謝虹亭 謝飛宇 龍思丹 陳美池 薛 鵬 朱世杰

(1 北京中醫(yī)藥大學研究生院，北京市 100029；2 中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院腫瘤科，北京市 100102)

癌性發(fā)熱是中晚期癌癥患者常見的并發(fā)癥之一，以持續(xù)低熱、反復難愈為主要臨床特點。發(fā)熱會引起患者身心不適，嚴重影響患者的生活質量、營養(yǎng)狀況及治療效果。癌性發(fā)熱是除感染外導致癌癥患者體溫升高的主要原因，在癌癥相關性發(fā)熱中占比高達41%[1]。癌性發(fā)熱是由癌癥本身引起的副腫瘤綜合征，特指非感染性發(fā)熱，其發(fā)病機制尚未完全明確。有學者認為癌性發(fā)熱是由壞死的癌細胞和骨髓細胞釋放的白細胞介素(interleukin,IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、干擾素等細胞因子造成下丘腦體溫調節(jié)中樞功能紊亂所致[2]。西醫(yī)常用糖皮質激素或非甾體抗炎藥對癥治療，這些藥物雖然起效快，但藥效持續(xù)時間短、發(fā)熱易復發(fā)，還會引起胃腸道功能紊亂、肝腎功能損害等不良反應，不利于癌癥患者的長期預后[3]。

中醫(yī)的“整體觀”“辨證論治”和中藥的“多成分””多靶點”在癌性發(fā)熱治療中具有獨特優(yōu)勢，能提高患者的生活質量[4]。癌性發(fā)熱屬于中醫(yī)內傷發(fā)熱病范疇，其基本病機是臟腑功能失調、氣血陰陽失和。對于癌癥患者，體內癥積影響氣血運行，瘀血、痰濕、癌毒蘊郁而生，此類癥積產物導致氣機升降失調、陰陽開合失司，因而發(fā)熱。少陽膽為臟腑之樞，與肝共調全身氣機升降；少陽三焦為氣血津液之樞，乃營衛(wèi)氣血運行之通道也。因此，癥積引起的少陽樞機不利可用和解之法，解郁積、和陰陽，使陰平陽秘，癌熱自消。小柴胡湯是和解少陽法的代表方劑，柴胡與黃芩是其核心藥對。有文獻報告以柴胡類方為代表的和解少陽法是治療癌性發(fā)熱的基本方法[5]。一項基于數(shù)據(jù)挖掘的癌性發(fā)熱中醫(yī)用藥規(guī)律研究表明，柴胡-黃芩藥對使用的支持度高達到32.52%[6]?？梢姴窈忘S芩被廣泛用于治療癌性發(fā)熱。但目前系統(tǒng)地闡釋柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的活性成分和作用機制的研究仍較少。網(wǎng)絡藥理學是以系統(tǒng)生物學和網(wǎng)絡生物學為基礎[7]，從整體水平研究“藥物-靶點-疾病”的復雜網(wǎng)絡關系，進而指導新藥研發(fā)及藥理作用研究，其整體性和系統(tǒng)性與中醫(yī)整體觀和辨證論治不謀而合[8]。因此，本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，探討柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的活性成分和作用機制，為進一步藥理實驗研究和臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 柴胡-黃芩藥對的活性化學成分及其相關靶點的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；https://old.tcmsp-e.com/molecule.php)檢索“柴胡”和“黃芩”兩味中藥的化學成分，并設置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18初步篩選活性化學成分，然后在該平臺上檢索活性化學成分對應的靶點，剔除無靶點的化學成分，獲得柴胡、黃芩的活性化學成分及其對應靶點[9]。最后，在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)中，將限定物種設置為人類，再對靶點進行標準基因名轉換[10]。

1.2 癌性發(fā)熱相關靶點的篩選 以“cancerous fever”和“neoplastic fever”為關鍵詞，在GeneCards?數(shù)據(jù)庫[11](https://www.genecards.org)、OMIM?數(shù)據(jù)庫[12](http://www.omim.org)和TTD數(shù)據(jù)庫[13](http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)中進行癌性發(fā)熱相關靶點的搜索，搜索時間為2000年1月1日至2022年1月1日。若GeneCards?數(shù)據(jù)庫中靶點過多，則設定其“Score值”的中位數(shù)為閾值，篩選出大于閾值的疾病相關靶點作為目標靶點。綜合3個數(shù)據(jù)庫的靶點結果并刪除重復項以獲得最終的疾病相關靶點。

1.3 柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱相關靶點的獲取及其蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡的構建 將柴胡、黃芩活性化學成分的相關靶點與癌性發(fā)熱相關靶點上傳Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖，從而獲得交集靶點，即柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的相關靶點。將交集靶點上傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)，構建其蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)數(shù)據(jù)[14]，然后使用CytoScape 3.7.2軟件制作PPI網(wǎng)絡圖[15]。利用CytoScape 3.7.2軟件中的MCODE插件，根據(jù)默認的緊密聯(lián)系參數(shù)推測潛在蛋白質功能模塊，并通過Metascape數(shù)據(jù)庫分析模塊中靶點參與的生物學進程，將其結果根據(jù)LgP進行由小到大排序，且以P≤0.01為篩選條件，選取符合條件的前3位生物學進程對其功能進行描述[16]。

1.4 交集靶點的功能富集和通路富集分析 基于Metascape平臺(http://metascape.org/gp/index.html)對交集靶點進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析包括生物過程、分子功能和細胞成分。將各分析結果根據(jù)P值進行由大到小排序，且以P≤0.01為篩選條件，選取符合條件的前20位GO功能、KEGG通路。運用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com)實現(xiàn)篩選結果的可視化。

1.5 藥物成分-交集靶點-通路網(wǎng)絡圖的構建 將柴胡和黃芩的活性化學成分、交集靶點及篩選的前20條KEGG通路上傳到CytoScape 3.7.2軟件中，構建藥物成分-交集靶點-通路網(wǎng)絡圖。利用CytoScape 3.7.2軟件內置的Network Analyzer計算度值、介度值及緊密度值等拓撲參數(shù)，并根據(jù)度值進行由大到小排序，推斷排名前5的藥物活性化學成分、交集靶點和KEGG通路為柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的核心活性化學成分、核心靶點和核心通路。

1.6 分子對接 將1.5得出的網(wǎng)絡中排名前5的交集靶點作為受體蛋白，排名前5的藥物活性化學成分作為配體蛋白。首先在RCSB-PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中獲取上述蛋白的“PDB”格式，并在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載5種藥物成分的“MOL2”格式。利用AutoDock 1.5.6軟件對受體蛋白及配體蛋白進行去水、加氫、計算電荷及尋找可旋轉化學鍵等處理，再根據(jù)受體蛋白及配體蛋白大小設置合適的對接盒子，并使用“Genetic Algorithm”算法進行分子對接，最后在Pymol中進行可視化分析。

2 結 果

2.1 柴胡-黃芩藥對的活性化學成分及相關靶點 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，初步得到17種柴胡活性化學成分和36種黃芩活性化學成分，剔除無靶點的化學成分后，最終篩選出42種活性化學成分，其中豆甾醇為柴胡與黃芩的共同成分，故最終獲得12種柴胡活性化學成分和31種黃芩活性化學成分，見表1。柴胡活性化學成分的相關靶點157個，黃芩活性化學成分的相關靶點80個，合并后刪除重復值共得到相關靶點178個。

表1 柴胡-黃芩藥對的主要活性化學成分

2.2 柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱相關靶點 從GeneCards?數(shù)據(jù)庫獲得癌性發(fā)熱相關靶點7 142個，選擇Score值≥10.37的靶點，最終獲得1 145個癌性發(fā)熱相關靶點。結合在OMIM?數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫中獲取的相關靶點，去重后合并，最終得到1 562個癌性發(fā)熱相關靶點。通過繪制韋恩圖，將178個主要活性化學成分相關靶點與1 562個癌性發(fā)熱相關靶點取交集，共獲得98個交集靶點，即柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的相關靶點，見圖1。

圖1 柴胡-黃芩藥對活性化學成分相關靶點與癌性發(fā)熱相關靶點的韋恩圖

2.3 柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱相關靶點的PPI網(wǎng)絡 利于STRING 11.0及CytoScape 3.7.2構建柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱相關靶點的PPI 網(wǎng)絡，見圖2。運用CytoScape 3.7.2中的 MCODE 插件推測出PPI網(wǎng)絡中的2個潛在蛋白質功能模塊，見圖3。使用Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在蛋白質功能模塊中的靶點進行生物學進程分析，根據(jù)P值的對數(shù)值，保留模塊中前3位的生物學進程并描述其功能。見表2。

圖2 柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱相關靶點的PPI網(wǎng)絡

圖3 PPI網(wǎng)絡中的潛在蛋白質功能模塊

表2 PPI網(wǎng)絡中潛在蛋白質功能模塊的功能

2.4 柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱相關靶點的功能富集和通路富集結果 基于Metascape數(shù)據(jù)平臺，對交集靶點進行GO功能富集分析(P≤0.01)，得到1 730個生物過程條目、111個分子功能條目、72個細胞成分條目；進行KEGG通路富集分析(P≤0.01)，得到291個KEGG通路。根據(jù)P值從大到小排序，分別取4種富集分析結果的前20個條目，利用作圖平臺進行可視化，見圖4。其中，生物過程條目以對脂多糖、細菌、細菌源和脂質等的應答，以及對凋亡信號通路、血管形態(tài)形成等的調控為主；分子功能條目則以蛋白激酶結合、激酶結合和轉錄因子結合等為主；細胞成分條目主要涉及膜微區(qū)、膜筏、囊泡腔和細胞外基質等；KEGG通路涉及癌癥相關通路、肝炎通路、TNF信號通路、細胞凋亡通路和IL-17信號通路等，其中癌癥通路中包含膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌等。

圖4 柴胡-黃芩治療癌性發(fā)熱相關靶點靶點的功能和通路富集分析氣泡圖

2.5 藥物成分-交集靶點-通路網(wǎng)絡圖 運用CytoScape 3.7.1構建藥物成分-交集靶點-通路網(wǎng)絡圖(圖5)后，通過CytoScape 3.7.1內置的Network Analyzer分析柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，推測柴胡的檞皮素(度值為0.63，介度值為83，緊密度值為0.40)、山奈酚(度值為0.43，介度值為28，緊密度值為0.40)、異鼠李素(度值為0.39，介度值為13，緊密度值為0.01)，以及黃芩的漢黃芩素(度值為0.40，介度值為15，緊密度值為0.01)和黃芩素(度值為0.40，介度值為15，緊密度值為0.01)為柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的核心活性化學成分。

前列腺素內過氧化物合成酶(prostaglandin endoperoxide synthase,PTGS)2(度值為0.50，介度值為34，緊密度值為0.11)為柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的核心靶點，同時PTGS1(度值為0.48，介度值為24，緊密度值為0.05)、絲氨酸蛋白酶1(serine protease 1,PRSS1；度值為0.48，介度值為23，緊密度值為0.05)、Caspase-3(度值為0.47，介度值為21，緊密度值為0.02)、蛋白激酶Bα(protein kinase Bα,AKT1；度值為0.46，介度值為21，緊密度值為0.01)亦為柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱重要靶點。

柴胡-黃芩藥對主要通過癌癥相關通路(度值為0.48，介度值為52，緊密度值為0.09)治療癌性發(fā)熱，同時也涉及肝炎通路(度值為0.39，介度值為30，緊密度值為0.02)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路(度值為0.38，介度值為26，緊密度值為0.01)、TNF通路(度值為0.41，介度值為23，緊密度值為0.01)和IL-17通路(度值為0.41，介度值為21，緊密度值為0.01)等。見圖5。

圖5 藥物成分-交集靶點-通路網(wǎng)絡圖

2.6 分子對接技術結果 度值排名前5的交集靶點分別為PTGS2、PTGS1、PRSS1、Caspase-3、AKT1，度值排名前5的活性化學成分分別為槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、黃芩素、異鼠李素。5種受體蛋白與5種配體蛋白的結合能見表4，結合能排名前6的分子對接技術可視化示意圖見圖6。

表4 5種受體蛋白與5種配體蛋白對接的平均結合能(kcal/mol)

PRSS1-槲皮素 AKT1-槲皮素

3 討 論

癌性發(fā)熱的病理機制仍未完全明確。有學者認為癌性發(fā)熱是由于腫瘤細胞或腫瘤相關巨噬細胞釋放的IL-1、IL-6、TNF-α和干擾素觸發(fā)下丘腦體溫調節(jié)中樞的血管內皮細胞和神經(jīng)元生成前列腺素E2，從而重置視前區(qū)的熱調節(jié)設定點，進而引起發(fā)熱反應[2,17]。這些細胞因子在中醫(yī)中被認為是癌癥患者臟腑功能失調后產生的痰濕、瘀血和癌毒等病理產物，可阻滯人體內陰陽開闔，從而郁積生熱。人體陰陽開闔以少陽為樞機，因而癌性發(fā)熱可歸結為機體少陽樞機不利而致“郁熱”[18]，多用和解少陽法調達樞機。柴胡與黃芩是和解少陽的經(jīng)典配伍，《醫(yī)方考》曰“柴胡、黃芩能和解少陽經(jīng)之邪”，可見柴芩藥對在方中起著和解少陽、運轉樞機的主導作用?！端幤坊x》曰“所謂內熱用黃芩，外熱用柴胡，為和解要劑”，可見柴胡與黃芩合用可外散半表之熱、內清半里之熱。張潔等[19]、尚學彬等[20]和張輝等[21]使用柴胡類方治療癌性發(fā)熱，其有效率分別達82.7%、93.75%和80.0%。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法篩選出柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的核心活性化學成分，主要有檞皮素、山奈酚、異鼠李素、漢黃芩素和黃芩素等。其中，檞皮素不僅能阻斷TNF-α對細胞內核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的激活，減少IL-1、IL-6和TNF-α等細胞因子的產生[22]，還能阻斷磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)通路，從而抑制環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)的生成，而COX是催化花生四烯酸轉化為前列腺素的關鍵酶[22]。山奈酚則可通過抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的活性從而抑制NF-κB的表達[23]，同時對COX-1、COX-2均有明顯的抑制作用[24]。異鼠李素能下調NF-κB的表達從而減少IL-6的釋放，并能抑制MAPK通路以減少COX-2、IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子釋放[25]。漢黃芩素能抑制COX-1的合成，從而抑制前列腺素的產生[26-27]。黃芩素能明顯下調COX-2蛋白的表達，抑制IL-6、IL-1β和TNF-α等細胞因子的釋放，并能抑制p38的磷酸化從而抑制NF-κB信號通路的激活,進而發(fā)揮解熱的作用[28-30]。此外，上述成分除了發(fā)揮解熱作用，還具有直接抗腫瘤功效，通過抑制腫瘤細胞的增殖達到治療“癌因性”致熱。檞皮素能抑制MAPK/細胞外調節(jié)蛋白激酶途徑(extracellular regulated protein kinase,ERK)[31]、激活Caspase-3/7并抑制B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達從而誘導腫瘤細胞凋亡[32]。山奈酚還能抑制PI3K/AKT通路從而抑制腫瘤細胞增殖[33]。異鼠李素則通過升高活性氧簇水平及降低細胞周期蛋白B1(cyclin B1)的表達從而誘導細胞周期阻滯[34]。黃芩素可選擇性調控MAPK/ERK1、MAPK/ERK2 信號通路，從而可控制腫瘤細胞周期阻滯、凋亡和衰老的分子過程[35]。漢黃芩素則通過抑制NF-κB/Bcl-2通路的激活，促進Caspase-3和Caspase-9的裂解從而誘導細胞凋亡[36]。由此可見，檞皮素、山奈酚、異鼠李素、漢黃芩素和黃芩素不僅能通過減少IL-1、IL-6、TNF-α和COX的生成，從而抑制前列腺素的產生，發(fā)揮解熱作用以治標，還能通過抑制MAPK/ERK通路、激活Caspase蛋白、降低細胞周期蛋白表達等途徑抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。

本研究結果表明，柴胡-黃芩治療癌性發(fā)熱的核心靶點包括PTGS2、PTGS1、PRSS1、Caspase-3、AKT1。PTGS2和PTGS1分別是COX-2和COX-1的編碼基因。COX是體內催化花生四烯酸合成前列腺素家族的關鍵酶，而前列腺素家族中的前列腺素2是內源性致熱源引起發(fā)熱的主要介質，其通過增加冷敏神經(jīng)元放電并減少熱敏神經(jīng)元放電來升高體溫調定點，從而引起發(fā)熱，阻斷前列腺素2合成的藥物具有明顯的解熱作用[37-38]。PRSS1、Caspase-3和AKT1基因參與了腫瘤細胞增殖和凋亡的過程。PRSS1主要經(jīng)非受體酪氨酸激酶/信號傳導子和轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路調控細胞增殖[39]；Caspase-3則參與死亡受體/死亡配體途徑從而誘導細胞凋亡[40]；AKT1是PI3K/AKT信號通路中核心因子，參與著腫瘤細胞增殖和血管生成[41]。目前尚缺乏研究證實檞皮素、山奈酚、異鼠李素、漢黃芩素和黃芩素對PTGS2和PTGS1具有直接的抑制作用，但這5種活性化學成分均能抑制COX的合成，故筆者推測這5種活性化學成分可能對PTGS2和PTGS1基因的表達有抑制作用，減少前列腺素釋放，從而發(fā)揮解熱作用。雖然上述5種成分直接作用于PRSS1、Caspase-3和AKT1的研究較少，但檞皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芩素和漢黃芩素可參與調控上述靶點的信號通路，故筆者推測這5種成分能抑制它們的表達，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。同時，本研究分子對接技術結果表明，PRSS1、AKT1與檞皮素，AKT1與山奈酚，PTGS1與黃芩素，Caspase-3、PTGS1與異鼠李素的對接結合能均<-5，提示篩選出的核心活性化學成分與核心靶點具有較好的結合活性。

本研究GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的結果顯示，柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的作用機制主要涉及癌癥相關通路、MAPK通路、干擾素通路、IL-17通路和肝炎通路，上述通路均參與腫瘤細胞的增殖和凋亡過程。腫瘤細胞的增殖過程呈異常代謝狀態(tài)，凋亡基因表達被抑制，同時釋放IL-1、IL-6、TNF-α和干擾素等細胞因子，其可誘發(fā)炎癥并級聯(lián)活化TNF通路[42]。TNF通路的下游信號傳導途徑主要有NF-κB激活的信號傳導、c-Jun氨基末端激酶信號傳導及細胞凋亡信號傳導。NF-κB被激活后釋放的IL-1、IL-6和TNF-α等細胞因子在癌性發(fā)熱中起主要作用，這些細胞因子可直接刺激體溫調節(jié)中樞引起發(fā)熱[2,17]。此外，這些細胞因子還可促進腫瘤相關血管生成，保障腫瘤相關巨噬細胞的生長，并促進腫瘤的侵襲[43]，這也為TNF通路提供了啟動因子，形成惡性正反饋機制。IL-17信號通路主要包括IL-17A信號通路和IL-17F信號通路，IL-17A可直接激活NF-κB，并且下調miR-23b的表達水平，進一步放大IL-17A激活NF-κB信號的作用；IL-17A與TNF-α具有協(xié)同作用，能共同增強TNF-α所誘導基因的mRNA穩(wěn)定性，增加TNF-α的釋放，從而誘導發(fā)熱[44]。檞皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芩素及漢黃芩素一方面可以抑制癌癥相關通路，抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡，從根源減少炎癥因子釋放；另一方面又能抑制TNF和IL-17兩條信號通路，防止炎癥因子介導的級聯(lián)放大效應，進一步減少致熱細胞因子的釋放。因此，筆者推測柴胡-黃芩藥對通過抗腫瘤和抗炎解熱兩方面來治療癌性發(fā)熱。

綜上所述，柴胡和黃芩是柴胡類方的關鍵組成，是“和解少陽法”的基礎配伍，藥對中的檞皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芩素和漢黃芩素能夠抑制PTGS2、PTGS1基因表達從而減少前列腺素合成，并抑制PRSS1、Caspase-3和AKT1表達從而抑制腫瘤增殖；其通過抑制癌癥相關通路、TNF通路和 IL-17通路的激活，從而減少IL-1、IL-6、TNF-α等致熱細胞因子的釋放。柴胡、黃芩能同時發(fā)揮抗腫瘤和抗炎解熱兩方面的作用以達到治療癌性發(fā)熱的目的。這為臨床運用柴胡類方治療癌性發(fā)熱及腫瘤相關性發(fā)熱提供了科學依據(jù)。然而本研究主要是以生物信息學與海量數(shù)據(jù)計算的結果為基礎，后續(xù)將在此基礎上進行動物或細胞實驗加以驗證，進而明確柴胡-黃芩藥對治療癌性發(fā)熱的主要調控靶點。