孟千琳，凌保東

(1.成都醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610500)

近年來(lái)，泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(extensively drug resistantAcinetobacterbaumannii，XDRAB)檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，被稱為“21世紀(jì)革蘭陰性桿菌中的MRSA”[1]，對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅。鮑曼不動(dòng)桿菌的致病性與多種毒力因子有關(guān)，生物被膜作為重要的毒力因子，具有極強(qiáng)的黏附性、抗吞噬性、耐藥性，有助于鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院環(huán)境中的生存與轉(zhuǎn)移[2]。相關(guān)分子流行病學(xué)研究表明[3]，鮑曼不動(dòng)桿菌流行菌株具有不同的多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，鮑曼不動(dòng)桿菌克隆的基因組主要分為3個(gè)國(guó)際克隆組：國(guó)際克?、?(IC1)、國(guó)際克?、?IC2)和國(guó)際克?、?IC3)，其中IC2是歐洲和亞洲的主要克隆系。有研究表明[4]，亞洲國(guó)家的耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌以IC2的克隆復(fù)合體(CC92)為主。此外，腸桿細(xì)菌基因間重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR) 常用于研究從不同標(biāo)本中收集的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株之間的關(guān)系，有助于確定鮑曼不動(dòng)桿菌與流行性克隆的傳播關(guān)系[5]。本研究通過(guò)MLST與ERIC-PCR對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行同源性分析，同時(shí)檢測(cè)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的生物被膜形成能力，進(jìn)一步掌握院內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌流行現(xiàn)狀，以期為臨床防控泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 37株XDRAB來(lái)自成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2018年1月—2020年7月患者，痰液20份，灌洗液9份，導(dǎo)管4份，傷口分泌物、膿液、尿、腦脊液各1份，其中臨床分布重癥醫(yī)學(xué)科15株，呼吸科重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)11株，外科6株，內(nèi)科5株。質(zhì)控菌金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)、酶標(biāo)儀(SpectraMa190)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(科茲莫生物科技有限公司)。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB， 青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20200815)，結(jié)晶紫(成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170416)、磷酸鹽緩沖液(PBS，上海生工生物工程有限公司，批號(hào)：20201228)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物和測(cè)序(北京擎科生物科技有限公司)、2×Taq Master Mix (Dye Plus，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1XDRAB藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI2020)標(biāo)準(zhǔn)，金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺類、氨基苷類、喹諾酮類、多粘菌素類等16種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)值。

1.2.2XDRAB生物被膜形成能力檢測(cè) 菌液的制備：將細(xì)菌接種于LB固體培養(yǎng)板上，37 ℃，孵育16～20 h后，挑取單克隆于0.9%氯化鈉溶液200 μL中，吹打混勻，取100 μL，使用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處吸光度(A值)，用0.9%氯化鈉溶液調(diào)整至A600值=0.1，即為麥?zhǔn)?.5濃度，細(xì)菌含量達(dá)到1×108CFU·mL-1。結(jié)晶紫染色法(crystal violet staining，CVS)：參照文獻(xiàn)[6-7]的實(shí)驗(yàn)方法，并稍作調(diào)整，使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以大腸埃希菌DH5α為陰性對(duì)照組，菌株統(tǒng)一設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加入A600值=0.1菌液20 μL和TSB培養(yǎng)基180 μL，37 ℃，孵育24 h。次日吸出培養(yǎng)基，用PBS 200 μL清洗3次，空氣干燥20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，吸出結(jié)晶紫，重復(fù)PBS清洗3次，空氣干燥20 min，加入95%乙醇溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm下A值。生物被膜形成能力判定標(biāo)準(zhǔn)為：①陰性：A模型對(duì)照≤A陰性對(duì)照；②弱陽(yáng)性：A陰性對(duì)照 3 ×A陰性對(duì)照。

1.2.3MLST分型 鮑曼不動(dòng)桿菌管家基因序列參照MLST數(shù)據(jù)庫(kù)Oxford方案(https：//pubmlst.org/organisms/acinetobacter-baumannii)，包括7個(gè)管家基因，分別為：gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD。PCR反應(yīng)體系：2 × Taq Master Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 5.5 μL，共15 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增片段測(cè)序后與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)獲得等位基因譜，按照gltA-gyrB-recA-cpn60-gpi-rpoD的排列順序輸入數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得對(duì)應(yīng)菌株的序列型(sequence type，ST)進(jìn)行分析。

1.2.4ERIC-PCR分型 參照文獻(xiàn)[8]合成引物，PCR反應(yīng)體系：2 × Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板10 μL，ddH2O 11 μL，共50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35次循環(huán)，72 ℃延伸10 min。使用Image Lab 5.0軟件定量工具自動(dòng)分析條帶數(shù)量進(jìn)行同源性分析，參照文獻(xiàn)[9]比較菌株間相似性，以主條帶位置和數(shù)量相同定義為同一基因型。

2 結(jié)果

2.1XDRAB對(duì)抗菌藥物的耐藥情況 37株XDRAB除對(duì)多粘菌素類、替加環(huán)素敏感外，其余抗菌藥物均耐藥，具體結(jié)果見表1。

2.2XDRAB培養(yǎng)24 h后生物被膜形成能力檢測(cè) 細(xì)菌培養(yǎng)24 h后，使用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物被膜形成進(jìn)行定量檢測(cè)，與陰性對(duì)照組DH5α比較，4株為強(qiáng)被膜形成菌株，7株為中被膜形成菌株，19株為弱被膜形成菌株，其余為陰性7株。

2.3MLST對(duì)XDRAB分型結(jié)果 經(jīng)測(cè)序的37株XDRAB，按照ST分型和等位基因編號(hào)后結(jié)果顯示，37株XDRAB分為3種ST序列型，其中34株XDRAB為ST208型，2株為ST195型，1株為ST368型。ST208型菌株主要分離于呼吸科重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)(10/34)和重癥醫(yī)學(xué)科(14/34)，分離標(biāo)本主要來(lái)源于痰液(18/34)和灌洗液(8/34)。與全球序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，37株XDRAB均屬于國(guó)際克隆組IC2的克隆復(fù)合體(CC92)，說(shuō)明CC92為XDRAB感染流行的主要克隆復(fù)合體。

2.4ERIC-PCR對(duì)XDRAB擴(kuò)增結(jié)果 37株XDRAB經(jīng)ERIC-PCR擴(kuò)增后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，形成2條左右的堿基條帶，條帶長(zhǎng)度為250～500 bp，通過(guò)分析，菌株被分為I型(22株)，II型(15株)，共2種類型，結(jié)果見圖1。

M：DNA2000Marker；1-9，11，13，15-17，19，21-24為I型；其余為Ⅱ型。圖1 部分XDRAB的ERIC-PCR圖譜M：DNA2000Marker； 1-9，11，13，15-17，19，21-24 are type I； the other are type Ⅱ.Fig.1 ERIC-PCR of partial XDRAB strains

3 討論

XDRAB生物被膜的形成使臨床面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[10]，生物被膜形成過(guò)程主要分為四個(gè)階段：初始黏附、增殖、形成成熟生物被膜、生物被膜的分散再定植。生物被膜一旦形成，可通過(guò)滲透限制、營(yíng)養(yǎng)限制、基因表達(dá)上調(diào)、免疫逃逸等耐藥機(jī)制為鮑曼不動(dòng)桿菌提供保護(hù)模式并增強(qiáng)對(duì)抗菌藥物的抵抗力[11-12]。本研究中37株XDRAB經(jīng)檢測(cè)有30株具有生物被膜形成能力，81%以上XDRAB均會(huì)形成生物被膜，是導(dǎo)致醫(yī)院慢性感染和難治性感染的反復(fù)發(fā)作的重要原因。

為避免XDRAB在院內(nèi)感染繼續(xù)擴(kuò)散，選擇有效的準(zhǔn)確的菌株同源性分析方法至關(guān)重要。MLST作為分子流行病學(xué)和菌株種群遺傳分析的通用方法[13]，通過(guò)分析細(xì)菌7個(gè)管家基因的等位基因內(nèi)部片段的DNA序列，清晰呈現(xiàn)每個(gè)分離株的序列類型。分離株的遺傳相關(guān)性可以通過(guò)等位基因圖譜之間的差異矩陣以樹狀圖的形式直觀呈現(xiàn)[14]。ERIC-PCR指紋圖譜是最有效區(qū)分鮑曼不動(dòng)桿菌的分子分型技術(shù)之一[15]，包含重復(fù)序列(如：ERIC序列)的細(xì)菌基因組可通過(guò)該序列快速評(píng)估細(xì)菌分離株的克隆變異性。本研究采用MLST和ERIC-PCR兩種國(guó)際通用分子分型技術(shù)對(duì)37株XDRAB進(jìn)行同源性分析，MLST結(jié)果顯示，ST208型為主要分型，其次為ST195和ST368，均屬于CC92，該結(jié)果與KIM等[16]研究結(jié)果一致，此外，QU等[17]研究表明，ST208型已成為中國(guó)西部地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌感染暴發(fā)的主要序列型。ERIC-PCR結(jié)果顯示，37株XDRAB分為Ⅰ型(22株)、Ⅱ型(15株)，由于ERIC基因?yàn)楸Ｊ匦蛄?，其擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)法完全確定，可能會(huì)出現(xiàn)部分電泳條帶缺失、模糊等不確定因素[18]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇采用兩種分子分型技術(shù)對(duì)XDRAB進(jìn)行同源性分析，以保證更全面地呈現(xiàn)XDRAB的流行病學(xué)趨勢(shì)。

目前，關(guān)于XDRAB的流行病學(xué)與毒力因子相關(guān)性分析的研究很少。生物被膜作為重要的毒力因子[19]，其形成的分子機(jī)制和基因主要包括Csu基因座(CsuAB/A/B/C/D/ E)參與菌毛合成，Pga基因座參與編碼多聚-N-乙酰基葡糖胺(PNAG)，OmpA參與編碼外膜蛋白，Bap參與編碼生物被膜相關(guān)蛋白[20]。相關(guān)研究表明[21]，ST208攜帶主要生物被膜形成基因，其中97.7%存在Csu基因，ST195對(duì)Pga和OmpA基因陽(yáng)性率高。由于本研究菌株ST分型主要以ST208為主，所以無(wú)法深入分析生物被膜形成能力與ST分型的相關(guān)性，對(duì)于XDRAB流行病學(xué)與毒力因子相關(guān)性分析，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，XDRAB導(dǎo)致的院內(nèi)感染的治療作為全球公共衛(wèi)生的重大難題，亟待制定出可控治療方案，本研究采用目前國(guó)際常用分子分型技術(shù)MLST與ERIC-PCR對(duì)XDRAB進(jìn)行流行病學(xué)分析，針對(duì)ST208菌株需要嚴(yán)格注意感染路徑，避免交叉感染，盡可能降低臨床感染風(fēng)險(xiǎn)。