蒲小峰，張雨薇，李勝男，張雪靜，蘇 艷

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

近年來,隨著新疆地區(qū)驢養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，馬流產(chǎn)沙門菌(Salmonellaabortusequi)引起的驢副傷寒已成為影響和阻礙驢產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要傳染病之一[1-2]，已對驢產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。馬流產(chǎn)沙門菌僅侵害馬屬動物，引起懷孕母驢(馬等)流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜炎、公驢(馬)睪丸炎、關(guān)節(jié)突出、幼驢(駒)腹瀉、敗血癥、支氣管肺炎、心包炎等癥狀[3-4]。該病通常呈散發(fā)性，有時呈地方性流行，初產(chǎn)母畜和幼駒易感性最高[5]。國內(nèi)關(guān)于豬、禽類沙門菌的報道較多，關(guān)于驢源馬流產(chǎn)沙門菌的報道較少。目前該病在中國已隨馬驢產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展呈多地頻發(fā)的趨勢，馮培祥等[6]在2018年及孫陽陽等[7]在2019年分別從山東地區(qū)驢流產(chǎn)胎兒分離得到驢源沙門菌。該病引起馬屬動物的流產(chǎn)率可達到30%～100%，直接影響了馬及驢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

鞭毛蛋白FliC不僅是馬流產(chǎn)沙門菌的運動器官，還與該菌的黏附、侵襲力、毒性和生物被膜的形成相關(guān)[8-9]。生物被膜又是導致該菌的隱性感染與反復感染的重要原因之一[10-11]。此外,FliC保守性良好[12]，還有較強的抗原性[13]。目前關(guān)于驢源馬流產(chǎn)沙門菌鞭毛基因的研究較少。2020年新疆伊犁地區(qū)和和田地區(qū)出現(xiàn)了驢流產(chǎn)的病例，本試驗從新疆2個不同地區(qū)采集了驢流產(chǎn)胎兒肝臟和脾臟進行細菌分離培養(yǎng)，得到了2株驢源馬流產(chǎn)沙門菌，并進行了生化試驗、藥敏試驗和小鼠致病性分析，還對驢源馬流產(chǎn)沙門菌的鞭毛蛋白FliC的氨基酸進行了進化分析與比較，可為進一步研究鞭毛在該菌的致病機制和基因工程疫苗的研究提供基礎(chǔ)，并為臨床開展驢源馬流產(chǎn)沙門菌病的診斷與治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及試驗動物

新疆地區(qū)某2個集約化驢場的驢流產(chǎn)胎兒，通過剖解采集其肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織器官，共21份，進行細菌的分離鑒定。5周齡健康SPF昆明小鼠54只，雌雄不限，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均購自天根生化科技(北京)有限公司；營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、藥敏試紙、沙門菌生化發(fā)酵管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離純化及形態(tài)學觀察 將無菌采集的樣品研磨，涂布SS瓊脂鑒別培養(yǎng)基，37 ℃劃線培養(yǎng)16 h后，觀察固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，符合沙門菌菌落特征的可挑取單菌落，劃線挑取反復培養(yǎng)5次，觀察到培養(yǎng)基上均為同一種菌落時進行革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌形態(tài)。

1.3.2 生化鑒定 參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[14]將純化后的分離菌單菌落接種于微量生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.3.3 鞭毛FliC基因擴增及序列分析 用DNA提取試劑盒提取的分離株基因組DNA，并以此為模板進行PCR擴增。參考馬流產(chǎn)沙門菌鞭毛基因FliC(GenBank登錄號：HE801377.1)使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列：F：5′-CGCGGATCCTTGACCCAGAAT-3′；R：5′-GTG-CTCGAGTCGGAACCTGGTT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應總體系25 μL：TaqDNA聚合酶1.25 μL，10×TaqPCR緩沖液6.25 μL，dNTP(2.5 mmol/L)10 μL，DNA模板1.5 μL，上、下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，取結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。經(jīng)BLAST比對后，用DNAStar軟件將分離菌株的FliC氨基酸序列與GenBank中收錄的相關(guān)沙門菌參考株進行序列及相似性分析，并采用Mega 7.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 小鼠致病性試驗 將分離菌株分別接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，每株菌用分光光度計檢測細菌數(shù)量分別至1×108、5×108、1×109、5×109CFU/mL 4個梯度組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)。將54只健康昆明小鼠隨機分成9組,每組6只，每只小鼠腹腔注射1 mL，對照組小鼠注射1 mL PBS，連續(xù)觀察7 d，每12 h記錄一次死亡情況。

1.3.5 臟器荷菌量檢測及病理切片觀察 對死亡小鼠剖檢，每組取3只小鼠無菌采集脾臟和腎臟組織，一部分進行研磨，用滅菌生理鹽水梯度稀釋后涂固體培養(yǎng)平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，統(tǒng)計菌落數(shù)，計算荷菌量；另一部分制作病理切片，通過HE染色觀察小鼠臟器病理組織學變化。

1.3.6 藥敏試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法測試分離菌對21種抗菌藥的敏感性。分別取2株分離菌的培養(yǎng)液80 μL，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，將藥敏試紙片貼于平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測量其抑菌圈直徑，按照WS/T125-1999標準判定分離菌對抗生素的敏感性，結(jié)果表示為敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進行分析，通過單因素LSD法分析各組間差異，結(jié)果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 細菌分離純化及鑒定

對21份馬流產(chǎn)胎兒內(nèi)臟樣品進行培養(yǎng)鑒定，最終分離出2株疑似馬流產(chǎn)沙門菌，分別命名為XD1-2和G1-1，2株菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈圓形凸起，中央黑、邊緣透明的圓形菌落(圖1A)。鏡檢為革蘭陰性、散在排列的無莢膜芽胞的桿菌(圖1B)。

2.2 生化鑒定結(jié)果

生化試驗結(jié)果顯示，2株分離菌(G1-1、XD1-2)對H2S、葡磷胨水、半固體、氨基酸脫羧酸空白對照、賴氨酸、鳥氨酸、山梨醇的反應均為陽性；G1-1菌株的枸櫞酸鹽鑒定管為陽性，而XD1-2為陰性；2株分離菌的其他6種生化反應均為陰性(表1)，符合馬流產(chǎn)沙門菌的特征。

表1 分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.3 FliC基因擴增及遺傳進化分析

對2株分離菌株的FliC基因進行PCR擴增，均獲得了約1 000 bp的目的條帶(圖2)，與預期大小相符。相似性比對結(jié)果表明，2株分離菌FliC氨基酸序列之間的相似性為99.0%，2株分離菌與Ireland-HE801373、Ireland-HE801378株相似性均最高，且均為99.3%(圖3)，分離菌XD1-2與美國人源腸炎沙門菌分離株USA-EBQ1214032.1的相似性為98.1%。氨基酸進化關(guān)系結(jié)果顯示，分離株G1-1與愛爾蘭馬源馬流產(chǎn)沙門菌分離株Ireland-HE801373和Ireland-HE801378及國內(nèi)馬源馬流產(chǎn)沙門菌分離株China-KJ486797.1和China-KJ486769.1親緣關(guān)系較近，而分離株XD1-2則與美國人源腸炎沙門菌分離株USA-EBQ1214032.1親緣關(guān)系較近(圖4)，與相似性分析結(jié)果一致。

M，DL2000 DNA Marker；1,陰性對照；2、3，菌株XD1-2；4、5，菌株G1-1M，DL2000 DNA Marker；1,Negative control;2 and 3,Strain XD1-2;4 and 5，Strain G1-1圖2 分離株FliC基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of FliC genes of isolated strains

圖3 分離菌株與參考菌株FliC氨基酸相似性比對Fig.3 Similarity comparison of FliC amino acid between isolated strains and reference strains

2.4 分離菌株致病性試驗

試驗組小鼠分別注射2株分離菌后，不同劑量組小鼠均出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、被毛松亂、采食量下降、腹瀉等癥狀，以上癥狀與馬流產(chǎn)沙門菌感染的臨床癥狀一致，再次確認是該菌感染。除G1-1Ⅰ組死亡率為83%外，其余試驗組死亡率均為100%，其中G1-1 Ⅳ組小鼠全部死亡的時間為注射菌液后12 h，而XD1-2 Ⅳ組為9 h，對照組小鼠無發(fā)病死亡(表2)。無菌條件下采取G1-1 Ⅳ及XD1-2 Ⅳ組死亡小鼠腎臟及脾臟進行荷菌量檢測，結(jié)果表明XD1-2菌攻擊后脾臟荷菌量顯著高于G1-1菌(P<0.01)，但腎臟荷菌量在2株分離菌間無顯著差異(P>0.05)(圖5)。G1-1 Ⅳ組及XD1-2 Ⅳ組小鼠腎臟及脾臟經(jīng)HE染色觀察，可見XD1-2菌攻擊后小鼠腎臟和脾臟出血均較G1-1菌明顯(圖6)。

表2 小鼠致病性試驗結(jié)果

數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖5 小鼠內(nèi)臟荷菌量檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of visceral bacterial load in mice

圖6 死亡小鼠病理組織變化(HE,400×)Fig.6 Histopathological changes in dead mice (HE，400×)

2.5 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌XD1-2對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素敏感，對頭孢呋辛、利福平、頭孢噻呋、諾氟沙星、頭孢曲松鈉中介，對其余11種抗菌藥物耐藥。分離菌G1-1對阿莫西林、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、土霉素、氨芐西林、恩諾沙星、頭孢曲松鈉、鏈霉素敏感，對頭孢噻呋中介，對其余9種抗菌藥物耐藥(表3)。

表3 分離菌株藥物敏感性試驗結(jié)果

續(xù)表

3 討 論

近年來新疆驢養(yǎng)殖數(shù)量不斷上升，由馬流產(chǎn)沙門菌引起的流產(chǎn)在新疆持續(xù)散發(fā)，偶有地方暴發(fā)，且造成很多馬匹呈隱性感染，很難凈化，已給驢產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。楊康等[15]在2013-2014年對新疆地區(qū)的馬流產(chǎn)沙門菌病的流行情況進行調(diào)查，結(jié)果顯示馬血清中該菌抗體陽性率為28.28%。袁貝等[16]對新疆伊犁地區(qū)馬匹開展馬流產(chǎn)沙門菌血清學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該菌抗體陽性率為25.31%。劉英玉等[17]對新疆地區(qū)市售驢肉常見致病菌檢測與調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，沙門菌檢出率為20%。

馬流產(chǎn)沙門菌的致病性依賴于多種毒力因子，鞭毛蛋白FliC就是其中的一種重要毒力因子[18]，可在該菌黏附和侵襲腸上皮細胞的過程中發(fā)揮重要的作用[19-20]。孫慧瑩等[21]對9株驢源馬流產(chǎn)沙門菌的10種毒力因子檢測分析后得出，毒力基因表現(xiàn)為多樣性的組合現(xiàn)象且呈高攜帶率。李陽等[3]對新疆地區(qū)馬源馬流產(chǎn)沙門菌的FliC基因進行序列分析，結(jié)果表明，新疆地區(qū)2株馬源馬流產(chǎn)沙門菌和愛爾蘭馬流產(chǎn)沙門菌分離株Ireland-HE801373、Ireland-HE801374和Ireland-HE801378，還與腸炎沙門菌HE801385親緣關(guān)系較近。程相朝等[22]對腸炎沙門菌FliC基因進行同源性比較分析后得出該基因在同一物種屬內(nèi)同源性較高且保守性較好。本試驗中對驢源馬流產(chǎn)沙門菌的FliC基因進行了PCR擴增與遺傳進化分析，結(jié)果表明，這2株分離菌在進化上有一定的差異，分離株G1-1與愛爾蘭馬源馬流產(chǎn)沙門菌分離株Ireland-HE801373和Ireland-HE801378及國內(nèi)馬源馬流產(chǎn)沙門菌分離株China-KJ486797.1和China-KJ486769.1親緣關(guān)系較近，而分離株XD1-2則與美國人源腸炎沙門菌分離株USA-EBQ1214032.1親緣關(guān)系較近。表明該地區(qū)馬流產(chǎn)沙門菌來源不同，可能是跨區(qū)域引種或貿(mào)易造成。

目前已知的沙門氏菌血清型有2 500多種。本次試驗與孫陽陽等[7]鑒定的7株驢源沙門菌種類不同，其鑒定了山東地區(qū)的5株分離菌為鼠傷寒沙門氏菌，1株為愛丁堡或湯姆遜沙門菌，另1株則為阿邦尼或愛丁堡沙門菌，本試驗中驢源分離株XD1-2與G1-1均為馬流產(chǎn)沙門菌。其次，孫陽陽等[7]對山東驢源沙門菌的致病性分析結(jié)果表明，這7株驢源菌株致病性較低，攻擊小鼠后僅表現(xiàn)輕度腹瀉，2周后好轉(zhuǎn)。王芷晴等[23]研究結(jié)果表明，其分離鑒定的鵝源沙門菌對小鼠致死率為90%，同時發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟、肝臟、肺臟等器官均有出血。劉勃興等[24]從水貂分離的9株沙門菌中有6株對小鼠的致死率為100%。本試驗中的分離菌株接種小鼠后具有明顯的致病性，且分離株XD1-2的致病性強于G1-1，該結(jié)果與山東地區(qū)分離的驢源沙門菌對小鼠的致病性不同。馮蘭等[25]研究牦牛德爾卑沙門菌時發(fā)現(xiàn)該菌以1×109CFU的劑量接種小鼠后，其脾臟淋巴細胞數(shù)量明顯減少，紅髓面積比例相對增加。本試驗中2株分離菌攻擊小鼠后均出現(xiàn)了腎臟水腫、出血，脾臟出血等病變，推測本次分離的驢源馬流產(chǎn)沙門菌毒性更強。

孫陽陽等[7]對山東地區(qū)7株驢源沙門菌的耐藥表型檢測結(jié)果顯示，7株菌對所檢測24種抗菌藥物均比較敏感。孫瑩慧等[21]對9株驢源馬流產(chǎn)沙門菌進行了11種臨床常用抗菌藥物的敏感性測試，證明9株菌的耐藥譜較窄，對阿莫西林和鏈霉素耐藥。李帆等[26]分析發(fā)現(xiàn)豬源沙門菌對四環(huán)素具有普遍耐藥性。本試驗中分離菌XD1-2對11種抗菌藥物耐藥，對5種抗菌藥物敏感，對4種抗菌藥物已開始表現(xiàn)出中介的特性；分離菌G1-1對9種抗菌藥物耐藥，對11種抗菌藥物敏感。2株分離株(XD1-2與G1-1)對臨床上廣泛使用的青霉素、四環(huán)素、磺胺等抗菌藥物均產(chǎn)生了較高的耐藥性，此外還發(fā)現(xiàn)，2株分離菌分別對土霉素和氨芐西林表現(xiàn)出不同的敏感性，該結(jié)果與以上國內(nèi)報道的藥物敏感性結(jié)果差異較大，2株驢源馬流產(chǎn)沙門氏菌出現(xiàn)了多重耐藥的現(xiàn)象，提示在臨床治療中對耐藥性的監(jiān)測和用藥需要引起重視。Chung等[27]報道鏈霉素為馬屬動物革蘭氏陰性菌治療首選抗菌藥，本試驗藥敏結(jié)果與其一致，2株分離菌均對鏈霉素敏感。因此，養(yǎng)殖場內(nèi)應嚴格遵循藥物使用原則，規(guī)范藥物治療和利用高品質(zhì)的疫苗防控沙門菌病，將對控制該菌耐藥性的進一步發(fā)展具有重要的價值。

4 結(jié) 論

本試驗從驢流產(chǎn)胎兒肝臟及脾臟中分離得到2株菌，分別命名為XD1-2與G1-1，經(jīng)氨基酸序列比對、相似性分析、構(gòu)建進化樹以及致病性分析確定此2株菌均為馬流產(chǎn)沙門氏菌。這2株菌對小鼠的致病性較強且致病性存在差異，XD1-2對小鼠的致病性強于G1-1。2株分離菌具有多重耐藥特點，且對21種抗菌藥物的耐藥性存在差異。