錢安丹，陶潔潔，陳雙利，周榮輝，樓飛靈，王美豪

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）是一種通常在兒童和青少年時期診斷出的神經發(fā)育障礙性疾病，以注意力不集中和（或）沖動多動為特征，具有異質性的臨床表型[1]。多巴胺D4受體（dopamine D4 receptor, DRD4）基因第3外顯子48 bp可變數目順向重復（variable number forward repetition,VNTR）被認為是影響ADHD易感性的有力候選基因，有助于改善兒童該疾病的特異性診斷[2]。最近的研究證據表明DRD4二次重復等位基因（2R）作為亞洲人群中更常見的基因亞型，與ADHD風險增加相 關[3]。DRD4不僅在人類大腦高表達，在視網膜也存在[4]，可能與視覺相關的異常更為密切。有研究表明，ADHD兒童更常被診斷為不同的視覺異常，包括屈光不正[5]、非典型眼球運動[6]、視覺處理缺 陷[7]、色覺改變等。通過一些任務態(tài)腦功能研究發(fā)現，ADHD患兒較健康對照組在視覺認知功能上也存在缺陷[8-9]，視覺網絡對該疾病的分類診斷有更高的精度[10]。因此，視覺相關網絡可能是ADHD患兒在遺傳和行為之間的通路上潛在內表型之一，在遺傳和行為之間的通路上識別可以為ADHD的神經病理機制提供重要的見解。

本研究采用獨立成分分析方法（independent component analysis，ICA）對DRD4不同基因型患兒的靜息狀態(tài)功能磁共振成像（resting state functional magnetic resonance imaging，rsfMRI）數據進行分析，探索了視覺相關腦網絡的功能連接變化，比較了視覺網絡的功能連接與癥狀嚴重程度的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 2017年2月至2020年1月間，溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院精神科招募了124例ADHD患兒，年齡6～15歲。ADHD診斷由3名經驗豐富的精神科醫(yī)師按照《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第五版（DSM-V）標準進行評估。兩名受試者根據以下排除標準被剔除：①有器質性腦疾病史和伴有意識障礙的腦外傷史；②根據《學齡兒童情感障礙和精神分裂癥現用和終生版量表》（K-SADS-PL）有精神障 礙史；③根據中國修訂的韋氏智力量表，智商低于75；④曾接受過任何精神藥物治療；⑤藥物依賴或藥物濫用（包括海洛因、尼古丁或酒精成癮）。本研究經溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床倫理委員會批準。所有受試者自愿參與，并充分了解研究的目的、程序和潛在風險，父母或監(jiān)護人簽署了知情同意書。入選兒童的父母完成了SNAP-IV評定量表（SNAP-IV）評估患兒的行為及癥狀嚴重程度[11]。入選患兒完成視聽整合持續(xù)性操作測驗（integrated visual and auditory continuous performance test，IVA-CPT）用于衡量視覺和聽覺方面的持續(xù)注意力、反應控制等[12]，共獲得了6個指標：綜合控制力/注意力商數、視覺控制/注意商數和聽覺控制/注意商數。

1.2 基因型測定 采集患兒靜脈血，用TIANGEN（DP304號）進行基因組DNA分析，然后使用PCR和短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat sequence，STR）方法對每個受試者的DRD4第3號外顯子的48 bp VNTR進行基因分型。PCR反應以25 μL體積制備，每個體積包含12.5 μL KAPA2G快速復合混合物、1 μL正向引物（10 mmol/L）、1 μL反向引物（10 mmol/L）、1 μL模板DNA和9.5 μL ddH2O。樣品在95 ℃加熱10 min，經歷多次循環(huán)后，最終在4 ℃下進行延伸。將GS500LIZ標準樣品與PCR產物混合，進行HIDI電泳，獲得STR圖譜。

1.3 數據掃描 采用美國GE Signa-HDx 3.0Tesla磁共振掃描儀進行全腦掃描成像。先采集T2加權圖像為排除顱內結構性病變，再使用回波平面成像序列（echo plane imaging sequence，EPI）采集rs-fMRI數據，成像參數如下：TR/TE=2 000/26 ms； FOV=192 mm×192 mm；矩陣=64×64；翻轉角度（FA）= 90°；層厚=4 mm；層間距=0 mm；層數33層；240個體積。在rs-fMRI掃描期間，要求所有受試者閉上眼睛，戴上海綿耳塞，盡可能保持靜止，保持清醒，避免思維活動。為確?；純旱陌踩诒O(jiān)護人的陪同下進行全程掃描。

1.4 數據預處理 rs-fMRI數據預處理采用DPABI（http://rfmri.org/dpabi）和MATLAB平臺。預處理步驟包括：①剔除前10個掃描時間點；②時間校正；③頭動校正：去除頭部運動三維平移超過3.0 mm 和（或）三維旋轉超過3°和（或）FD值（frame-wise displacement measurements，FD）不超過0.5的19個受試者數據；④圖像在空間上標準化為標準模板（montreal neurological institute，MNI），并重新采樣體素大小為3 mm×3 mm×3 mm；⑤標準化的fMRI數據用4 mm×4 mm×4 mm半高全寬（full width half-maximum，FWHM）高斯核進行平滑處理，以適應受試者間的解剖變異。

1.5 獨立成分分析 獨立成分分析是一種數據驅動的分析rs-fMRI數據的方法。采用fMRI工具包中的組ICA（MICA beta1.22，http://www.nitrc.org/projects/cogicat/）可獲得更穩(wěn)定的結果。MICA進行數據分析的三個主要階段：①數據降維；②ICA算法的應用；③每個個體的圖像與時間序列重建。在本研究中，采用SOI-GICA算法并進行了100次GICA，根據之前的研究[13]，每個受試者獲得了30個獨立成分。對剔除成分的肉眼識別表明，它們可能與眼球運動、頭部運動或心跳引起的搏動有關。通過肉眼識別的金標準確定三個與視覺相關的組成部分，包括內側視覺網絡（成分18）、枕極視覺網絡（成分22）、外側視覺網絡（成分15），這三個部分在網絡節(jié)點方面與先前的研究[13-14]高度一致。在進行組間比較之前，獲取受試者特定的全腦空間地圖并轉換成Z分數。

1.6 統(tǒng)計學處理方法 從所有受試者數據中提取這三個成分之后，采用MATLAB平臺中的REST對每一組人的三個成分分別用單樣本t檢驗產生各自腦網絡空間地圖的統(tǒng)計結果。單樣本的特定空間地圖作為后續(xù)兩樣本t檢驗分析的腦網絡模板。隨后，在去除性別、年齡和智商協(xié)變量之后，對每個成分的兩個基因組間差異進行兩樣本t檢驗，閾值設定體素水平P＜0.05和團塊水平P＜0.001（使用CDT多重比較校正）[15]。對人口統(tǒng)計學數據采用SPSS軟件進行兩樣本t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗或卡方檢驗比較組間差異；臨床量表的相關分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 103例受試者按基因型分為兩組（2R攜帶者組41例，其中36例2R/4R基因型，4例2R/2R基因型，1例2R/5R基因型；2R非攜帶者組62例，其中52例4R/4R基因型，2例4R/3R基因型，5例4R/5R基因型，3例4R/6R基因型）。兩組人群基因型處于Hardy-Weinberg遺傳平衡法則。兩組在年齡（P=0.594）、智商（P=0.533）或性別分布（P=0.388）方面差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 DRD4 2R攜帶者組與2R非攜帶者組的臨床特征

2.2 不同DRD4基因型視覺功能網絡ICA功能連接強度的差異 以年齡、性別、智商作為協(xié)變量，DRD4 2R攜帶者組和2R非攜帶者組之間的差異為：與2R非攜帶者組相比，2R攜帶者組外側視覺網絡中右側顳枕葉（MNI峰值坐標：x=33，y=-69，z=12）的連接強度趨于增強（P=0.003），右側中央前回（x=51，y=3，z=45）的連接強度下降（P＜0.001），右側扣帶回前部（x=3，y=21，z=42）的連接強度趨于下降（P= 0.001）。2R攜帶者顯示內側視覺網絡中右側枕上回（x=21，y=-87，z=21）連接強度趨于增強（P=0.009），左側小腦上部（x=-27，y=-45，z=-21）的連接強度趨于下降（P=0.003），見圖1與表2。枕極視覺網絡中兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 DRD4 2R基因型攜帶者組與2R基因型非攜帶者組之間的視覺腦功能網絡連接差異

圖1 DRD4 2R基因型攜帶者組與2R基因型非攜帶者組之間的視覺功能網絡腦區(qū)差異（彩帶代表t值）

2.3 兩組顯著差異腦區(qū)（右側顳枕葉、枕上回）的功能連接強度與臨床量表的相關分析 在右側顳枕葉腦區(qū)，SNAP注意不集中評分與DRD4 2R攜帶者的功能連接強度呈正相關（r=0.339，P=0.037），與2R非攜帶者呈負相關（r=-0.308，P=0.016）。在右側顳枕葉腦區(qū)，視覺注意商數（r=-0.258，P=0.043）、視覺控制商數（r=-0.251，P=0.049）、綜合注意力商數（r=-0.262，P=0.040）與2R非攜帶者的功能連接強度均呈負相關，與2R攜帶者的功能連接強度呈無相關。在右側枕上回腦區(qū)，與以上量表值的相關性均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究發(fā)現，2R攜帶者較2R非攜帶者組ADHD患兒視覺相關腦區(qū)（右側顳枕葉、楔葉、枕葉上部）的功能連接強度趨于增高，可能與視覺感覺輸入的敏感性增加有關，與遺傳相關的脆弱性增強有 關[14]。最新全腦分析研究發(fā)現ADHD患兒早期視覺皮層腦區(qū)（距狀回、楔葉、舌回、枕葉上部）較正常兒童平均功能連接強度更高[16]。早期視覺皮層區(qū)域的連接強度增高可能與以下情況一致：ADHD患兒受到環(huán)境中視覺刺激的強烈影響，并被鎖定在這些刺激中，不是很容易關注非感官任務，如持續(xù)的表演任務。神經生物學方法研究也發(fā)現使用高屏幕（電視、手機、電腦和電腦游戲）的青少年往往有較高的注意力缺陷風險評分。

本研究同時發(fā)現2R攜帶者較2R非攜帶者視覺網絡右側中央前回的連接程度下降，右側扣帶回前部的連接程度趨于下降。有研究也發(fā)現類似結果：視覺工作記憶任務狀態(tài)下，ADHD患兒右側中央前回、兩側扣帶回前部激活減弱[17]；右側扣帶回白質纖維束的微觀結構變化與患兒該功能下降也密切相關[18]。 視覺過程是一個復雜且精心設計的過程，不僅包括初級視覺皮層及顳枕部視覺協(xié)助皮層，也包括與其他網絡之間的協(xié)調。扣帶回參與多種處理過程，包括注意過程，與許多大腦區(qū)域有聯(lián)系，可以彼此獨立地動態(tài)活動[16]。以往薈萃分析顯示ADHD患兒與注意力功能相關的腦網絡表現出低激活[19]，本課題組之前的研究也發(fā)現視覺網絡與額頂葉網絡間的腦白質網絡出現連接性降低[20]。

多動沖動癥狀隨著年齡的增加可得到一定的控制，但注意缺陷癥狀更加隱匿，可持續(xù)至成年。ADHD的動物模型之一，即DRD4基因敲除小鼠，對可卡因和甲基苯丙胺的反應增強，表現出局部運動行為的增加，但注意缺陷癥狀的評估，在患病人群樣本上更易實現。近年研究發(fā)現視覺網絡在注意缺陷亞型的患者中變化更為顯著[21]，多動癥兒童視覺皮層腦區(qū)的功能連接性增加[22]，被認為與ADHD患者的注意力缺陷相關[23]。ADHD有效的治療藥物哌甲酯可改善臨床癥狀，可顯著減少ADHD患兒視皮層區(qū)域的局部腦血流量[23]。本研究發(fā)現，外側視覺網絡中2R攜帶者的右側顳枕葉腦區(qū)功能連接強度與SNAP注意不集中評分呈正相關，2R非攜帶者呈負相關；2R非攜帶者右側顳枕葉腦區(qū)功能連接強度與視覺注意商數、視覺控制商數、綜合注意力商數呈負相關；支持以往的研究成果[17-18，24]。而內側視覺網絡的顯著差異腦區(qū)（枕上回）尚未發(fā)現相關性，提示外側視覺網絡對該癥狀的貢獻更大。外側視覺網絡主要分布于顳枕部視覺協(xié)助皮層，協(xié)助早期視覺皮層網絡對信息的處理。右側顳枕葉腦區(qū)為神經發(fā)育障礙兒童面部識別的關鍵腦區(qū)[9]，也是視覺注意過程的關鍵節(jié)點，與注意缺陷癥狀嚴重程度相關，進一步提示2R基因型有更顯著的注意缺陷癥狀，與先前研究[25]一致。

本研究尚存在一定不足與局限。首先，只有ADHD患兒被招募在本研究中，這限制了進一步解釋本研究成果。將來的研究應采用病例對照研究方法來驗證DRD4 2R基因型對ADHD的作用，并且提供更多有價值的臨床聯(lián)系。其次，由于部分實驗結果未通過多重比較矯正，結果只代表有變化趨勢，因此結論應該謹慎。最后，盡管ADHD的表現形式和亞型分析之間可能存在著深刻的差異，但由于樣本量小和每組受試者數量不平衡，無法進行亞型分析。盡管如此，DRD4 2R基因型對ADHD患兒視覺網絡的初步分析可為進一步的深入研究提供基礎和依據。

綜上所述，ADHD是復雜的異質性疾病，DRD4 2R基因型可影響視覺網絡中右側中央前回、顳枕葉等腦區(qū)。2R攜帶者患兒的視覺網絡中右側顳枕葉腦區(qū)功能連接增強，且與SNAP注意不集中評分呈正相關，而顯示出更顯著的注意缺陷癥狀。這一研究發(fā)現擴展了對ADHD神經病理機制的現有理解，從基因-腦-行為的研究過程探討ADHD的視覺功能神經網絡，發(fā)現2R攜帶者的視覺網絡變化模式可能是注意力缺陷的神經病理基礎之一。