楊宇欣，趙富華，劉 羽，邱基程，曹玉穎，張 璐，白如念，王建中，曹興元

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193；2.國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；4.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100013；5.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

頭孢氨芐(cephalexin，CFX)是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，屬于第一代頭孢菌素，用于治療多種感染[1]，具有成本低、抗菌譜廣和不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[2],其抗菌作用強(qiáng)于第二、三代頭孢菌素[3]。頭孢菌素的抗菌作用機(jī)理主要是其能抑制肽聚糖合成進(jìn)而干擾細(xì)菌細(xì)胞膜合成[4]。從細(xì)菌生長期方面進(jìn)行研究，頭孢菌素屬于繁殖期殺菌劑，能特異性地殺滅有細(xì)胞壁的細(xì)菌，且對(duì)人體和畜禽的影響較小[5]。頭孢氨芐對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌和厭氧菌具有較高抗菌活性，如對(duì)溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌等都有抗菌作用[6]。人用頭孢氨芐主要用于呼吸道、尿路及皮膚軟組織感染的治療[7-8]，獸用制劑有相似的藥效。研究表明，頭孢氨芐可有效治療犬的細(xì)菌性感染，如皮膚感染(膿皮癥)[9]，此外，對(duì)由細(xì)菌引起的尿路、呼吸道、軟組織感染具有同樣的抗菌效果[10-11]。Bataineh等[12]研究2批頭孢氨芐膠囊在健康志愿者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性發(fā)現(xiàn),2批膠囊在藥代動(dòng)力學(xué)上有顯著差異，不可相互替代；Yin等[13]對(duì)頭孢氨芐胃漂浮片進(jìn)行體內(nèi)外評(píng)價(jià)，結(jié)果表明胃漂浮片可延長藥物在主要吸收部位的停留時(shí)間，從而提高生物利用度；Prados等[14]研究頭孢氨芐懸浮液在犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，該懸浮液在早上和晚上10：00飼喂所得的藥代動(dòng)力學(xué)差異較小，并建議給藥間隔為12 h。目前，對(duì)頭孢氨芐膠囊、懸浮液等劑型的報(bào)道相對(duì)較多，而對(duì)頭孢氨芐片的藥代動(dòng)力學(xué)報(bào)道較少，但頭孢氨芐片具有易飼喂、吸收迅速且生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)[15]，關(guān)于頭孢氨芐的藥代動(dòng)力學(xué)研究主要采用高效液相色譜(HPLC)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法[16-20]，HPLC流動(dòng)相一般較復(fù)雜，其色譜柱長度比超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的長，導(dǎo)致同一樣品消耗時(shí)間更長，UPLC-MS/MS具有檢測(cè)時(shí)間短、精度高、分離度好等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)旨在建立頭孢氨芐的UPLC-MS/MS方法，獲得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以研究中國生產(chǎn)的受試制劑頭孢氨芐片(Trolevis?300)和法國生產(chǎn)的參比制劑(Rilexine?300)對(duì)比格犬口服給藥后的生物等效性，探討2種制劑是否具有相似的作用，在臨床上是否可相互替代。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 受試制劑：Trolevis?300頭孢氨芐片購自上海漢維生物醫(yī)藥科技有限公司，300 mg/片；參比制劑：Rilexine?300頭孢氨芐片購自維克公司，300 mg/片；標(biāo)準(zhǔn)品：頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度≥94.4%；乙腈、甲醇、甲酸均為質(zhì)譜純，均購自賽默飛世爾科技有限公司；超純水由Milli-Q超純水儀制備，符合GB/T6682一級(jí)用水規(guī)定。

1.1.2 主要儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)、色譜柱(BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm))均購自Waters公司；分析天平(ES225SM-DR，感量0.00001 g)購自Precisa公司；天平(BS2202S,感量0.01 g)購自Sartorius公司；高速冷凍離心機(jī)(Hettich，MIKRO22R)；渦旋混合器(HQ-60-Ⅱ)購自北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 22只健康成年比格犬(1～2歲)，雌雄各半，體重為9.0～11.0 kg，購自北京遠(yuǎn)大星火醫(yī)藥科技有限公司。研究開始前，所有程序都經(jīng)過中國農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)(63303-19-E-001)。

1.2 給藥方案及血樣采集

試驗(yàn)開始前，將犬在試驗(yàn)犬籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d。給藥前對(duì)每只犬稱重，且在給藥前16 h和給藥后8 h禁食。 22只犬隨機(jī)分為2組，A組和B組，每組各11只，該試驗(yàn)采用單劑量、雙周期、雙序列交叉設(shè)計(jì)給藥，第1周期A組犬以30 mg/kg BW口服Rilexine?300(參比制劑)，B組犬以30 mg/kg BW口服Trolevis?300(受試制劑)；第2周期A組犬以30 mg/kg BW口服Trolevis?300(受試制劑)，B組犬以30 mg/kg BW口服Rilexine?300(參比制劑)。兩階段給藥間隔期為7 d。

于給藥前(0 h)及給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、17和24 h采血。每次從臂頭靜脈采集2 mL血樣至含有肝素鋰的采血管中，6 000 r/min離心5 min，取血漿層，平均分為2份，置于標(biāo)記好的試管中，-20 ℃保存待用，在21 d內(nèi)進(jìn)行分析。

1.3 色譜條件

流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液；0.1%甲酸-乙腈溶液。

超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC；色譜柱：BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流速：0.225 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL(表1)。

1.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀：Waters Quattro Premier；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源溫度：130 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣流速：850 L/h；Q1、Q3均為單位分辨率(表2)。

1.5 樣品處理

取200 μL血漿，加20 μL甲醇，渦動(dòng)10 s。加入300 μL乙腈-甲醇(1∶1)，渦動(dòng)2 min。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清200 μL，加入200 μL含有0.1%甲酸的乙腈-水溶液(1∶9)，渦動(dòng)10 s，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

1.6.1 特異性 分析空白犬血漿(n=20)，觀察在藥峰出現(xiàn)的區(qū)域是否有干擾信號(hào)。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別設(shè)置6個(gè)不同濃度的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次為100、200、500、1 000、2 000和5 000 ng/mL，依據(jù)設(shè)定濃度加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，以所得峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 檢測(cè)限與定量限 本試驗(yàn)中采用信噪比法分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢測(cè)限和定量限。

1.6.4 準(zhǔn)確度與精密度 通過添加回收試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度與精密度，分別用回收率和變異系數(shù)表示準(zhǔn)確度和精密度。選擇以最低定量限及低、中、高(200、1 000和4 000 ng/mL) 4個(gè)濃度進(jìn)行添加回收。每個(gè)濃度6個(gè)平行，持續(xù)3 d，分別計(jì)算回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。

1.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別添加200、1 000和4 000 ng/mL頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品于血漿中混勻，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，分別按照下面的操作進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1.6.5.1 凍融穩(wěn)定性 將混勻的樣品置于-20 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，與新鮮添加的血漿樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)待測(cè)物在凍融過程中的穩(wěn)定性。

1.6.5.2 室溫穩(wěn)定性 將混勻的樣品置于室溫12 h后與新鮮添加的血漿樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，分析樣品在室溫的穩(wěn)定性。

1.6.5.3 前處理后穩(wěn)定性 將混勻的樣品進(jìn)行前處理，方法同1.5,分別在前處理結(jié)束后0和8 h檢測(cè)樣品，分析前處理后待測(cè)藥物的穩(wěn)定性。

1.6.5.4 在血漿中的穩(wěn)定性 將混勻的樣品分別在第0和40天進(jìn)行前處理檢測(cè)，方法同1.5,分析待測(cè)藥物在血漿中的穩(wěn)定性。

1.6.6 基質(zhì)效應(yīng)考察 取適量空白血漿樣品，以1∶6體積比加入乙腈-甲醇(1∶1)沉淀蛋白，渦旋1 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液200 μL，加入待測(cè)化合物系列質(zhì)控樣品工作液20 μL，制備低、中、高3個(gè)濃度(200、1 000和4 000 ng/mL)的上清液樣品，待前處理后，取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。每一濃度進(jìn)行6個(gè)重復(fù)樣本分析。

取200 μL純凈水代替空白血漿樣品，加入待測(cè)化合物系列質(zhì)控樣品工作液20 μL，制備低、中、高 3個(gè)濃度(200、1 000和4 000 ng/mL)的參照溶液樣品，待前處理后，取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。每一濃度進(jìn)行6個(gè)重復(fù)樣本分析。以上清液樣品的峰面積與參照溶液的峰面積均值的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析和方法驗(yàn)證均符合《生物分析方法驗(yàn)證指南》[21]。使用WinNonlinTM8.1 軟件中的非房室模型進(jìn)行分析，計(jì)算血漿藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)消除半衰期(T1/2)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、達(dá)峰濃度(Cmax)、血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-t)等，并計(jì)算受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均數(shù)的比值以判斷受試制劑與參比制劑是否等效。根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果計(jì)算相對(duì)生物利用度(F)。

F=(AUCT·DR)/(AUCR·DT)×100%

式中，AUCT，受試制劑的曲線下面積；DR，參比制劑的給藥劑量；AUCR，參比制劑的曲線下面積；DT，受試制劑的給藥劑量。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 特異性 由圖1可知，在分析物的保留時(shí)間3.07 min附近未檢出影響頭孢氨芐的干擾峰，不存在明顯的內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，說明該方法的特異性良好。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖2可知，頭孢氨芐的血漿藥物濃度在100～5 000 ng/mL濃度范圍內(nèi)方法的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.99。以峰面積為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=10.6828x-176.481。

2.1.3 檢測(cè)限和定量限 本試驗(yàn)分別以3倍信噪比和10倍信噪比作為檢測(cè)限和定量限。 6個(gè)平行樣品測(cè)出檢測(cè)限為50 ng/mL，定量限為100 ng/mL。

2.1.4 準(zhǔn)確度和精密度 血漿中頭孢氨芐UPLC-MS/MS測(cè)定結(jié)果顯示，空白血漿中頭孢氨芐添加濃度為100、200、1 000和4 000 ng/mL時(shí)平均回收率為92.44%～111.29%，回收率穩(wěn)定；空白血漿添加樣品在100～5 000 ng/mL范圍內(nèi)，日內(nèi)變異系數(shù)均≤10.35%，日間變異系數(shù)均≤10.05%，精密度良好(表3)。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 分別添加200、1 000和4 000 ng/mL 3個(gè)不同濃度頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品的血漿樣品在前處理后、室溫12 h后、血漿中40 d后及-20 ℃反復(fù)凍融3次的過程中待測(cè)藥物的響應(yīng)值的變異系數(shù)均<20%。

2.1.6 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果顯示，頭孢氨芐在200、1 000和4 000 ng/mL 3個(gè)血漿濃度樣品中檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)變異系數(shù)均≤3.63%，滿足≤15%的要求，故此分析方法的基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)。

2.2 血藥濃度及藥代動(dòng)力學(xué)特征

犬以30 mg/kg BW單次口服頭孢氨芐片參比制劑和受試制劑后，不同時(shí)間測(cè)得的受試制劑與參比制劑對(duì)應(yīng)的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。由圖3可知，受試制劑與參比制劑的峰濃度分別為26.82和28.09 μg/mL,而兩者達(dá)峰時(shí)間分別為2.70和1.77 h，均較接近，且兩條曲線也較吻合。采用WinNonlinTM8.1軟件對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，受試制劑與參比制劑的AUC0-t分別為(116.34±36.30) μg·h/mL和(121.81±25.80) μg·h/mL，其他藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)同AUC0-t，受試制劑與參比制劑的差異較小(表4)。根據(jù)公式計(jì)算可得頭孢氨芐片受試制劑的相對(duì)生物利用度為99.78%。

表4 頭孢氨芐2種制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(以實(shí)際給藥劑量計(jì)算)

2.3 生物等效性評(píng)價(jià)

WinNonlinTM8.1軟件分析顯示，受試犬單次口服30 mg/kg BW頭孢氨芐片，受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞幾何均數(shù)的比值分別為99.51%、99.27%和99.30%，其90% CI均在80.00%～125.00%之間(表5)，表明頭孢氨芐片受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

表5 頭孢氨芐2種制劑生物等效性分析參數(shù)(以實(shí)際給藥劑量計(jì)算)

3 討 論

頭孢氨芐的藥代動(dòng)力學(xué)研究主要采用HPLC和LC-MS/MS方法，Papich等[16]采用HPLC方法研究犬口服頭孢泊肟酯和頭孢氨芐的藥代動(dòng)力學(xué)、蛋白質(zhì)結(jié)合和組織分布，其色譜柱規(guī)格為4.6 mm×150 mm，保留時(shí)間為7.2～7.4 min；do Nascimento等[19]采用LC-UV-MS/MS方法研究氨芐青霉素和頭孢氨芐在水溶液和人血漿中的短期穩(wěn)定性，色譜柱規(guī)格為4.6 mm×250 mm，運(yùn)行時(shí)間為18 min，保留時(shí)間為15.4 min；Qi等[22]采用HPLC方法研究犬血漿中頭孢氨芐和甲氧芐啶的藥代動(dòng)力學(xué)，色譜柱規(guī)格為4.6 mm×250 mm，運(yùn)行時(shí)間為16 min，保留時(shí)間為5.3 min。 本試驗(yàn)建立了犬血漿中頭孢氨芐的UPLC-MS/MS方法，該方法靈敏度和準(zhǔn)確度較高，色譜柱規(guī)格為2.1 mm×100 mm，運(yùn)行時(shí)間為5 min，保留時(shí)間為3.07 min。上述文獻(xiàn)中使用的色譜柱均比本試驗(yàn)所使用的色譜柱更長，較長的色譜柱導(dǎo)致流動(dòng)相消耗增加，單個(gè)樣品儀器運(yùn)行時(shí)間及頭孢氨芐保留時(shí)間延長，儀器被污染的幾率增加。此外，HPLC的流動(dòng)相一般較復(fù)雜，加入的試劑雜多，Hussein等[20]用HPLC快速方法分析測(cè)定人血漿中頭孢氨芐水平和穩(wěn)定性，其流動(dòng)相由等體積的0.01 mol/L十六烷基三甲基溴化銨和0.01 mol/L磷酸氫二鉀-乙腈-三乙胺(60∶40∶0.001)組成；Qi等[22]相關(guān)研究中流動(dòng)相由2 mol/L的甲酸鈉緩沖液(pH 3.5)-甲醇-乙腈(22∶7∶7)組成。在本試驗(yàn)中，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液，流動(dòng)相所含溶液較常見且配制簡(jiǎn)單，上述文獻(xiàn)中的流動(dòng)相配制更復(fù)雜，且加入的試劑較多，對(duì)環(huán)境的不利影響更大。 除此之外，在Hussein等[20]相關(guān)研究中頭孢氨芐定量限為500 ng/mL，Qi等[22]相關(guān)研究中頭孢氨芐定量限為1 000 ng/mL，在Albarellos等[17]研究中頭孢氨芐定量限為390 ng/mL,而本試驗(yàn)建立的犬血漿中頭孢氨芐檢測(cè)方法定量限為100 ng/mL，比上述文獻(xiàn)定量限更低，能更全面滿足頭孢氨芐在犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

Prados等[14]對(duì)犬口服5%頭孢氨芐懸浮液(25 mg/kg)的時(shí)間藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示，早上10：00和晚上10：00喂藥Cmax分別為(18.77±2.80)和(14.52±2.70) μg/mL，Prados等[23]關(guān)于甲氧氯普胺改善犬口服頭孢氨芐的藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示，犬單次口服5%的頭孢氨芐懸浮液(25 mg/kg)和靜脈注射鹽酸甲氧氯普胺(0.5 mg/kg)20 min后再口服5%的頭孢氨芐懸浮液(25 mg/kg)，早上10：00和晚上10：00喂藥其Cmax分別為(18.77±2.83)和(21.88±0.85) μg/mL，可知與甲氧氯普胺聯(lián)合使用改變了頭孢氨芐在體內(nèi)的藥代動(dòng)力過程，增加了頭孢氨芐的 Cmax。Yin等[13]對(duì)頭孢氨芐胃浮片的研究中，犬單次口服500 mg頭孢氨芐胃漂浮片，Cmax為(22.87±4.11) μg/mL。不同頭孢氨芐制劑在體內(nèi)的吸收速度和程度都會(huì)有一定的差異。在本試驗(yàn)中，受試制劑在(2.70±4.68) h達(dá)到Cmax(26.82±7.94) μg/mL，此制劑吸收較迅速。與胃漂浮片相比，雖然給藥劑量更小，但本試驗(yàn)中頭孢氨芐片受試制劑(Trolevis?300)的Cmax較高，說明其吸收程度較高，在血液中的濃度較高，藥效相對(duì)較強(qiáng)。Prados等[14]研究結(jié)果顯示，頭孢氨芐懸浮液的T1/2分別為(1.79±0.20)和(2.69±0.90) h。在本試驗(yàn)中，受試制劑的T1/2為(3.12±1.05) h，比上述研究中的T1/2更長，表明本試驗(yàn)中頭孢氨芐片受試制劑(Trolevis?300)在體內(nèi)的消除率更低，治療效果持續(xù)時(shí)間更長，這意味著可延長連續(xù)給藥的間隔。與上述文獻(xiàn)中的頭孢氨芐制劑相比，頭孢氨芐片(Trolevis?300)具有吸收更快、消除率更低等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)于上述文獻(xiàn)中的頭孢氨芐制劑。在本試驗(yàn)中，參比制劑在(1.77±0.55) h達(dá)到Cmax(28.09±5.09) μg/mL，T1/2為(3.39±1.43) h。犬口服頭孢氨芐受試制劑和參比制劑后，Ln(Cmax)、Ln(AUC0-t)和Ln(AUC0-∞)比率分別為99.51%、99.27%和99.30%，根據(jù)生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[24]，此受試制劑與參比制劑具有生物等效性，且具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功建立了頭孢氨芐在犬血漿中的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，該方法線性、準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均符合相關(guān)要求，且特異性高、穩(wěn)定性良好。藥代動(dòng)力學(xué)過程分析結(jié)果顯示，頭孢氨芐片受試制劑在犬體內(nèi)具有吸收快、消除緩慢等特點(diǎn)，且頭孢氨芐片受試制劑和參比制劑具有生物等效性，據(jù)此，可認(rèn)為2種制劑具有相似的臨床療效和臨床安全性，均可用于臨床上犬相關(guān)疾病的治療。