唐小云，周桂珍，周正娜，鄧雅迪，張 慧，張欣如，王旭光

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆馬繁育與運(yùn)動(dòng)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來(lái)源十分廣泛，最初在骨髓中分離得到，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)受供體年齡和健康狀況的影響，并且其收集過(guò)程會(huì)對(duì)供體造成創(chuàng)傷[1]。近年來(lái)，臍帶MSCs(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)成為BM-MSCs的理想替代物，能表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞特有的分子標(biāo)志，分化潛力大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無(wú)倫理道德問(wèn)題的限制[2-5]，是最具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞之一。然而，隨著對(duì)UC-MSCs的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)得到的UC-MSCs在MSCs特性上存在差異，這可能與物種、供體和細(xì)胞分離培養(yǎng)方法有關(guān)[6-7]。來(lái)自成年和胎兒組織的MSCs具有不同的特性，在胎兒MSCs中，特別是臍帶MSCs在臨床應(yīng)用方面更具優(yōu)勢(shì)[8]。Semenova等[9]對(duì)人臍帶華通氏膠、臍血管周圍間隙和臍帶羊膜3個(gè)區(qū)域的MSCs進(jìn)行比較，華通氏膠MSCs具有高且穩(wěn)定的增殖潛力和表型，并且可以作為醫(yī)學(xué)應(yīng)用的優(yōu)選細(xì)胞來(lái)源。周桂珍等[10]利用野生動(dòng)物盤羊的臍帶也成功分離培養(yǎng)得到MSCs，保存了珍稀動(dòng)物的遺傳資源。

馬作為大型家畜，適合作為不同自發(fā)性疾病的動(dòng)物模型，這些疾病在臨床上與類似的人類疾病相關(guān)，包括馬在內(nèi)的大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拈_發(fā)，可能會(huì)為研究MSCs的生理學(xué)及其在人類及獸醫(yī)再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用開辟替代策略。由于物種不同，所獲得的臍帶長(zhǎng)度不同，其分離培養(yǎng)方法也不相同。綿羊臍帶長(zhǎng)度僅為5 cm左右，而馬的臍帶長(zhǎng)15～20 cm，馬臍帶中MSCs的分布是否均一及哪個(gè)部位獲得的華通氏膠分離后可以得到純度較高的MSCs還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以剛分娩馬胎兒附著的臍帶為材料，采用組織塊分離法制備不同部位的馬臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(equine umbilical cord mesenchymal stem cells，eUC-MSCs)并進(jìn)行生物學(xué)特性以及成軟骨誘導(dǎo)分化潛能的檢測(cè)，通過(guò)比較來(lái)自同一臍帶不同部位MSCs的特性，檢測(cè)其在增殖能力、細(xì)胞表面標(biāo)記、多潛能性表達(dá)和成軟骨誘導(dǎo)分化上性能的異同，旨在明確更適合分離MSCs的馬臍帶部位。

1 材料與方法

1.1 材料

剛分娩的馬雌性胎兒臍帶，無(wú)菌處理，4 ℃保存。

1.2 主要試劑

胎牛血清(FBS)、DMEM/F12、0.25%胰蛋白酶(1×)均購(gòu)自Gibco公司；PBS(1×)購(gòu)自Solarbio公司；微量樣品總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green)均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑除特別說(shuō)明外均購(gòu)自Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 eUC-MSCs分離培養(yǎng) 無(wú)菌收集馬胎兒的整段臍帶，將其分為靠近胎兒部分(近端)、整段臍帶中間部分(中段)、靠近胎盤部分(遠(yuǎn)端)3個(gè)不同區(qū)域的臍帶(4～5 cm)。采用組織塊分離法分別分離3個(gè)部位的細(xì)胞，剔除臍帶外層羊膜、兩條臍動(dòng)脈和一條臍靜脈；將膠狀物質(zhì)(華通氏膠)剪碎為1 mm3的組織塊，移入T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning)中，加入3 mL含10% FBS的DMEM/F12，置于38.5 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 第7天進(jìn)行換液，之后每3 d換1次液。 在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，1 000 r/min離心5 min清洗、收集細(xì)胞，按1∶2的比例傳代培養(yǎng)，在熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX71)下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.3.2 eUC-MSCs增殖能力測(cè)定 將P3代生長(zhǎng)狀況較好的3組eUC-MSCs以1×104/mL的密度接種至六孔板(Corning)中，分別在第3、5、7、9、11、13天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制3組eUC-MSCs的生長(zhǎng)曲線，按照如下公式計(jì)算各組細(xì)胞倍增時(shí)間。

TD=t(log2/logNt-logN0)

TD為細(xì)胞倍增時(shí)間；t為培養(yǎng)時(shí)間；N0為接種細(xì)胞數(shù)；Nt為培養(yǎng)t時(shí)間后的細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 eUC-MSCs多潛能性和表面標(biāo)記分子檢測(cè) 通過(guò)NCBI查找基因序列，利用AlleleID 6.0軟件，分別設(shè)計(jì)多潛能基因NANOG(nanog homeobox)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(POU class 5 homeobox 1，POU5F1)和Y染色體性別決定區(qū)基因盒2(SRY-box transcription factor 2，SOX2)，表面標(biāo)記分子單核細(xì)胞分化抗原CD14(CD14 molecule，CD14)、B-淋巴細(xì)胞表面抗原B4(CD19 molecule，CD19)、造血祖細(xì)胞抗原CD34(CD34 molecule，CD34)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C型(protein tyrosine phosphatase receptor type C，CD45)、5′-核苷酸外切酶(5′-nucleotidase ecto，CD73)、B細(xì)胞抗原受體復(fù)合物相關(guān)蛋白α鏈(CD79a molecule，CD79a)、Thy-1細(xì)胞表面抗原(Thy-1 cell surface antigen，CD90)和內(nèi)皮糖蛋白(endoglin，CD105)，軟骨誘導(dǎo)分化特異性基因Y染色體性別決定區(qū)基因盒9(SRY-box transcription factor 9，SOX9)、蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)和Ⅱ型膠原蛋白1鏈(collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1)的PCR引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過(guò)微量樣品總RNA提取試劑盒提取P1代和P5代3組eUC-MSCs的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)多潛能性基因NANOG、POU5F1、SOX2和表面標(biāo)記分子CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD79a、CD90、CD105的表達(dá)。 PCR反應(yīng)體系20 μL：2×Pre Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 引物信息

1.3.4 eUC-MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化及鑒定 將P2代的3組eUC-MSCs以2×104/mL接種在6孔板中，使用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，將誘導(dǎo)分化組的培養(yǎng)液更換為成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(含1% FBS、0.1 μmol/L地塞米松、10 ng/mL TGF-β3、50 nmol/L抗壞血酸-2-磷酸、6.25 μg/mL胰島素、100 IU/mL青-鏈霉素的DMEM/F12)，每2 d換1次液。未誘導(dǎo)分化的對(duì)照組繼續(xù)使用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別在誘導(dǎo)分化第7、14、21天提取各組的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)成軟骨細(xì)胞特異性基因SOX9、ACAN和COL2A1的相對(duì)表達(dá)量；且在誘導(dǎo)分化第7、14、21天對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行阿利新藍(lán)染色，主要步驟如下：棄去原有培養(yǎng)液，用PBS清洗3～5次，4%多聚甲醛固定30 min，用ddH2O清洗3～5次，使用阿利新藍(lán)染色液染色30 min，再用ddH2O清洗3～5次，每孔加入適量ddH2O，防止干燥，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR獲得的各基因Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，采用2-△△Ct方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 eUC-MSCs形態(tài)學(xué)觀察

在原代細(xì)胞分離培養(yǎng)第1天3組eUC-MSCs均可見(jiàn)大量圓形細(xì)胞和一些紅細(xì)胞；在第2天有細(xì)胞開始貼壁，呈梭形，連片分布；第7天進(jìn)行換液以去除未貼壁細(xì)胞和組織塊，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%進(jìn)行傳代。傳代后的細(xì)胞繼續(xù)貼壁生長(zhǎng)，呈集落狀，隨后細(xì)胞向四周延伸呈典型的成纖維狀，當(dāng)細(xì)胞之間相互接觸后開始出現(xiàn)克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞呈克隆狀、簇狀，各組細(xì)胞培養(yǎng)至P5代時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)未發(fā)生變化，呈成纖維狀和簇狀(圖1)。

圖1 eUC-MSCs形態(tài)(100×)Fig.1 Cell morphology of eUC-MSCs (100×)

2.2 eUC-MSCs倍增時(shí)間測(cè)定

由圖2可知，3組eUC-MSCs的生長(zhǎng)曲線都呈S型。中段eUC-MSCs接種后1～5 d為潛伏適應(yīng)期，第6天細(xì)胞開始增殖，之后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第9天達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高峰，之后進(jìn)入平臺(tái)期。近端和遠(yuǎn)端eUC-MSCs培養(yǎng)的延滯期較中段eUC-MSCs稍長(zhǎng)，培養(yǎng)至第7天后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，與中段eUC-MSCs相比增長(zhǎng)速度較慢。經(jīng)計(jì)算得知3組eUC-MSCs細(xì)胞倍增時(shí)間分別為：35.4(近端)、25.5(中段)和34.9 h(遠(yuǎn)端)，3組細(xì)胞的平均倍增時(shí)間為31.9 h，中段細(xì)胞的倍增時(shí)間顯著低于近端和遠(yuǎn)端細(xì)胞(P<0.05)。

圖2 eUC-MSCs生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of eUC-MSCs

2.3 eUC-MSCs多潛能性基因和表面標(biāo)記分子的表達(dá)

2.3.1 多潛能性基因的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，多潛能性基因NANOG相對(duì)表達(dá)量在P1代中段細(xì)胞顯著高于近端細(xì)胞(P<0.05)，在P5代各組細(xì)胞無(wú)顯著差異(P>0.05)；POU5F1基因相對(duì)表達(dá)量在P1代各組細(xì)胞均無(wú)顯著差異(P>0.05)，在P5代近端細(xì)胞顯著高于中段細(xì)胞(P<0.05)，且極顯著高于遠(yuǎn)端細(xì)胞(P<0.01)，SOX2基因的相對(duì)表達(dá)量在各組細(xì)胞之間差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

①A～C，NANOG、POU5F1、SOX2基因的相對(duì)表達(dá)量。②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01);無(wú)*，差異不顯著(P>0.05)。下同①A-C,The relative expression of NANOG,POU5F1 and SOX2 genes,respectively.②*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No*,No significant difference.The same as below圖3 不同部位eUC-MSCs多潛能性基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of eUC-MSCs pluripotency genes at different parts

2.3.2 表面標(biāo)記分子的表達(dá) 3組eUC-MSCs均高表達(dá)CD34、CD73、CD90和CD105，低表達(dá)CD14、CD19、CD45和CD79a。CD14的相對(duì)表達(dá)量在P5代近端細(xì)胞顯著高于中段和遠(yuǎn)端細(xì)胞(P<0.05)；CD19、CD45和CD73的相對(duì)表達(dá)量均為近端細(xì)胞顯著高于中段和遠(yuǎn)端細(xì)胞(P<0.05)；CD34的相對(duì)表達(dá)量是遠(yuǎn)端細(xì)胞顯著高于近端和中段細(xì)胞(P<0.05)；CD79a的相對(duì)表達(dá)量在P5代遠(yuǎn)端細(xì)胞顯著高于近端和中段細(xì)胞(P<0.05)；CD90的相對(duì)表達(dá)量在P1代遠(yuǎn)端細(xì)胞極顯著高于近端和中段細(xì)胞(P<0.01)，在P5代遠(yuǎn)端細(xì)胞顯著低于近端和中段細(xì)胞(P<0.05)；CD105的相對(duì)表達(dá)量在各組細(xì)胞之間差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

A～H，CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD79a、CD90和CD105的相對(duì)表達(dá)量A-H,The relative expression of CD14,CD19,CD34,CD45,CD73,CD79a,CD90 and CD105,respectively圖4 不同部位eUC-MSCs表面標(biāo)記分子的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of eUC-MSCs surface marker molecules at different parts

2.4 eUC-MSCs成軟骨分化能力檢測(cè)

2.4.1 成軟骨特異性基因的表達(dá) 3組eUC-MSCs誘導(dǎo)分化為成軟骨細(xì)胞后，其特異性基因的相對(duì)表達(dá)量如圖5所示。由圖5可知，在誘導(dǎo)分化第7天，各組細(xì)胞SOX9基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，第14天時(shí)近端細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于遠(yuǎn)端細(xì)胞(P<0.01)，誘導(dǎo)21 d后遠(yuǎn)端細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于中段細(xì)胞(P<0.01)；在誘導(dǎo)第7和14天，中段細(xì)胞ACAN和COL2A1基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于近端和遠(yuǎn)端細(xì)胞(P<0.01)，第21天時(shí)均顯著高于近端和遠(yuǎn)端細(xì)胞(P<0.05)(圖5)。

2.4.2 阿利新藍(lán)染色結(jié)果 經(jīng)阿利新藍(lán)染色后，3組eUC-MSCs在誘導(dǎo)第7、14、21天均都可見(jiàn)特異性著色，3組細(xì)胞染色結(jié)果無(wú)明顯差異，而未誘導(dǎo)分化的對(duì)照組沒(méi)有特異性著色(圖6)。

圖6 eUC-MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化染色結(jié)果Fig.6 Staining results of eUC-MSCs for chondrogenic induction of differentiation

3 討 論

3.1 eUC-MSCs的分離培養(yǎng)及增殖能力

UC-MSCs因無(wú)倫理問(wèn)題，易于獲得，無(wú)創(chuàng)分離，產(chǎn)量高，具有更大的分化和免疫調(diào)節(jié)潛力，是最有前景的多潛能性細(xì)胞之一。目前關(guān)于eUC-MSCs的報(bào)道較少，且對(duì)于馬臍帶不同部位MSCs的研究鮮有報(bào)道。Merlo等[6]報(bào)道馬臍帶細(xì)胞基質(zhì)存在原始多能干細(xì)胞的替代來(lái)源，分離得到的MSCs貼壁生長(zhǎng)呈成纖維狀，具有分化為骨、脂肪、軟骨和神經(jīng)元細(xì)胞的能力，可以在出生時(shí)以非侵入性的方式收集并儲(chǔ)存，以備將來(lái)用作供體細(xì)胞治療馬病。有研究證明使用組織塊分離法比酶消化法更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)椴捎妹赶赡軙?huì)引起細(xì)胞損傷[11]。為了避免酶對(duì)原代細(xì)胞的影響，本研究采用組織塊分離法獲得eUC-MSCs，細(xì)胞呈成纖維狀和簇狀，3組細(xì)胞傳代至P5代，細(xì)胞仍保持較好的增殖能力，各組細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，表明整段臍帶都可分離得到eUC-MSCs。

使用MSCs用于臨床治療時(shí)，細(xì)胞的產(chǎn)量、存活性和倍增時(shí)間均要得到保證，因?yàn)榧?xì)胞存活性更高和細(xì)胞倍增時(shí)間更低具有更好的療效。在本研究中，3組eUC-MSCs的生長(zhǎng)曲線顯示，在第1～5天的培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，生長(zhǎng)速度迅速增加。近端和遠(yuǎn)端eUC-MSCs具有幾乎相同的細(xì)胞倍增時(shí)間，而中段eUC-MSCs更快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且細(xì)胞倍增時(shí)間顯著低于其他兩組細(xì)胞。Iacono等[12]分離的eUC-MSCs從原代到P8代的細(xì)胞平均倍增時(shí)間為48 h。Passeri等[13]分離的eUC-MSCs傳代至P12代后細(xì)胞的平均倍增時(shí)間為36.5 h，都高于本研究的平均倍增時(shí)間(31.9 h)，近端和遠(yuǎn)端eUC-MSCs倍增時(shí)間與Passeri等[13]研究相似，可能是本研究對(duì)不同部位eUC-MSCs進(jìn)行增殖能力測(cè)定，且不同部位的倍增時(shí)間不同。其次，本研究只針對(duì)P3代細(xì)胞進(jìn)行增殖能力測(cè)定，而Passeri等[13]研究中使用傳代至P12代的細(xì)胞進(jìn)行增殖能力測(cè)定，由此可以看出針對(duì)臍帶不同部位獲取的eUC-MSCs及不同代數(shù)在倍增時(shí)間上存在一定的差異。

3.2 eUC-MSCs多潛能性和表面標(biāo)記分子的表達(dá)

多能干細(xì)胞表達(dá)一組維持干細(xì)胞特性所必需的獨(dú)特因子，包括POU5F1、NANOG和SOX2[14-16]，這些轉(zhuǎn)錄因子參與多能性、自我更新和增殖的調(diào)節(jié)[17]。POU5F1是啟動(dòng)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育所必需的，對(duì)于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的形成和胚胎干細(xì)胞的維持至關(guān)重要[18]。SOX2調(diào)節(jié)POU5F1的表達(dá)，維持干細(xì)胞的多能狀態(tài)，而NANOG是維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)和自我更新所必需的[17]。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)多潛能性基因POU5F1、NANOG和SOX2 mRNA表達(dá)水平，隨著細(xì)胞從P1代傳至P5代，多潛能性基因的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，間接說(shuō)明了分離細(xì)胞的純度相對(duì)較高。P1代中段細(xì)胞NANOG基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于近端細(xì)胞；P1代3組細(xì)胞POU5F1基因相對(duì)表達(dá)量都較低，但在P5代中，近端細(xì)胞的基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于中段細(xì)胞、極顯著高于遠(yuǎn)端細(xì)胞；SOX2基因在3組細(xì)胞中差異均不顯著。前人研究表明，在馬臍帶、臍帶血、骨髓和脂肪MSCs的研究中，只有UC-MSCs表達(dá)了干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子POU5F1[19]，也印證了本研究結(jié)果。

國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)曾報(bào)道，MSCs對(duì)CD73、CD90、CD105呈陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)CD14、CD19、CD34、CD45、CD79a呈陰性表達(dá)[20]。本研究中分離得到的3組eUC-MSCs高表達(dá)典型間充質(zhì)表面分子CD73、CD90和CD105，低表達(dá)造血分子CD14、CD19、CD45和CD79a。CD34標(biāo)記的是原始造血祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[20]，但本研究中CD34呈陽(yáng)性表達(dá)，在P1代時(shí)相對(duì)表達(dá)量較低，傳代至P5代時(shí)出現(xiàn)高表達(dá)。 在Merlo等[8]和Iacono等[21]的研究中UC-MSCs陽(yáng)性表達(dá)CD34，CD34的表達(dá)取決于細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境、體外培養(yǎng)的細(xì)胞代次或細(xì)胞來(lái)源[22-23]。

3.3 eUC-MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化

在本研究中，3組細(xì)胞誘導(dǎo)為成軟骨細(xì)胞，經(jīng)阿利新藍(lán)染色后各誘導(dǎo)組的染色結(jié)果均可見(jiàn)特異性著色點(diǎn)，但各組間無(wú)明顯差異，說(shuō)明3組細(xì)胞分化程度相同。成軟骨誘導(dǎo)分化的特異性基因ACAN和COL2A1在中段細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量均高于近端和遠(yuǎn)端細(xì)胞。隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，COL2A1特異性基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，但ACAN基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，SOX9基因相對(duì)表達(dá)量只有在遠(yuǎn)端細(xì)胞中隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加。ACAN基因是軟骨的主要結(jié)構(gòu)成分之一，在維持軟骨結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著多種作用。SOX9基因主要負(fù)責(zé)正向調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中膠原和細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)，COL2A1基因形成軟骨基質(zhì)的基本網(wǎng)絡(luò)，馬臍帶血MSCs誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞時(shí)，在誘導(dǎo)7 d后可檢測(cè)到特異性基因SOX9基因mRNA表達(dá)，但在誘導(dǎo)分化21 d后檢測(cè)不到，在這兩個(gè)時(shí)間都可檢測(cè)到特異性基因COL2A1[24]。在不同部位人UC-MSCs體外誘導(dǎo)分化為成骨、成軟骨和成脂細(xì)胞的研究中，臍帶中段分離的MSCs在成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化中特異性基因COL-11和ACAN表達(dá)量均顯著高于靠近胎盤端和靠近胎兒端的細(xì)胞[25]。Merlo等[6]在研究人與馬的UC-MSCs體外誘導(dǎo)分化時(shí)，發(fā)現(xiàn)eUC-MSCs表現(xiàn)出較高的成軟骨和成骨分化能力。

綜上所述，馬同一臍帶不同部位分離得到的eUC-MSCs，雖在形態(tài)上無(wú)明顯差異，但中段eUC-MSCs細(xì)胞倍增時(shí)間顯著低于近端與遠(yuǎn)端細(xì)胞；通過(guò)對(duì)多潛能性和表面標(biāo)記分子的檢測(cè)可知，3組細(xì)胞均表達(dá)多潛能基因和間充質(zhì)表面標(biāo)記分子，不表達(dá)造血分子，且隨著傳代后細(xì)胞純度提高，大部分基因的相對(duì)表達(dá)量都有所增加；阿利新藍(lán)對(duì)3個(gè)部位eUC-MSCs軟骨誘導(dǎo)后染色結(jié)果相似，無(wú)法從染色結(jié)果上判斷差異性，但軟骨特異性基因的檢測(cè)表明只有遠(yuǎn)端eUC-MSCs各基因相對(duì)表達(dá)量是隨著誘導(dǎo)時(shí)間持續(xù)上升的，說(shuō)明本研究中設(shè)計(jì)的誘導(dǎo)時(shí)間節(jié)點(diǎn)更適合遠(yuǎn)端eUC-MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，而中段細(xì)胞對(duì)于軟骨特異性基因ACAN和COL2A1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于近端和遠(yuǎn)端eUC-MSCs。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)組織塊分離法得到3組eUC-MSCs，其形態(tài)呈成纖維狀和簇狀。3組eUC-MSCs細(xì)胞倍增時(shí)間分別為35.4(近端)、25.5(中段)和34.9 h(遠(yuǎn)端)，平均倍增時(shí)間為31.9 h。3組eUC-MSCs均表達(dá)MSCs多潛能性基因NANOG、POU5F1和SOX2，高表達(dá)CD34、CD73、CD90和CD105，低表達(dá)CD14、CD19、CD45和CD79a表面標(biāo)記分子，且具有分化為成軟骨細(xì)胞的潛能；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，成軟骨分化的特異性基因ACAN和COL2A1在中段細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量高于近端和遠(yuǎn)端細(xì)胞。總的來(lái)說(shuō)，在馬整段臍帶上都可以分離得到有價(jià)值的MSCs，但中段eUC-MSCs增殖能力和軟骨分化潛能優(yōu)于近端和遠(yuǎn)端分離得到的MSCs。