唐流洋 劉 霞 胡 銳

(重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶市 401420)

自發(fā)性腦出血是中老年患者常見的致殘、致死原因，盡管當(dāng)前醫(yī)療技術(shù)明顯提高，但腦出血的病死率仍居高不下，在53%～59%之間[1]。腦出血主要是由于薄弱的腦動脈血管破裂，導(dǎo)致血液外滲，腦實質(zhì)局部壓力增加，進(jìn)而發(fā)生腦水腫、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，對患者造成繼發(fā)性傷害。腦出血最常見于基底節(jié)部，其次是大腦皮層和腦干。研究表明，腦出血與肥胖、高血壓、糖尿病、飲酒等因素密切相關(guān)[2]，上述因素可長期刺激血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞變性、凋亡，最終引起血管破裂，發(fā)生腦出血。一些學(xué)者提出腦血管內(nèi)皮功能紊亂是腦出血的病理基礎(chǔ)[3]。有研究結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1(endothelial cell specific molecule-1，ESM-1)屬于可溶性硫酸皮膚素蛋白聚糖，是一種與內(nèi)皮功能紊亂有關(guān)的標(biāo)志物，其參與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、黏附和遷移，與血管生長因子相互作用，共同維持血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定[4-5]。Zhu等[6]發(fā)現(xiàn)，ESM-1參與調(diào)控人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的血管生成。內(nèi)臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑(visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor,Vaspin)是一種胰島素增敏劑和抗炎因子，Vaspin可以調(diào)控血管內(nèi)皮炎癥因子表達(dá)，能夠?qū)辜?xì)胞凋亡，保護(hù)血管內(nèi)皮[7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Vaspin通過抑制腎臟核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路，從而減輕腎臟組織的炎癥反應(yīng)和缺血再灌注損傷，保護(hù)血管內(nèi)皮。本文旨在探討ESM-1、Vaspin在腦出血患者腦出血點附近腦組織中的表達(dá)水平及其與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年6月至2021年7月在我院神經(jīng)外科確診為腦出血的84例患者作為研究對象，其中男性46例、女性38例，年齡42～76(59.78±11.60)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)腦出血的診斷符合《中國腦出血診治指南(2014)》[9]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，患者均經(jīng)頭顱CT檢查確診為腦出血且行血腫清除術(shù)；(2)均為首次發(fā)病，并且在腦出血后24 h內(nèi)入院；(3)近期未使用抗生素、免疫抑制劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有腦創(chuàng)傷、腦卒中、腦腫瘤等病史的患者；(2)合并精神或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者；(3)腦血管瘤、腦血管畸形等繼發(fā)性腦出血患者；(4)合并急慢性感染的患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集臨床資料：收集患者的性別、年齡、合并基礎(chǔ)疾病(高血壓、糖尿病、高脂血癥)情況；入院時采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)對患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評估[10]；通過頭顱影像學(xué)評估腦出血情況，并采用多田公式計算腦出血量[11]；出院后隨訪3個月，采用格拉斯哥預(yù)后量表(Glasgow Outcome Scale，GOS)評分[12]評估患者預(yù)后情況。

1.2.2 組織標(biāo)本收集：所有患者均接受血腫清除手術(shù)治療。術(shù)中選取手術(shù)通路中鄰近血腫0.5 cm以內(nèi)的腦組織碎塊0.3 g作為腦出血組，取同一腦出血患者距出血邊緣>2 cm的腦組織碎塊0.3 g作為對照組，將收集到的樣本先速凍于液氮中，隨后貯存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2.3 免疫組化法檢測ESM-1和Vaspin的蛋白表達(dá)情況：將術(shù)中獲取的部分腦組織制作成5 μm厚度的切片，58 ℃恒溫烘烤2 h，依次使用二甲苯、酒精、3%過氧化氫溶液處理標(biāo)本，然后檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)；分別滴加抗ESM-1抗體或Vaspin抗體(稀釋比例為1∶100；北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-3615R、bs-7536P)100 μL，4 ℃下孵育過夜，PBS洗片，然后滴加生物素化山羊抗兔IgG(無須稀釋；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：PV-6000)100 μL，37 ℃孵育30 min，隨后使用PBS溶液清洗干凈后，DAB染色2 min，蘇木精復(fù)染1 min，乙醇脫水，玻璃片固定。

在電子顯微鏡下隨機選擇5個視野檢查ESM-1及Vaspin的蛋白表達(dá)情況。如細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核呈棕黃色顆粒，則判定為陽性細(xì)胞。由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法對切片染色結(jié)果進(jìn)行觀察和評估，如有差異，則重新評估建立最終評分。具體評估標(biāo)準(zhǔn)見下表1，以著色程度計分與陽性細(xì)胞百分比計分相乘所得總計分來判定表達(dá)情況，將>4分定義為陽性表達(dá)。

表1 染色評估標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測ESM-1和Vaspin的mRNA表達(dá)量：將剩下的腦組織樣本使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific公司，貨號：K0731)提取RNA，根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，貨號：R1042]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；然后使用熒光定量染料(北京索萊寶科技有限公司，貨號：SR1110)配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括cDNA 5 μL、反應(yīng)預(yù)混液12.5 μL、正向引物(10 μmol/L)0.5 μL、反向引物(10 μmol/L)0.5 μL、去離子水6.5 μL。在ExicyclerTM96(BIONEER公司)定量系統(tǒng)上采集信號，擴(kuò)增程序為預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，變性—退火/延伸共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算ESM-1和Vaspin的mRNA相對表達(dá)量。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表2。

表2 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線繪制腦出血組織中ESM-1 mRNA與Vaspin mRNA表達(dá)量對腦出血患者預(yù)后的預(yù)測效能，其中曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.70～0.85時預(yù)測價值一般，>0.85時預(yù)測價值較好，AUC的比較采用Z檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦出血患者腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率及ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表達(dá)量的比較 對照組腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率，以及ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表達(dá)量均高于腦出血組(均P<0.05)。見表3、圖1、圖2。

表3 腦出血患者腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率及mRNA相對表達(dá)量的比較

圖1 ESM-1蛋白在腦組織中的陽性表達(dá)(免疫組化染色，×100)

圖2 Vaspin蛋白在腦組織中的陽性表達(dá)(免疫組化染色，×100)

2.2 不同病情嚴(yán)重程度患者腦出血點附近腦組織ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率的比較 按入院時NIHSS評分將患者分為輕型組33例(NIHSS評分1～4分)、中型組26例(NIHSS評分5～15分)、重型組25例(NIHSS評分>15分)。3組患者的性別、年齡、合并基礎(chǔ)疾病情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而輕型組腦出血點附近腦組織中的ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率均高于重型組(均P<0.05)。見表4。

表4 不同病情嚴(yán)重程度患者一般資料及腦出血點附近腦組織ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率的比較

2.3 不同出血量患者腦出血點附近腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率的比較 根據(jù)入院時出血量將患者分為小量出血組31例(腦出血量<15 mL)、中量出血組28例(腦出血量15～30 mL)、大量出血組25例(腦出血量>30 mL)。3組患者的性別、年齡、合并基礎(chǔ)疾病情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而小量出血組腦出血點附近腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率均高于大量出血組(均P<0.05)。見表5。

表5 不同出血量患者一般資料及腦出血點附近腦組織ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達(dá)率的比較

2.4 腦出血患者腦出血點附近腦組織中ESM-1、Vaspin mRNA表達(dá)量的相關(guān)性 腦出血患者腦出血點附近腦組織中ESM-1 mRNA表達(dá)量與Vaspin mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.674，P<0.001)。見圖3。

圖3 腦出血患者腦出血點附近腦組織中ESM-1 mRNA表達(dá)量與Vaspin mRNA表達(dá)量的相關(guān)性

2.5 腦出血點附近腦組織ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表達(dá)量對腦出血患者預(yù)后的預(yù)測效能 所有患者出院后均隨訪3個月，按GOS評分分為預(yù)后良好組49例(GOS評分>4分)與預(yù)后不良組35例(GOS評分≤4分)。ROC分析結(jié)果顯示，腦出血點附近腦組織ESM-1 mRNA表達(dá)量預(yù)測腦出血患者預(yù)后不良的AUC為0.842(95%CI:0.784，0.901)，截斷值、敏感度、特異度分別為1.38、83.30%、72.30%；腦出血點附近腦組織Vaspin mRNA表達(dá)量預(yù)測腦出血患者預(yù)后不良的AUC為0.896(95%CI:0.846，0.946)，截斷值、敏感度、特異度分別為1.46、83.30%、84.30%；ESM-1 mRNA表達(dá)量、Vaspin mRNA表達(dá)量聯(lián)合預(yù)測的AUC為0.947(95%CI:0.914，0.981)，敏感度及特異度分別為91.70%、83.20%。ESM-1 mRNA表達(dá)量、Vaspin mRNA表達(dá)量單獨預(yù)測腦出血患者預(yù)后不良的AUC差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.383，P=0.167)，二者聯(lián)合預(yù)測腦出血患者預(yù)后不良的AUC大于ESM-1 mRNA表達(dá)量(Z=3.045，P=0.002)，但與Vaspin mRNA表達(dá)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.687，P=0.092)。見圖4。

圖4 腦出血點附近腦組織ESM-1 mRNA表達(dá)量、Vaspin mRNA表達(dá)量預(yù)測腦出血患者預(yù)后不良的ROC曲線

3 討 論

腦出血好發(fā)于秋冬季節(jié)，與患者情緒波動有關(guān)，具有發(fā)病急、進(jìn)展快、預(yù)后差等特點，因此，早期判斷病情嚴(yán)重程度和疾病轉(zhuǎn)歸，將有助于提高治療效果。研究表明，自發(fā)性腦出血的主要原因為高血壓，高血壓產(chǎn)生的機械應(yīng)變力引起血管壁損傷，進(jìn)而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞以形成顱內(nèi)微小血管瘤[13]。Kang等[14]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮酶對損傷后血管修復(fù)過程具有重要作用，提示其可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的潛在靶點。目前關(guān)于腦血管自我修復(fù)的潛在靶點的研究較少，本研究觀察了正常腦組織與腦出血點附近腦組織中ESM-1、Vaspin的表達(dá)情況，為腦血管自我修復(fù)提供新靶點。

ESM-1是一種免疫炎癥標(biāo)志物，與腦血管疾病相關(guān)，在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮黏附中發(fā)揮重要作用，在血漿中能夠維持內(nèi)皮細(xì)胞的完整功能[15]。ESM-1還可以通過激活氧自由基，誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝。同時，ESM-1也是內(nèi)皮細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號的調(diào)節(jié)因子，這可能對腦出血血管修復(fù)具有潛在的治療價值[16]。本研究結(jié)果顯示，對照組ESM-1蛋白陽性表達(dá)率及mRNA表達(dá)量均高于腦出血組，且輕型組、小量出血組腦出血點附近腦組織中的ESM-1蛋白陽性表達(dá)率分別高于重型組、大量出血組(均P<0.05)，說明腦出血點附近腦組織中ESM-1呈低表達(dá)水平，且ESM-1可以反映腦出血患者病情嚴(yán)重程度，這可能提示血管內(nèi)皮自我修復(fù)能力降低。既往研究顯示，缺氧誘導(dǎo)因子-1α/VEGF通路可調(diào)控ESM-1從而增強單核細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，高水平的ESM-1對血管損傷有修復(fù)作用，而ESM-1水平較低則不利于血管修復(fù)[16-17]，與本研究結(jié)論相似。此外，本研究結(jié)果顯示，腦出血點附近腦組織的ESM-1 mRNA表達(dá)量預(yù)測腦出血患者預(yù)后不良的AUC為0.842，說明ESM-1對腦出血患者預(yù)后有一定預(yù)測價值。以上研究結(jié)果均提示ESM-1在腦出血中扮演重要角色，ESM-1可能成為治療急性腦出血的新靶點。

Vaspin是一種抗炎因子，主要參與脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗過程。在血管內(nèi)皮中，Vaspin可以降低血管內(nèi)皮功能障礙，通過抑制炎癥反應(yīng)保護(hù)血管內(nèi)皮[18]。高榮華等[19]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清Vaspin水平低于0.57 ng/mL時，提示急性心肌梗死患者冠狀動脈支架植入術(shù)后發(fā)生心血管不良事件風(fēng)險較大，表明低表達(dá)量的Vaspin與急性心肌梗死患者機體的炎癥反應(yīng)增強相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，對照組Vaspin蛋白陽性表達(dá)率及mRNA表達(dá)量均高于腦出血組，且輕型組、小量出血組腦出血點附近腦組織中的Vaspin蛋白陽性表達(dá)率分別高于重型組、大量出血組(均P<0.05)，說明Vaspin可能參與腦出血的形成過程，其表達(dá)水平與腦出血患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)。原因可能是：Vaspin表達(dá)量越低，對血管修復(fù)作用越弱，患者病情越嚴(yán)重，血管壁及腦組織破壞越嚴(yán)重。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Vaspin可以增強內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，增加血管黏附力和抗剪切力。本研究結(jié)果顯示，腦出血點附近腦組織的Vaspin mRNA表達(dá)量預(yù)測腦出血患者預(yù)后不良的AUC為0.896，敏感度為83.30%，特異度84.30%，說明Vaspin對腦出血患者預(yù)后有一定預(yù)測價值。此外，本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示，腦出血點附近腦組織的ESM-1 mRNA與Vaspin mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，我們推測ESM-1與Vaspin共同維持血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性。ESM-1 mRNA表達(dá)量、Vaspin mRNA表達(dá)量聯(lián)合預(yù)測腦出血患者預(yù)后的AUC為0.947，敏感度、特異度為91.70%、83.20%，提示ESM-1、Vaspin聯(lián)合預(yù)測腦出血患者預(yù)后具有較大的參考價值。

綜上所述，ESM-1、Vaspin在腦出血患者腦出血點附近腦組織中呈低表達(dá)，二者共同參與腦出血的發(fā)生，且與腦出血嚴(yán)重程度密切相關(guān)，二者聯(lián)合預(yù)測腦出血患者預(yù)后的價值較高。