高春生 王小偉 高俊 許海霞 晏慧超 鄭均華

骨肉瘤是一種臨床常見，多發(fā)于兒童和青少年的惡性骨腫瘤，具有惡性程度高和預(yù)后效果差等特點(diǎn)。盡管新輔助化療的應(yīng)用使病人的預(yù)后得到顯著改善，但其遠(yuǎn)期生存率仍不太理想［1-2］。研究表明［3-4］骨肉瘤細(xì)胞中存在包括微小RNAs（microRNAs，miRNAs）在內(nèi)的多種基因的異常改變，而這些miRNAs 可通過結(jié)合靶基因的3’非編碼區(qū)（UTR）調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。miR-27b 是一種與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的miRNA，被證實(shí)在結(jié)直腸癌、胃癌、宮頸癌和前列腺癌等腫瘤中異常表達(dá)，發(fā)揮著致癌或抑癌基因的作用［5-8］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)miR-27b 在骨肉瘤病人血清中異常高表達(dá)，且與腫瘤體積、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分級(jí)等有關(guān)，但其在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用如何尚不清楚［9］。因此，本研究旨在研究miR-27b 對(duì)骨肉瘤MG63 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人骨肉瘤細(xì)胞株MG63 購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM 培養(yǎng)液購于美國(guó)Hyclone，胰蛋白酶和細(xì)胞裂解液購于上海碧云天，Trizol試劑購于大連寶生物工程有限公司，青鏈霉雙抗、二甲基亞楓和MTT試劑購于美國(guó)Sigma。FOXO1多克隆抗體購于美國(guó)CST，GAPDH 多克隆抗體購于美國(guó)SantaCruz，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購于武漢博士德。LipofectaminTM2000 購于美國(guó)Invitrogen，miR-27b 模擬物、miR-27b抑制劑及其陰性對(duì)照購于上海吉瑪。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于北京索萊寶，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購于美國(guó)Promega，Matrigel 基質(zhì)膠和流式細(xì)胞儀購于美國(guó)BD，ECL發(fā)光試劑盒和Transwell小室購于美國(guó)Millipore，酶標(biāo)儀和凝膠成像系統(tǒng)購于美國(guó)Bio-Rad，倒置顯微鏡購于日本Olympus，細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國(guó)Thermo Fisher，熒光定量PCR 儀購于美國(guó)ABI。

二、細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染

MG63 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。將MG63細(xì)胞分為模擬物對(duì)照組（轉(zhuǎn)染miR-27b模擬物陰性對(duì)照）、miR-27b 模擬物組（轉(zhuǎn)染miR-27b 模擬物）、抑制劑對(duì)照組（轉(zhuǎn)染miR-27b抑制劑陰性對(duì)照）和miR-27b抑制劑組（轉(zhuǎn)染miR-27b抑制劑）。按1×106個(gè)/孔的濃度將細(xì)胞液種植到6孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，首先用無血清培養(yǎng)液分別稀釋待轉(zhuǎn)染物和LipofectaminTM2000，室溫孵育5 min 后，將兩者混合。室溫靜置20 min 后，將上述復(fù)合物加到MG63細(xì)胞中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)6 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集各組細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-27b的表達(dá)情況。

三、RT-PCR檢測(cè)miR-27b的表達(dá)

向待測(cè)的MG63 細(xì)胞中加入1 mL Trizol 試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后根據(jù)上海生工生物合成的PCR引物（miR-27b，F(xiàn)：5’-CCGGCCTTCACAGTGGCTA-3’，R：5’-CGGGTCGGTGGCAGAACTT-3’；U6，F(xiàn)：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R：5’-AACGC -TTCACGAATTTGCGT-3’），按照95℃3 min，95℃10 s、56℃30 s、72℃30 s（38 個(gè)循環(huán)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6為管家基因，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-27b的表達(dá)水平。重復(fù)3次。

四、MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的MG63 細(xì)胞接種于96 孔板，分別培養(yǎng)24、48 h 和72 h 后，加入20 μL MTT 溶液（濃度為5 g/L），孵育4 h 后加入100 μL 二甲基亞楓，震蕩反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的光密度（OD）值。

五、Transwell小室測(cè)定細(xì)胞侵襲和遷移

胰蛋白酶消化收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，以無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞制成濃度為3×104個(gè)/mL 的細(xì)胞液。將Transwell 小室放入24 孔板中，將稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠鋪滿聚碳酸酯膜，室溫下充分融合（注意：遷移實(shí)驗(yàn)中無此步驟）。在小室上室和下室中分別加入200 μL細(xì)胞液和600 μL含血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室后，以棉簽小心拭去上室中的液體，加入600 μL甲醇室溫條件下固定細(xì)胞30 min。拭去上室中的固定液后，加入800 μL 0.5%結(jié)晶紫室溫染色30 min。洗去染色液，晾干。于顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察統(tǒng)計(jì)侵襲或遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

六、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，磷酸緩沖液洗滌，結(jié)合緩沖液重懸，加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光、室溫反應(yīng)15 min，60 min 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

七、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-27b 與FOXO1的靶向關(guān)系

采用TargetScan 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到miR-27b 與FOXO1 的3’UTR 存在結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證miR-27b與FOXO1有無靶向關(guān)系，構(gòu)建含野生FOXO1 3’UTR（FOXO1-WT）和突變FOXO1 3’UTR（FOXO1-MUT）的熒光素酶報(bào)告載體。將其分別與模擬物對(duì)照、miR-27b 模擬物、抑制劑對(duì)照和miR-27b 抑制劑共轉(zhuǎn)染至MG63 細(xì)胞，其中每組設(shè)置3 個(gè)平行孔；培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

八、Western blot檢測(cè)FOXO1蛋白的表達(dá)

向收集到的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中加入200 μL 蛋白裂解液，冰上裂解30 min獲取總蛋白。煮沸5 min變性后取80 μg 上樣至12% SDS-PAGE 凝膠中，以90 V 電壓電泳30 min 后改換成120 V 電壓，電泳70 min 結(jié)束。再以210 mA 電流轉(zhuǎn)膜50 min。取出PVDF 膜后，以5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。經(jīng)1∶1 000倍稀釋的FOXO1 和GAPDH 抗體4 ℃下孵育過夜后，以1∶5 000倍稀釋的二抗室溫孵育1 h；加入ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件（IBM公司，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNKq檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染后各組MG63細(xì)胞中miR-27b的表達(dá)

與模擬物對(duì)照組相比，miR-27b模擬物組MG63細(xì)胞中miR-27b的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與抑制劑對(duì)照組相比，miR-27b抑制劑組中miR-27b的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞中miR-27b表達(dá)水平的比較（與模擬物對(duì)照組相比，*P＜0.05；與抑制劑對(duì)照組相比，#P＜0.05）

二、miR-27b對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖的影響

在24 h作用時(shí)間下，模擬物對(duì)照組、miR-27b模擬物組、抑制劑對(duì)照組和miR-27b 抑制劑組細(xì)胞增殖活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在48 h 和72 h作用時(shí)間下，miR-27b模擬物組細(xì)胞的增殖活力明顯高于模擬物對(duì)照組（P＜0.05），而miR-27b抑制劑組細(xì)胞的增殖活性低于抑制劑對(duì)照組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 miR-27b對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞活性的影響（與模擬物對(duì)照組相比，*P＜0.05；與抑制劑對(duì)照組相比，#P＜0.05）

三、miR-27b對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞侵襲和遷移的影響

與模擬物對(duì)照組相比，miR-27b模擬物組MG63細(xì)胞侵襲數(shù)和遷移MG63 細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05）；同時(shí)，miR-27b 抑制劑組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)較抑制劑對(duì)照組明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 miR-27b對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞侵襲（a）和遷移（b）的影響（與模擬物對(duì)照組相比，*P＜0.05；與抑制劑對(duì)照組相比，#P＜0.05）

四、miR-27b對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞凋亡的影響

與模擬物對(duì)照組相比，miR-27b 模擬物組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與抑制劑對(duì)照組相比，miR-27b 抑制劑組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果（與模擬物對(duì)照組相比，*P＜0.05；與抑制劑對(duì)照組相比，#P＜0.05）

五、miR-27b靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1 3’UTR與miR-27b有互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-27b 模擬物與野生型FOXO1 3’UTR 共轉(zhuǎn)染的MG63 細(xì)胞熒光素酶活性降低；miR-27b 抑制劑與野生型FOXO1 3’UTR 共轉(zhuǎn)染的MG63 細(xì)胞熒光素酶活性升高（P＜0.05）；但miR-27b 模擬物和miR-27b 抑制劑與突變型FOXO1 3’UTR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MG63 細(xì)胞熒光素酶活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。miR-27b模擬物明顯抑制MG63 細(xì)胞中FOXO1 蛋白的表達(dá)；而miR-27b 抑制劑則明顯促進(jìn)FOXO1 蛋白的表達(dá)（P＜0.05），見圖6。

圖5 FOXO1 3’-UTR 與miR-27b 互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)（a）及熒光素酶活性檢測(cè)（b）（與模擬物對(duì)照組相比，*P＜0.05；與抑制劑對(duì)照組相比，#P＜0.05）

圖6 Western blot 檢測(cè)FOXO1蛋白的表達(dá)（與模擬物對(duì)照組相比，*P＜0.05；與抑制劑對(duì)照組相比，#P＜0.05）

討 論

miRNA 通過與靶mRNA 的3’UTR 結(jié)合從而降解或誘導(dǎo)翻譯沉默，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和發(fā)育過程中發(fā)揮作用。多項(xiàng)研究表明，miRNAs 在骨肉瘤的診斷、治療和預(yù)后中發(fā)揮重要作用［10］。miR-27家族是一種有多功能的miRNA，參與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展［11］。miR-27b 是miR-27 家族成員，其在不同腫瘤中的作用不盡相同。在非小細(xì)胞肺癌和結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)miR-27b 表達(dá)降低，而上調(diào)其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［12-13］。但是，miR-27b 在乳腺癌中表達(dá)升高，可通過靶向抑制丙酮酸脫氫酶蛋白X（PDHX）表達(dá)，解除細(xì)胞代謝，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖［14］；miR-27b 上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲［15］。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-27b 模擬物或抑制劑成功改變骨肉瘤MG63 細(xì)胞中miR-27b 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-27b 過表達(dá)可顯著增強(qiáng)MG63細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡抵抗作用；而miR-27b低表達(dá)則呈現(xiàn)出相反的效果。該研究結(jié)果與前面miR-27b 在宮頸癌和乳腺癌中的促癌作用相似。提示，miR-27b可能在骨肉瘤中發(fā)揮致癌作用。

FOXO1 屬于FOXO 家族，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等，且影響腫瘤的進(jìn)展［16］。研究顯示，F(xiàn)OXO1 在非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著抑癌因子的作用［17-19］。為了探討miR-27b 調(diào)控骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-27b的潛在靶基因，結(jié)果將FOXO1作為研究對(duì)象。本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-27b 模擬物可與FOXO1 3’UTR靶向結(jié)合降低細(xì)胞熒光素酶活性，而miR-27b 抑制劑則可升高其熒光素酶活性。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示，miR-27b模擬物可降低FOXO1 蛋白的表達(dá)，而miR-27b 抑制劑則相反。結(jié)果表明，F(xiàn)OXO1 是miR-27b 的潛在靶基因，miR-27b可靶向調(diào)控其表達(dá)。已有研究證實(shí)FOXO1 在骨肉瘤中低表達(dá)，抑制其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖和集落形成［20］；而上調(diào)FOXO1的表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［21］。結(jié)果提示，在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，miR-27b 可能通過靶向調(diào)控FOXO1 表達(dá)促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。

綜上所述，miR-27b 可能通過靶向調(diào)控FOXO1在骨肉瘤MG63 細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移并抑制細(xì)胞凋亡。該結(jié)果有望為miR-27b成為骨肉瘤基因治療提供參考依據(jù)。