王平，孟立平，劉龍斌，彭放

1.紹興市人民醫(yī)院（浙江大學(xué)紹興醫(yī)院） 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000；2.紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院（紹興市立醫(yī)院） 心內(nèi)科，浙江 紹興 312000

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease, CHD）的發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)。近年冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention, PCI）飛速發(fā)展，但即便是最新型支架的出現(xiàn)也并未從根本上解決冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis, ISR）的問(wèn)題，在PCI患者中ISR總的發(fā)病率仍達(dá)3%～20%[1]。

紫杉醇可以通過(guò)抑制細(xì)胞有絲分裂和觸發(fā)細(xì)胞凋亡有效阻止細(xì)胞的增殖，被廣泛應(yīng)用在腫瘤治療領(lǐng)域。由于紫杉醇可以抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，有效抑制ISR的進(jìn)展，近年來(lái)也被應(yīng)用于冠脈內(nèi)支架涂層。盡管紫杉醇藥物涂層支架被推廣使用，臨床醫(yī)師發(fā)現(xiàn)ISR的問(wèn)題仍然存在。PCI術(shù)后支架表面快速的內(nèi)膜化是減少急性和慢性IRS的關(guān)鍵[2]。隨著藥物涂層支架的不斷推廣，越來(lái)越多的學(xué)者注意到藥物涂層對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是引起ISR的一個(gè)重要因素。過(guò)去WANG等[3]的研究結(jié)果顯示紫杉醇減低血管內(nèi)皮細(xì)胞中血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，增加了支架術(shù)后血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。ZAMORA等[4]的研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的自噬，并最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的死亡。

細(xì)胞焦亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的伴隨炎癥反應(yīng)的一種新型的程序性細(xì)胞死亡方式，在形態(tài)和病理生理機(jī)制方面都區(qū)別于凋亡和壞死，是機(jī)體一種重要的先天炎癥免疫反應(yīng)，廣泛參與到感染性疾病、心血管疾病，以及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中[5]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，并進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells, EPCs）來(lái)源的外泌體可以抑制紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。

1 材料和方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)中采用的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞系（HUVEC-12細(xì)胞）購(gòu)自上海博湖細(xì)胞公司。胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；鈣黃綠素乙酰甲酯（Calcein-AM）購(gòu)自杭州浩鑫生物公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑購(gòu)自大連TaKaRa公司；CD34、CD44、CD90、VEGFR2、NLRP-3、IL-18、GSDMD-N抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcom公司，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）相關(guān)試劑購(gòu)自南通碧云天生物科技公司。

1.2 外泌體的提取與鑒定

1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）原代培養(yǎng)方法：選用4周齡Wistar雄性大鼠，麻醉處死，腹部皮膚消毒，分離后肢的雙側(cè)脛骨及股骨，剔除周邊的肌肉、肌腱及結(jié)締組織，無(wú)菌條件下剪去兩端的骨骺端，充分暴露骨髓腔，以5 mL注射器吸取LG-DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔至變白。收集骨髓懸液置于15 mL 離心管，低速離心1 000 r/min×5 min，棄上清液，以5 mL新鮮含20%胎牛血清的LG-DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度以1×106個(gè)/mL進(jìn)行接種，然后轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶，并置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞，之后 每3天換液1次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.2 EPCs原代培養(yǎng)方法：選用4周齡Wistar雄性大鼠，麻醉處死，腹部皮膚消毒，分離后肢的雙側(cè)脛骨及股骨，剔除周邊的肌肉、肌腱及結(jié)締組織，無(wú)菌條件下剪去兩端的骨骺端，充分暴露骨髓腔，以5 mL 注射器吸取PBS反復(fù)沖洗骨髓腔至變白。收集骨髓懸液置于15 mL離心管，低速離心1 000 r/min× 5 min，棄上清液，加入EGM-2-MV重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度以1×106個(gè)/mL進(jìn)行接種，然后轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶，并置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2 d后棄去未貼壁的細(xì)胞，換入新的培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)已貼壁的細(xì)胞，之后3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.3 EPCs分泌的外泌體（EPCs-Exo）與BMSCs分泌的外泌體（BMSCs-Exo）的提取與鑒定：光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光染色觀察細(xì)胞表面CD44、CD99、CD34及VEGFR-2的表達(dá)完成對(duì)BMSCs和ECPs的鑒定。收集BMSCs和EPCs的無(wú)血清培養(yǎng)基上清液，200×g，2 000×g和10 000×g差速離心法離心細(xì)胞上清液，再在110 000×g離心2 h，洗滌2次沉淀物用PBS重懸。外泌體的定量和濃度檢測(cè)由杭州聯(lián)川生物公司完成，是根據(jù)外泌體的粒徑分析得出外泌體的濃度為BMSCs 8.57×108Particles/mL，EPCs 2.85×109Particles/mL。BCA protein assay kit 測(cè)定外泌體蛋白濃度及RNA分析。透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外泌體特征性標(biāo)志物CD63和CD9的表達(dá)。

1.3 分組 HUVEC-12細(xì)胞分為對(duì)照組（使用普通培養(yǎng)基），紫杉醇組（使用5 nmol/L紫杉醇干預(yù)），紫杉醇+EPCs-Exo組（使用5 nmol/L紫杉醇+EPCs-Exo干預(yù)），紫杉醇+BMSCs-Exo組（使用5 nmol/L紫杉醇+ BMSCs-Exo干預(yù)）。

1.4 電鏡觀察外泌體形態(tài)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 將所提取的外泌體或者經(jīng)藥物干預(yù)后的細(xì)胞先后經(jīng)2.5%戊二醛、1%鋨酸后固定，再經(jīng)脫水，環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋，制成60 nm超薄切片，經(jīng)鈾、鉛雙重染色，在HITACH500透射電鏡（日本日立公司）下觀察血漿外泌體的形態(tài)及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 細(xì)胞免疫熒光觀察細(xì)胞表面CD44、CD99、CD34及VEGFR-2的表達(dá) 將細(xì)胞接種于96孔板，每孔3 000～5 000個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，先PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25% Triton×100穿破細(xì)胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋了250倍的一抗抗體，4 ℃過(guò)夜，PBST清洗3遍之后加入結(jié)合有FICT或者FRICT的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h后PBST清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后圖片用Iamge Pro Plus 6.0分析。

1.6 Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD9和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP-3、IL-18、GSDMD-N的表達(dá)情況 提取外泌體，加入500 μL蛋白裂解液離心去上清液，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。加樣，經(jīng)電泳蛋白分離和轉(zhuǎn)膜，于5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗孵育，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光，經(jīng)Quantity One進(jìn)行灰度測(cè)量分析。

1.7 測(cè)序分析及RT-qPCR檢測(cè)外泌體中LncRNA FGD5-AS1的表達(dá)水平 將提取的外泌體送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司檢測(cè)進(jìn)行非編碼RNA測(cè)序分析，得到表達(dá)差異的非編碼RNA。芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程按照美國(guó)Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行，包括制備文庫(kù)和測(cè)序?qū)嶒?yàn)。小RNA測(cè)序文庫(kù)制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（美國(guó)Illumina公司）試劑盒。文庫(kù)制備工作完成后，對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)使用Illumina Hiseq2000/2500進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為單端1×50 bp。

TRIzol法提取各組細(xì)胞中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。LncRNA FGD5-AS1引物上游：5’-AGAAGCGGAGGGGTGAAAAT-3’，下游：5’-CCGCCTTATAGTTGGCCCTC-3’；以U6作為內(nèi)參，引物上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，10 min，變性95 ℃，15 s，退火60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，結(jié)果以2-△△Ct方法分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS.20.0和GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析，兩兩比價(jià)采用LSD法。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs-Exo和EPCs-Exo的提取及鑒定 大鼠骨髓細(xì)胞中分離培養(yǎng)分化出BMSCs，經(jīng)CD90和CD44免疫熒光鑒定；從BMSCs分化出EPCs，經(jīng)CD34和VEGFR2免疫熒光鑒定（見(jiàn)圖1A）。采用超速離心法提取出外泌體，通過(guò)電子顯微鏡觀察外泌體的外形（見(jiàn)圖1B），并通過(guò)Western blot檢測(cè)了外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD9的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)提取的外泌體中CD63和CD9高表達(dá)，而細(xì)胞上清液中這兩種蛋白幾乎沒(méi)有表達(dá)（見(jiàn)圖1C）。

圖1 大鼠BMSCs和EPCs以及外泌體的成功提取和鑒定

2.2 EPCs-Exo抑制紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡 為了驗(yàn)證外泌體對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的影響，我們?cè)谟米仙即紭?gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞焦亡模型的基礎(chǔ)上，用所提取的外泌體干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞。BMSCs-Exo和EPCs-Exo都能成功地進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞膜，見(jiàn)圖2A。紫杉醇能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞變大變圓，細(xì)胞膜破裂，呈典型的細(xì)胞焦亡形態(tài)；而EPCs-Exo可以緩解紫杉醇的這一作用；BMSCs-Exo沒(méi)有這種緩解作用，見(jiàn)圖2B。Western blot結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，紫杉醇組細(xì)胞中NLRP-3、IL-18、GSDMD-N等細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；相比于紫杉醇組，紫杉醇+ EPCs-Exo組內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP-3、IL-18、GSDMD-N表達(dá)減少（P＜0.05）；紫杉醇組與紫杉醇+BMSCs-Exo組內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP-3、IL-18、GSDMD-N表達(dá)沒(méi)有明顯差異，見(jiàn)圖2C-D。電鏡結(jié)果顯示，紫杉醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)線粒體間距離增加，細(xì)胞內(nèi)纖維排列紊亂；而EPCs-Exo可以減少紫杉醇對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響，見(jiàn)圖3。

圖2 EPCs-Exo抑制紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡

圖3 電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.3 EPCs-Exo中富含LncRNA FGD5-AS1 基因芯片檢測(cè)BMSCs-Exo和EPCs-Exo中l(wèi)ncRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示包括lncRNA FGD5-AS1在內(nèi)的多種lncRNA在BMSCs-Exo和EPCs-Exo中表達(dá)差異明顯，見(jiàn)圖4。之后我們進(jìn)一步用RT-qPCR法驗(yàn)證基因芯片顯示有差異的lncRNA FGD5-AS1在兩組外泌體之間的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)lncRNA FGD5-AS1在EPCs-Exo中表達(dá)增加（P＜0.05），見(jiàn)圖5A。然后我們用RT-PCR法檢測(cè)經(jīng)BMSCs-Exo和EPCs-Exo干預(yù)過(guò)的細(xì)胞模型中l(wèi)ncRNA FGD5-AS1表達(dá)情況，經(jīng)EPCs-Exo干預(yù)過(guò)的內(nèi)皮細(xì)胞中，lncRNA FGD5-AS1都明顯高于其他組（P＜0.05），見(jiàn)圖5B。

圖4 基因芯片篩選出BMSCs-Exo和EPCs-Exo中差異的lncRNA的表達(dá)情況

圖5 LncRNA FGD5-AS1在EPCs-Exo中的表達(dá)

3 討論

本研究通過(guò)紫杉醇干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以誘導(dǎo)內(nèi)皮發(fā)生細(xì)胞焦亡。紫杉醇作為一種細(xì)胞毒性藥物，一方面可以通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移從而降低ISR的發(fā)生，但是，紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡可能是紫杉醇藥物涂層支架使用后ISR仍沒(méi)有得到最終解決的原因之一。在紫杉醇抑制平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)，如能有藥物保護(hù)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，將可以進(jìn)一步減少I(mǎi)SR的發(fā)生。

最近PARK等[6]的研究結(jié)果顯示，EPCs可以減少支架內(nèi)血栓的形成，并最終降低ISR的發(fā)生。HUANG等[7]通過(guò)在支架表層涂抹可以捕獲EPCs的細(xì)胞因子，也證實(shí)了EPCs可以降低ISR的發(fā)生率，但是遺憾的是上述研究都沒(méi)有涉及EPCs在ISR中發(fā)揮作用的具體機(jī)制。外泌體是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳遞的重要介質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)和非編碼RNA被包裹進(jìn)入外泌體中并向細(xì)胞外環(huán)境中釋放，進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。多項(xiàng)研究表明EPCs-Exo具有保護(hù)血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)心臟血管微循環(huán)，抑制心肌纖維化等作用[8-9]。BMSCs-Exo對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用也是近幾年研究的熱點(diǎn)。在本研究中分別用BMSCs-Exo和EPCs-Exo干預(yù)經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡模型，發(fā)現(xiàn)EPCs-Exo可以減少內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡，而B(niǎo)MSCs-Exo并無(wú)此作用。

為了進(jìn)一步探索EPCs-Exo抑制紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的具體機(jī)制，我們通過(guò)對(duì)BMSCs-Exo和EPC-Exo進(jìn)行高通量測(cè)序篩選，發(fā)現(xiàn)lncRNA FGD5-AS1在EPCs-Exo中的表達(dá)高于BMSCs-Exo，并通過(guò)RTPCR進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，提示FGD5-AS1對(duì)ISR可能具有一定的保護(hù)作用。目前關(guān)于FGD5-AS1的研究主要聚焦在腫瘤領(lǐng)域。FGD5-AS1可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-129-5p/HNRNPK軸，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞的增殖能力[10]。在腎癌患者中，F(xiàn)GD5-AS1通過(guò)于miR-5590-3p，激活細(xì)胞內(nèi)的ERK/AKT信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[11]。上述研究結(jié)果均提示FGD5-AS1可促進(jìn)細(xì)胞的增殖活性，基于此，我們推測(cè)EPCs-Exo可能是通過(guò)其中富含的FGD5-AS1發(fā)揮抑制紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的作用，我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證此假說(shuō)。

綜上所述，本研究首次提出紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡可能是藥物涂層支架ISR發(fā)生率仍無(wú)法有效控制的原因。本研究從大鼠骨髓中培養(yǎng)出EPCs和BMSCs，并分離提取出EPCs-Exo和BMSCs-Exo，發(fā)現(xiàn)EPCs-Exo可以抑制紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，而B(niǎo)MSCs-Exo并無(wú)此作用，并進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序及RT-PCR篩選出兩組外泌體之間lncRNA FGD5-AS1的表達(dá)存在差異。根據(jù)上述結(jié)果，我們推測(cè)EPCs-Exo可能是通過(guò)其中富含的lncRNA FGD5-AS1來(lái)抑制紫杉醇誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，從而降低藥物涂層支架內(nèi)ISR的發(fā)生率。