胡瑩潔

(武漢市第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北省武漢市 430033)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一種器官特異性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞破壞或功能衰竭引起的血糖升高，患者需終生依賴胰島素治療維持生命。T1DM多發(fā)生于青少年，由于多數(shù)T1DM患者發(fā)病時(shí)年齡偏低、自控能力差，使得血糖控制難度較大，其導(dǎo)致的糖尿病酮癥酸中毒是1型糖尿病兒童最常見的死亡原因之一，因此研究T1DM的防治手段尤為重要[1]。目前認(rèn)為T1DM的發(fā)生是遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素共同作用的結(jié)果，免疫因素可能在T1DM的發(fā)展中扮演重要角色并受到越來越多的關(guān)注[2]。

人體免疫系統(tǒng)分為固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)兩大類。固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cell，ILC)是固有免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)細(xì)胞群，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的皮膚、肺、腸道及脂肪組織等防御屏障，具有介導(dǎo)免疫、協(xié)助組織修復(fù)重建、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種功能[3]。ILC可根據(jù)其表達(dá)的特定轉(zhuǎn)錄因子和分泌的細(xì)胞因子分為三類，即ILC1、ILC2和ILC3。其中，ILC2主要分布于黏膜組織(肺和腸道)、非淋巴器官(肝、腎和內(nèi)臟脂肪組織)、淋巴器官(脾、骨髓)及血液，在宿主防御、組織修復(fù)及抵抗炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[4]。ILC2主要介導(dǎo)Th2類免疫應(yīng)答，并可以通過多種效應(yīng)細(xì)胞因子調(diào)控不同信號(hào)通路，參與哮喘、特異性皮炎、嗜酸性胃腸炎等多種免疫性疾病的發(fā)生[5]。ILC2作為單獨(dú)的細(xì)胞亞群，在激活的狀態(tài)下可迅速產(chǎn)生Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子和其他效應(yīng)分子，包括白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、IL-5、IL-9、IL-13和表皮生長因子受體配體雙向調(diào)節(jié)因子，并通過這些細(xì)胞因子驅(qū)動(dòng)2型免疫反應(yīng)的發(fā)生[6]。本研究通過分析T1DM患兒與正常兒童ILC2及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)差異，初步探討ILC2與T1DM的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2020年1月于武漢市第四醫(yī)院住院的20例T1DM患兒為T1DM組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡8～18歲；(2)符合1999年世界衛(wèi)生組織制定的1型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)2型糖尿病患兒；(2)合并糖尿病急性并發(fā)癥，如糖尿病酮癥、酮癥酸中毒、高血糖高滲狀態(tài)；(3)患有T1DM以外的其他自身免疫性疾?。?4)有遺傳病家族史。另選取同期來武漢市第四醫(yī)院體檢中心體檢的20名健康兒童為正常對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡8～18歲；(2)無糖尿病及糖調(diào)節(jié)受損；(3)尿糖陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有自身免疫性疾?。?2)有遺傳病家族史。本研究經(jīng)武漢市第四醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，研究對(duì)象家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集一般資料：收集兩組兒童的年齡、性別、血壓。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測：于T1DM組患兒入院時(shí)采集其空腹肘靜脈血5 mL，于正常對(duì)照組兒童在體檢時(shí)采集其空腹肘靜脈血5 mL，采用己糖激酶法檢測空腹血糖及餐后2 h血糖，采用氧化酶法檢測總膽固醇、三酰甘油，采用直接法檢測LDL-C、HDL-C，使用ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀(Siemens公司)檢測上述指標(biāo)，嚴(yán)格按照試劑盒(重慶中元生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：H200905、H201109、H201008、H201203、H201106；積水醫(yī)療科技有限公司，批號(hào)：841RIS)說明書進(jìn)行檢測。采用高效液相色譜法檢測HbA1c，檢測儀器為伯樂D-10糖化血紅蛋白儀(試劑盒：伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司，批號(hào)：64431018)。

1.2.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離：于T1DM組患兒入院時(shí)采集其空腹肘靜脈血3 mL，于正常對(duì)照組兒童在體檢時(shí)采集其空腹肘靜脈血3 mL，經(jīng)肝素鈉抗凝后，在室溫下1 500 r/min離心10 min。離心結(jié)束后將下層細(xì)胞沉淀物移至50 mL離心管中，并加入PBS稀釋，用無菌吸管小心吸取白色細(xì)胞層置于另一無菌離心管(已事先加入等體積單核細(xì)胞分離液)，室溫下2 500 r/min離心25 min，加入適量PBS，1 500 r/min離心10 min，得到的白色沉淀即為外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC中的ILC2水平：取200 μL PBMC懸液至流式細(xì)胞儀上機(jī)管，加入5 μL鼠抗人CD45抗體、5 μL鼠抗人CD127抗體、5 μL鼠抗人CD294抗體及人Lineage復(fù)合抗體(由CD2、CD3、CD4、CD7等組成)，以上抗體均購自伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司。充分混勻，室溫避光孵育40 min。將Lineage-CD45+CD127+CD294+細(xì)胞判定為ILC2，采用流式細(xì)胞儀分析ILC2占PBMC的比例。上述實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 ELISA 檢測：于T1DM組患兒入院時(shí)采集其空腹肘靜脈血2 mL，于正常對(duì)照組兒童在體檢時(shí)采集其空腹肘靜脈血2 mL，常溫下3 000 r/min離心20 min，收集上清液。采用 ELISA測定血清IL-4、IL-5和IL-13水平。ELISA試劑盒購于上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司(批號(hào)：20200708、20200802、20200907)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料及生化指標(biāo)的比較 兩組的性別、年齡、收縮壓、舒張壓及總膽固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與正常對(duì)照組相比，T1DM組的空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c水平均升高(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料及生化指標(biāo)的比較

2.2 兩組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較 與正常對(duì)照組比較，T1DM組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均升高(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較(x±s)

2.3 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與一般資料、生化指標(biāo)及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的相關(guān)性分析 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與年齡、收縮壓、舒張壓及總膽固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油水平之間均無相關(guān)性(均P>0.05)，但I(xiàn)LC2占PBMC的比例與空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c及血清IL-4、IL-5、IL-13水平之間均呈正相關(guān)(均P<0.05)。見表3和表4。

表3 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與一般資料、生化指標(biāo)的相關(guān)性

表4 ILC2占PBMC的比例與血清IL-4、IL-5及IL-13水平的相關(guān)性

3 討 論

ILC2是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的ILC亞群，它由骨髓中的淋巴祖細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合抑制劑2、RAR相關(guān)孤兒受體α(RAR related orphan receptor alpha,RORα)和GATA結(jié)合蛋白3的調(diào)控下產(chǎn)生，是小鼠和人類2型免疫反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子之一[8]。有學(xué)者指出，ILC2通過分泌2類細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13來參與宿主防御、組織修復(fù)及抵抗炎癥性疾病[9]。目前關(guān)于 ILC2在自身免疫性疾病、過敏性疾病中的研究受到越來越多的關(guān)注。

ILC主要分布在腸黏膜，可以調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)和保護(hù)腸黏膜的完整性。Monticelli等[10]的研究表明，ILC2在腸道中發(fā)揮屏障保護(hù)作用，在腸道受損時(shí)，IL-33/雙向調(diào)節(jié)因子(amphiregulin,AREG)/表皮生長因子受體信號(hào)通路可能通過ILC2抑制炎癥和/或促進(jìn)上皮修復(fù)。有研究顯示，IL-33作為一種細(xì)胞因子“警報(bào)”，可在上皮細(xì)胞損傷時(shí)激活肺和腸的常駐免疫細(xì)胞亞群；IL-33是誘導(dǎo)體內(nèi)ILC2中AREG表達(dá)的有效刺激因子，特別是在腸道中，IL-33 通過誘導(dǎo)腸道中ILC2的表達(dá)從而促進(jìn)AREG的分泌[11]。該研究還顯示，IL-33可誘導(dǎo)不同功能的ILC2群體，同時(shí)表達(dá)IL-5、IL-13和/或AREG，提示ILC2亞群參與調(diào)節(jié)腸道表面屏障的炎癥反應(yīng)[11]。還有學(xué)者在惡唑酮誘導(dǎo)的腸道損傷模型中觀察到，IL-25可誘發(fā)與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的IL-13和ILC2的表達(dá)，這表明在某些情況下ILC2可能參與腸道損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)[12]。

國外有關(guān)ILC過度活化后誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生而引發(fā)自身免疫性疾病的研究，多集中在腸道疾病及皮膚疾病領(lǐng)域。研究顯示，在克羅恩病患者腸道內(nèi)，ILC1表達(dá)升高，ILC1過度活化后通過分泌γ干擾素加重腸道的炎癥水平，而持續(xù)的炎癥會(huì)引起炎性腸道疾病[13-14]，腸道菌群參與ILC的分化，同時(shí)ILC可通過產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞因子影響腸道菌群組成[15]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腸道菌群產(chǎn)物芳香烴受體配體和丁酸可以促進(jìn)胰腺中的ILC分泌IL-23和IL-22，后兩者誘導(dǎo)胰腺分泌細(xì)胞表達(dá)甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二苷酸結(jié)合域蛋白14，如果腸黏膜固有層存在ILC并分泌IL-22，將影響免疫炎癥反應(yīng)與免疫耐受之間的平衡，推測此機(jī)制在腸道炎癥的遷延、復(fù)發(fā)、擴(kuò)散中起關(guān)鍵作用[15]。此外，Kim等[16]首次發(fā)現(xiàn)ILC2 在人及小鼠中均參與了特應(yīng)性皮炎的發(fā)病過程，表面標(biāo)志為Lineage-CD25+IL-33R+的ILC2在特應(yīng)性皮炎皮損中聚集，從特應(yīng)性皮炎皮損區(qū)分離得到的ILC2可以表達(dá)前列腺素D2受體及CD161，但從正常皮膚分離得到的ILC2并不表達(dá)前列腺素D2受體及CD161。

張淡宜等[17]的研究表明，橋本甲狀腺炎患者外周血中IL-5、IL-13水平升高。IL-13被認(rèn)為是抗炎細(xì)胞因子，同時(shí)又是強(qiáng)促纖維化因子，其可以表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能，最終的效應(yīng)是促進(jìn)炎癥消退或者介導(dǎo)病理應(yīng)答，在哮喘患者中IL-13是介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性和黏膜高分泌的主要介質(zhì)[18]。有學(xué)者通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，橋本甲狀腺炎患者PBMC中RORα、IL-5、IL-13水平均明顯升高，相關(guān)性分析顯示RORα和IL-13呈正相關(guān)[19]。RORα是調(diào)控ILC2的特征性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)維持ILC2分化和功能起到重要作用。進(jìn)一步對(duì)外周血循環(huán)中ILC2表達(dá)水平與抗體數(shù)量的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RORα與抗甲狀腺過氧化物酶抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體呈正相關(guān)，IL-5也與抗甲狀腺過氧化物酶抗體呈正相關(guān)，IL-13與抗甲狀腺過氧化物酶抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體呈一定的正相關(guān)趨勢[19]。這提示ILC2 活性增強(qiáng)可能是橋本甲狀腺炎發(fā)病的重要免疫學(xué)機(jī)制。

通過上述研究可知，ILC2調(diào)節(jié)機(jī)制在自身免疫疾病中具有重要作用，炎癥因子表達(dá)升高可促進(jìn)ILC分化，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，但其具體機(jī)制尚存在爭議。本研究結(jié)果顯示，T1DM患兒PBMC中的ILC2比例增高，并且T1DM患兒血清IL-4、IL-5、IL-13水平高于健康兒童，且T1DM患兒的ILC2占PBMC的比例與血清IL-4、IL-5、IL-13水平呈正相關(guān)(均P<0.05)，提示T1DM患兒存在體內(nèi)ILC2增加，且炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，ILC2可能通過與炎癥因子相互作用，在T1DM發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用。本研究行進(jìn)一步相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c水平均呈正相關(guān)(均P<0.05)，提示ILC2可能參與T1DM的病情進(jìn)展。

綜上所述，T1DM患兒體內(nèi)ILC2增加，其與患兒的血糖控制水平及炎病水平呈正相關(guān)，ILC2可能通過與炎癥因子相互作用，參與T1DM的發(fā)生和發(fā)展，ILC2有可能成為T1DM潛在的治療靶點(diǎn)。但由于本研究臨床樣本量小，未涉及具體作用機(jī)制的研究。今后可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步明確ILC2與Th2類細(xì)胞因子之間的上下游關(guān)系，從而闡明ILC2參與T1DM發(fā)病的分子機(jī)制。