孫飛 彭昊

激素性股骨頭壞死（glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head，GIONFH）的主要病理組織病變是骨和成骨的細胞凋亡，其發(fā)病風險與激素的使用劑量和持續(xù)時間呈正相關［1-2］。Kubo等［3］通過流行病學調查發(fā)現(xiàn)發(fā)生股骨頭壞死首要相關因素是激素的使用（發(fā)病率為51%）。Cooper等［4］發(fā)現(xiàn)近兩年內全身性使用糖皮質激素是發(fā)生骨壞死的重要危險因素，其中75.9%的骨壞死發(fā)生在髖關節(jié)。Weinstein等［5］發(fā)現(xiàn)30%～50%長期使用激素的病人會出現(xiàn)骨質疏松癥性骨折，9%～40%出現(xiàn)股骨頭壞死等骨骼系統(tǒng)并發(fā)癥。Long 等［6］在一項長期接受激素治療的單中心研究中發(fā)現(xiàn)，股骨頭壞死病人中57.1%出現(xiàn)孤立的股骨頭壞死，42.9%會有多個關節(jié)受累。Al-Omari等［7］和Thompson等［8］報道髖關節(jié)炎病人單次髖關節(jié)糖皮質激素注射也會引起股骨頭壞死。多國學者達成了GIONFH 分類標準的共識［9］：①病人應有糖皮質激素使用史或者3個月內使用潑尼松龍（＞2 g）或等效藥物；②在使用糖皮質激素后2年內確診骨壞死；③病人除糖皮質激素外不應有其他危險因素。

當前，GIONFH的發(fā)病機制主要包括：脂質代謝紊亂、血管內皮損傷、凝血異常、骨內高壓、骨細胞凋亡和基因多態(tài)性等［1］。Eberhardt 等［10］發(fā)現(xiàn)接受激素治療的兔股骨頭內TUNEL陽性骨和成骨細胞死亡比例占到檢測區(qū)域的一半，而在對照組僅檢測到少量TUNEL 陽性細胞，這表明細胞凋亡是激素誘導股骨頭壞死的早期事件。Weinstein［11］發(fā)現(xiàn)GIONFH標本內有大量凋亡的骨細胞，而其他髖關節(jié)置換病人（如鐮狀細胞增多癥和股骨頸骨折）則沒有凋亡的骨細胞，他們認為GIONFH 的細胞學基礎實質是骨細胞的凋亡。由此可見骨細胞凋亡是GIONFH 病程演變中的重要事件。研究骨細胞凋亡發(fā)生機制及凋亡信號通路的調控，將為預防和治療GIONFH提供重要的理論依據(jù)。在此本文將對GIONFH發(fā)病機理中細胞凋亡相關研究進展進行綜述。

一、文獻檢索及篩選策略

本文以“股骨頭壞死”“糖皮質激素”“成骨細胞”“骨細胞”“細胞凋亡”為中文關鍵詞在中國知網、萬方數(shù)據(jù)庫中檢索；以“osteonecrosis of femoral head”“glucocorticoid”“osteocyte”“osteoblast”“cell apoptosis”為英文關鍵詞，在PubMed、Web of Science中進行檢索。

文獻納入標準：糖皮質激素引起的股骨頭壞死與細胞凋亡相關的文獻。文獻排除標準：①文獻質量偏低或重復性研究；②無法獲取全文或重復發(fā)表的文獻；③非中英文文獻；④Meta分析、學位論文、會議論文文獻。本文共檢索文獻778篇（PubMed檢索321篇，Web of Science 289篇；中國知網101篇，萬方數(shù)據(jù)67 篇），最終納入58 篇，其中中文文獻3 篇，英文文獻55篇（圖1）。

圖1 文獻篩選流程圖

二、GIONFH中細胞凋亡的相關基因

（一）糖皮質受體

糖皮質激素受體（Glucocorticoid receptor，GR）是一種配體激活的轉錄因子。在不存在配體的情況下，GR 作為包含Hsp90 分子伴侶復合物的一部分保留在細胞質中，激素結合后被激活易位至細胞核，調節(jié)攜帶特定GR 結合序列的基因轉錄。Gu 等［12］用地塞米松（Dex）處理骨細胞和成骨細胞后明顯檢測到GR 的激活和核轉位，GR 拮抗劑米非司酮（RU486）可明顯抑制Dex 誘導的骨細胞凋亡。Rauch 等［13］發(fā)現(xiàn)激素的使用對GR 基因功能喪失的轉基因小鼠的骨形成速率、骨量和小梁厚度沒有影響。GR 缺失會使成骨細胞對激素誘導的細胞凋亡、增殖和分化的抑制產生明顯的抗性。以上研究表明，GR 在激素誘導的骨細胞凋亡中有重要的作用。

（二）11β-羥基類固醇脫氫酶-2

11β-羥基類固醇脫氫酶（11β-HSD）主要包括11β-HSD-1 和11β-HSD-2。11β-HSD-1 將不活躍的11-脫氫皮質酮轉化為活性皮質酮，而11β-HSD-2則使皮質酮失活阻止糖皮質激素與GR 的結合。天然與人工合成的糖皮質激素對11β-HSD-2的反應性有所不同。Dex中的B環(huán)9α位被氟化，既增強了藥效又使11β位閉塞，從而使得11β-HSD-2 對Dex 滅活作用減弱［11］。Weinstein 等［14］發(fā)現(xiàn)轉基因小鼠成骨細胞中11β-HSD-2的特異性過表達可以抑制激素誘導的細胞凋亡，促進骨的形成、增加骨內脈管系統(tǒng)容量和改善骨強度。Wang 等［15］在兔GIONFH 模型檢測到11β-HSD-1蛋白的表達升高，而11β-HSD-2 明顯降低。Zhang 等［16］發(fā)現(xiàn)過表達11β-HSD-2可使Dex誘導的小鼠骨和成骨細胞凋亡率明顯減少，F(xiàn)as 和Caspase-8明顯降低，而用siRNA 敲低11β-HSD-2表達水平后，細胞凋亡率、Fas 和Caspase-8 表達水平明顯增高。以上研究表明11β-HSD-2 可能是預防類固醇治療病人發(fā)生股骨頭壞死的重要靶標。

（三）Bcl-2家族

Bcl-2 蛋白家族按功能主要分兩大類，一類包括Bax、Bad、Bim 等，主要通過Caspase-9 的激活誘導細胞凋亡；另一類包括Bcl-2、Bcl-W、Bcl-xL 等，通過抑制Bax 亞家族蛋白，阻止Caspase 激活劑從線粒體中釋放，而抑制細胞凋亡。Li等［17］發(fā)現(xiàn)Dex明顯抑制抗凋亡基因Bcl-2表達并促進促凋亡基因Bax 的表達水平來誘導成骨細胞凋亡。Moriishi 等［18］發(fā)現(xiàn)在Bcl-xL轉基因小鼠中，上調Bcl-xL后骨小梁的骨礦物質密度增加，股骨小梁骨體積和皮質厚度增加，TUNEL陽性成骨細胞數(shù)目明顯減少。Tian等［19］發(fā)現(xiàn)，兔GIONFH組TUNEL染色中骨小梁和骨髓中骨細胞凋亡比例明顯增高，免疫組化染色顯示Bcl-2表達量明顯降低，Caspase-3明顯增高。另外，Espina等［20］發(fā)現(xiàn)用1 μmol/L Dex處理成骨細胞48 h時Bim的表達水平最高，而GC 受體拮抗劑可阻止Dex 對Bim 蛋白誘導表達，特異性針對Bim 或下游效應器Bax 的短干擾RNA（siRNA）均可減少Dex 誘導的成骨細胞凋亡，表明Bim 是成骨細胞凋亡中受到GC受體的轉錄調控的重要調節(jié)劑。

（四）P53基因

正常的P53 基因是細胞周期G1 期DNA 損傷點，可通過上調C-myc、Fas抗原，下調Bcl-2基因，提高細胞內Ca2+濃度，誘發(fā)細胞凋亡。Zhen 等［21］發(fā)現(xiàn)Dex 誘導的成骨細胞凋亡與GR-P53調控的線粒體膜電位轉換孔（mPTP）開放有關。Dex誘導P53磷酸化易位至線粒體，在線粒體中P53與CyPD形成復合物，誘導mPTP開放，使線粒體膜電位降低，促進細胞色素C 釋放，誘導細胞凋亡。而siRNA 敲低GR 或P53 抑制劑則可抑制Dex誘導的CyPD-P53結合，逆轉Dex誘導的MC3T3-E1細胞凋亡。Li等［22］發(fā)現(xiàn)Dex可增強P53轉錄激活性，上調P21、促凋亡基因NOXA和PUMA，誘導鼠成骨細胞凋亡和G1期阻滯，而siRNA-P53 則可逆轉Dex 誘導的細胞周期阻滯和凋亡。另外，Zhou等［23］發(fā)現(xiàn)Dex通過促進USP14的表達去除P53 的泛素化而提高P53 的穩(wěn)定性，誘導MC3T3-E1 細胞凋亡，而P53抑制劑PTF-a則可部分阻斷細胞凋亡。

（五）Fas/FasL

Fas是一種位于各種細胞表面的死亡受體，F(xiàn)as及其配體FasL 的相互作用調節(jié)許多程序性細胞死亡介導的生理和病理過程。Kawakami 等［24］發(fā)現(xiàn)人成骨細胞上表達Fas，可溶性FasL 可以激活Fas 誘導成骨細胞凋亡。Kogianni 等［25］發(fā)現(xiàn)Dex 不僅能上調骨細胞質膜上Fas 蛋白，誘導Fas/FasL 死亡受體信號通路，還能激活ERK和Fas的傳遞，發(fā)揮協(xié)同作用，誘導骨細胞凋亡。

（六）GSK3β

GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調控細胞內眾多關鍵信號通路。GSK-3β在絲氨酸9（Ser-9）和酪氨酸216（Tyr-216）位點的磷酸化則分別代表GSK3β的失活和激活。Yun 等［26］發(fā)現(xiàn)Dex 可以降低Ser-9、升高Tyr-216 處GSK3β磷酸化水平來激活GSK3β 誘導成骨細胞的凋亡，而LiCl（GSK3β抑制劑）的處理則可增加GSK3β Ser-9逆轉Dex誘導的細胞凋亡。Deng 等［27］發(fā)現(xiàn)大鼠GIONFH 的組織中GSK3β增加，而GSK3β Ser-9 的磷酸化水平明顯降低。與大鼠SIONFH 模型GSK3βSer-9 變化趨勢一致的是，GSK3β Ser-9在Dex處理的成骨細胞中表達水平也明顯降低。而用siRNA敲低GSK3β后，Bax和Caspase-3降低，Bcl-2和β-catenin表達量增加。以上研究表明GSK3β的活性在激素處理的骨細胞的凋亡中發(fā)揮重要作用。

（七）Pyk2

Pyk2 是非受體酪氨酸激酶的粘附灶激酶家族的成員。Plotkin 等［28］發(fā)現(xiàn)Dex 在酪氨酸402 位點磷酸化Pyk2 而影響細胞存活，敲低Pyk2 則可減輕Dex 誘導的細胞凋亡作用，而過表達Pyk2后細胞凋亡又會重新出現(xiàn)。在表達Pyk2的激酶缺陷或磷酸化缺陷（Y402F）的骨細胞中，Dex 則不能夠誘導細胞凋亡。Iuchi 等［29］發(fā)現(xiàn)糖皮質激素還能誘導細胞內Ca2+迅速升高而激活Pyk2，Pyk2激活繼而導致JNK（Pyk2活化的下游靶點）激活，繼而引起細胞凋亡。Ding 等［30］發(fā)現(xiàn)在骨細胞MLO-Y4 和成骨細胞OB-6 細胞中，Dex 可以誘導激活TAK1 引起的Pyk2-JNK 磷酸化，誘導骨細胞MLO-Y4 和成骨細胞OB-6凋亡。

（八）STAT家族

STAT1 是STAT 蛋白家族的成員之一，激活后可誘導細胞凋亡。Feng 等［31］發(fā)現(xiàn)Dex 可促進成骨細胞P-STAT1 明顯的核轉位而增強其轉錄活性，用siRNA抑制STAT1可顯著降低Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3，降低Dex誘導的成骨細胞凋亡。Xu 等［32］發(fā)現(xiàn)GIONFH Ficat Ⅰ-Ⅴ型病理組織中STAT1、P-STAT1 和Caspase-3 表達量也明顯升高。Yan 等［33］發(fā)現(xiàn)Dex 處理的成骨細胞P-STAT3/STAT3 的比例，cleaved-Caspase-3 和cleaved-Caspase-9 表達量升高，而PSTAT3的抑制劑處理后，cleaved-Caspase-3，cleaved-Caspase-9的表達量則顯著降低，細胞凋亡率也明顯減少。Lin 等［34］發(fā)現(xiàn)氟達拉濱（STAT1 抑制劑）可以明顯降低激素誘導的股骨頭壞死模型中骨細胞空骨陷窩的比例，降低P-STAT1，cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白的表達水平。此外，Jin 等［35］發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制JAK1/2-STAT1途徑引起小鼠股骨頭M1型巨噬細胞的浸潤來防止炎癥介導的骨細胞凋亡。

（九）Caspase家族

胱天蛋白酶家族與細胞凋亡過程密切相關，在功能上可分為兩大類，包括啟動者（initiator）和效應者（effector）。一旦啟動者（胱天蛋白酶8、9 和10）被激活，執(zhí)行者（胱天蛋白酶3、6和7）獲得蛋白水解活性將作用于靶蛋白，不可逆轉地啟動細胞凋亡程序。Liu等［36］研究發(fā)現(xiàn)半胱天冬酶抑制劑（calbindin-D 28k）可以明顯抑制Caspase-3活性，從而抑制Dex誘導的骨和成骨細胞的凋亡。此外，Yun等［26］發(fā)現(xiàn)胱天冬酶抑制劑Z-VAD-fmk 可以防止Dex 誘導的成骨細胞線粒體膜電位的降低而減少細胞凋亡，這表明Dex 通過Caspase 的活化誘導成骨細胞凋亡。Zhan 等［37］研究發(fā)現(xiàn)Dex 可抑制大鼠成骨細胞中磷酸化AKT 表達水平，提高cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9表達水平，誘導細胞凋亡。Cui［38］等發(fā)現(xiàn)紅花多糖通過抑制Caspsae-3 介導的細胞凋亡來減輕Dex 相關的骨壞死。龔瑜林等［39］發(fā)現(xiàn)兔GIONFH組股骨頭內Caspase-9表達明顯增高，Caspase-9陽性率和骨細胞凋亡率呈正相關，以上表明Caspase在GIONFH骨細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

（十）低氧誘導因子-1α

激素誘導的低氧誘導因子-1α（HIF-1α）活性下降可能在骨壞死中發(fā)揮作用。Xu 等［40］發(fā)現(xiàn)Dex 能降低MC3T3-E1中HIF-1α和PDK1表達而抑制成骨功能，而過表達HIF-1α則增加PDK1的表達，二氯乙酸鹽（PDK1的拮抗劑）可明顯抑制MC3T3-E1 細胞的成骨能力，這表明Dex 通過HIF-1α調控PDK1來影響成骨功能。趙振群等［41］在兔GIONFH模型中發(fā)現(xiàn)，壞死區(qū)空缺骨陷窩率與骨細胞凋亡呈正相關，而HIF-1α的陽性表達率和骨細胞凋亡呈負相關。Li 等［42］也發(fā)現(xiàn)大鼠GIONFH模型中HIF-1α表達量明顯降低，而局部注射促紅細胞生成素可以升高HIF-1α控制的成骨和血管生成因子的表達，從而修復激素引起的股骨頭壞死。Jing 等［43］發(fā)現(xiàn)去鐵胺能激活HIF-1α/VEGF 通路并促進GIONFH 中的血管生成和骨修復。Xu 等［44］發(fā)現(xiàn)Dex 誘導鼠骨細胞MLO-Y4 中HIF-1α表達水平下調，從而減弱線粒體自噬的保護功能，而過表達HIF-1α則提高細胞對缺氧環(huán)境的抵抗力。Weinstein 等［45］發(fā)現(xiàn)接受潑尼松龍治療的小鼠股骨頭內HIF-1α和VEGF 表達水平明顯降低，成骨細胞數(shù)量和骨形成減少，而破骨細胞增加，并且HIF-1α和VEGF 表達水平、骨血管分布和強度的降低先于骨量丟失和骨微結構惡化，從而導致股骨頭容易塌陷。

（十一）血紅素加氧酶-1

血紅素是一種誘導血紅素加氧酶-1（HO-1）的物質，具有抗炎和抗氧化特性。Liang 等［46］發(fā)現(xiàn)服用Dex 病人股骨頭壞死組織中HO-1 mRNA表達水平明顯下調。Yamamoto等［47］研究發(fā)現(xiàn)血紅素可以誘導小鼠骨細胞MLO-Y4中的HO-1表達。血紅素可降低Capase-3活性，減少糖皮質激素和缺氧引起的細胞凋亡，而HO-1 抑制劑處理后HO-1 表達水平降低、Capase-3 活性明顯增加，即HO-1 抑制劑削弱了血紅素的細胞保護作用。這意味著血紅素細胞保護作用是由HO-1 和Caspase-3介導的。

三、其他

（一）內質網應激

內質網（ER）應激可通過PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路來介導細胞應對壓力反應，PERK 介導的eIF2α磷酸化可通過抑制生存蛋白和促進凋亡蛋白的合成而導致細胞死亡。Tao等［48］發(fā)現(xiàn)Dex可誘導PERK磷酸化而激活PERK、誘導促凋亡蛋白CHOP的表達上調和抑制Bcl-2的表達而促進成骨細胞的凋亡。另外，Liu等［49］發(fā)現(xiàn)隨著Dex的濃度增加，成骨細胞中CHOP 和ATF4 的表達逐漸增強，細胞凋亡比例增加。Yang 等［50］發(fā)現(xiàn)Dex 處理成骨細胞后，ER 應激的關鍵基因GRP78、CHOP 和eIF2α的磷酸化水平升高，表明ER 應激參與GC 誘導的成骨細胞的凋亡，而4-苯基丁酸（ER 應激的抑制劑）可抑制ER 應激，減少GC 誘導的MC3T3-E1 細胞凋亡。以上結果表明Dex可激活ER應激來促進成骨細胞凋亡。

（二）一氧化氮

一氧化氮（NO）在骨細胞功能中起著核心介質作用。eNOS 和iNOS 是體內NO 產生的重要標志。Inkielewicz-Stepniak等［51］發(fā)現(xiàn)Dex可以使細胞毒性介質NO的異常產生過度積累從而產生細胞毒性，誘導成骨細胞凋亡。Calder 等［52］發(fā)現(xiàn)GIONFH 組中骨細胞和成骨細胞中eNOS、iNOS、PARP 和Caspase-3 的表達量明顯高于骨關節(jié)炎組，可能原因是異常產生的NO 對骨骼修復和重塑過程產生有害影響，從而導致大量的骨細胞和成骨細胞凋亡。

（三）氧化應激

激素誘導的股骨頭壞死可能由氧化損傷引起。Nie等［53］研究發(fā)現(xiàn)Dex可引起成骨細胞的線粒體跨膜電位的降低，細胞內ROS和Ca2+水平的升高，ROS抑制劑和鈣螯合劑的使用明顯降低了Dex誘導的成骨細胞凋亡率。Bai等［54］發(fā)現(xiàn)高劑量的Dex可引起成骨細胞內ROS增加，而ROS激活了細胞內MAPK 信號途徑，誘導磷酸化的ASK1和P38表達增加，引起成骨細胞凋亡，而ROS抑制劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）則可以逆轉此效應。Peng 等［55］研究發(fā)現(xiàn)GIONFH 大鼠股骨頭內骨細胞凋亡和空骨陷窩比例明顯比對照組增多。Dex 處理后大鼠成骨細胞內ROS 水平升高，線粒體膜電位降低，細胞凋亡比例增高，而NAC處理則可恢復線粒體膜電位水平，逆轉Dex誘導的細胞凋亡。在激素誘導的兔骨壞死模型中，抗氧化劑維生素E的使用可降低活性氧的產生，明顯降低骨壞死的發(fā)生率［56］。Deng 等［57］發(fā)現(xiàn)Se@SiO2納米復合材料的使用可以誘導超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的生成而降低ROS損傷，從而預防甲潑尼龍引起的股骨頭壞死。

（四）表觀遺傳修飾

Zhao 等［58］認為表觀遺傳修飾可能是激素引起的骨壞死的主要原因。TET 蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶（5mC）向5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的轉化，然后改變DNA 的表觀遺傳狀態(tài)。Dex使用后股骨頭組織和MLO-Y4細胞中TET3-5hmC上調。他們還發(fā)現(xiàn)沉默MLO-Y4 細胞中TET3 的表達可降低5hmC富集水平，從而消除Dex對Akt信號通路抑制，逆轉Dex誘導的細胞凋亡。同時，在大鼠中局部進行siRNA-TET3 髓內注射可消除激素誘導的骨細胞凋亡，逆轉激素對大鼠股骨頭內骨微結構的不良影響，因而表觀遺傳修飾可能是GIONFH新的潛在治療靶標。

四、小結及展望

最近有不少學者從新的治療措施（臍帶血間充質干細胞誘導細胞分化、富血小板血漿和外泌體治療），非編碼RNA，細胞自噬以及基因多態(tài)性等多方面對GIONFH進行了報道，但是，非常明確的是，糖皮質激素對骨細胞和成骨細胞有直接的毒副作用，其誘導骨細胞或成骨細胞凋亡是GIONFH病變中的重要細胞學基礎（見圖2）。

圖2 GC誘導骨/成骨細胞凋亡的相關機制（繪圖作者 孫飛）

GIONFH 的多因素發(fā)病機制使得預測其發(fā)生非常困難，但其發(fā)生率隨著劑量和持續(xù)時間的增加而增加，并且藥效時間越長的藥物副作用越明顯。研究糖皮質激素激活和調控骨/成骨細胞凋亡信號通路的機制，不僅有助于揭示疾病的發(fā)生發(fā)展進程，有助于提前采取預防和干預措施以降低激素的毒副作用，還能為研發(fā)新的毒副作用更小的創(chuàng)新藥物提供重要理論依據(jù)。