解，同時(shí)美拉德反應(yīng)加劇，多糖和氨基酸發(fā)生反應(yīng)，有所消耗，造成多糖含量的下降。由圖3可知，隨著提取劑用量的增加，多糖得率呈現(xiàn)先逐漸增加后減小的趨勢(shì)，料液比1∶20（g/mL）時(shí)多糖得率最高。這是因?yàn)樘崛∪軇┯昧康蜁r(shí)，體系水分含量較少，黑菊芋多糖無(wú)法與水充分接觸，溶解不夠充分，不利于多糖溶出，故得率較低；隨著體系含水量增加，多糖充分溶脹，得率增加。但是，提取溶劑用量過(guò)多會(huì)影響超聲處理過(guò)程中的空化效應(yīng)和機(jī)械振動(dòng)效果，反而會(huì)使多糖得率下降。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)、極差和方差分析結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 1 Orthogonal design and results

表2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 2 Analysis results of orthogonal experiments

由方差分析F值和F臨界值關(guān)系可知，超聲溫度對(duì)黑菊芋多糖得率的影響極顯著（P＜0.01），超聲時(shí)間和料液比對(duì)黑菊芋多糖得率的影響不顯著（P＞0.05）。通過(guò)極差分析可知，影響黑菊芋多糖得率的各因素主次關(guān)系依次為超聲溫度＞料液比＞超聲時(shí)間，正交分析得最佳工藝條件為A3B2C1，即超聲溫度80℃，超聲時(shí)間 60 min，料液比 1∶15（g/mL）。在最佳工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得黑菊芋多糖得率平均值為49.98%。

2.2 黑菊芋純化多糖的紅外光譜分析

黑菊芋純化多糖的紅外光譜分析見(jiàn)圖4。

圖4 黑菊芋純化多糖的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum of purified polysaccharide from black jerusalem artichoke

FT-IR分析可以作為化合物種類的鑒定依據(jù)。單糖、糖苷鍵和功能團(tuán)的種類可以通過(guò)FT-IR鑒定[18]。從圖4可以看出，受試樣品在3440cm-1處有較強(qiáng)的振動(dòng)吸收峰，表明分子間或者分子內(nèi)有-OH[19]；在2 935 cm-1有吸收峰，說(shuō)明分子內(nèi)有C-H；1 652 cm-1為-OH的彎曲振動(dòng)吸收峰[20]，1 450 cm-1為-CH（OCH2）彎曲振動(dòng)吸收峰；1 035 cm-1為-CO 伸縮振動(dòng)峰；925 cm-1～1 035 cm-1之間主要為C-C和C-O的特征吸收，說(shuō)明提取物中主要為多糖類物質(zhì)；925 cm-1和820 cm-1附近為果糖的β-糖苷鍵[21]，研究結(jié)果表明，純化得到的粉末為多糖類物質(zhì)。

2.3 黑菊芋純化多糖的紫外掃描結(jié)果

黑菊芋純化多糖的紫外掃描結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 黑菊芋純化多糖在不同波長(zhǎng)條件下的吸光度Fig.5 Absorbance of black jerusalem artichoke purified polysaccharide at different wavelengths

采用紫外分光光度計(jì)對(duì)多糖溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，可以驗(yàn)證經(jīng)氯仿-正丁醇法除蛋白和DEAE纖維素柱純化后的黑菊芋多糖的狀態(tài)。由圖5可知，黑菊芋純化多糖溶液在260 nm和280 nm處都沒(méi)有明顯的吸收峰，說(shuō)明獲得的黑菊芋樣品純度較高，其中沒(méi)有或者只有微量的蛋白質(zhì)和核酸等成分的存在。

2.4 各種糖分含量分析

果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=2 221.4X+310.7，R2=0.9993；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1 944.9X+472.4，R2=0.999 7；蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=2 597.7X+222.0，R2=0.9993。蔗果三糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=38.073X+1.066 5，R2=0.999 8；蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=29.624X+1.355 1，R2=0.998 9；蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=32.303X+2.4215，R2=0.9996。

按照1.3.6方法，測(cè)得黑菊芋的總糖含量為33.81 g/100 g，還原糖含量為9.71 g/100 g，菊糖含量為24.1 g/100 g。根據(jù)蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出黑菊芋樣品中的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖含量分別為1.63、7.92、6.22 g/100 g。這3種糖的含量占總糖含量的46.64%，菊糖含量的65.44%。推測(cè)低聚果糖是黑菊芋多糖的主要成分，且占比接近50%，這有利于其發(fā)揮益生活性。

2.5 黑菊芋多糖的益生活性

不同種類的糖對(duì)發(fā)酵液pH值的影響見(jiàn)圖6。不同乳桿菌菌株培養(yǎng)基48 h的PI值見(jiàn)表3。

圖6 含有不同種類糖的培養(yǎng)基pH值變化情況Fig.6 Changes of pH value of medium containing different kinds of sugars

表3 不同乳桿菌菌株48 h培養(yǎng)基PI值Table 3 PI value of medium of different Lactobacillus strains at 48 h

細(xì)菌對(duì)碳水化合物的利用情況可通過(guò)培養(yǎng)液的pH值變化和PI值的大小來(lái)衡量，有文獻(xiàn)表明，pH值變化與乳桿菌的生長(zhǎng)情況有相關(guān)性，乳桿菌生長(zhǎng)越快，培養(yǎng)液的pH值下降越明顯[16]。由圖6可知，以不同糖為碳源的培養(yǎng)液的pH值變化有所不同。2種乳桿菌株在CK培養(yǎng)基雖然能夠生長(zhǎng)，但其pH值均在6.4以上，說(shuō)明長(zhǎng)勢(shì)一般[16]。以葡萄糖、果糖和去除單糖的黑菊芋純化多糖為碳源的培養(yǎng)液pH值均低于4.0，而以低聚果糖和去除單糖的鮮菊芋純化多糖為碳源的培養(yǎng)液pH值在5.5到6.3之間；由表3可知，2種乳桿菌菌株發(fā)酵低聚果糖的PI值均在0.66以上，發(fā)酵去除單糖的黑菊芋純化多糖的PI值均在0.80以上，發(fā)酵去除單糖的鮮菊芋純化多糖的PI值在0.58以上。去除單糖的黑菊芋多糖對(duì)植物乳桿菌ZL9的益生活性顯著高于低聚果糖（P＜0.05），但對(duì)干酪乳桿菌菌株GL6的益生活性與低聚果糖差異不顯著（P＞0.05）；去除單糖的黑菊芋純化多糖對(duì)2種乳桿菌菌株的益生活性均顯著高于去除單糖的鮮菊芋純化多糖（P＜0.05），這與黑菊芋多糖中低聚果糖比例較高有一定的相關(guān)性，李琬聰[22]研究表明除去二聚糖外，菊糖的生物活性與聚合度之間遵循“低聚合度活性高”的規(guī)律，三聚菊糖和四聚菊糖表現(xiàn)出最佳活性。

3 結(jié)論

本研究以黑菊芋為原料，以水為溶劑，采用超聲輔助法提取黑菊芋多糖，確定了黑菊芋多糖超聲輔助提取的較優(yōu)條件為超聲溫度80℃、超聲時(shí)間60 min、料液比1∶15（g/mL），在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，黑菊芋多糖平均得率為49.98%；黑菊芋多糖組成以果糖、葡萄糖、蔗糖和低聚果糖為主，體外益生活性研究表明，黑菊芋多糖可有效促進(jìn)植物乳桿菌菌株ZL9和干酪乳桿菌菌株GL6的增殖，具有較好的益生活性。本研究為黑菊芋的推廣應(yīng)用和深度開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。