吳佩亮，陳馬云，王良興，黃曉穎

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015

肺動脈高壓（pulmonary hypertension, PH）是指肺動脈壓力異常升高導(dǎo)致的以不可逆右心室衰竭為特征的進(jìn)行性疾病[1]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一類長度大于200 nt并且不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA[2]。一種新的LncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）是一種真正的LncRNA，長度超過8 000 nt[3]，研究表明MALAT1可作為PH易感性的潛在指標(biāo)[4]。miRNAs在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)報(bào)道，miR-361-3p可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和干細(xì)胞性[5-6]。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡方面也發(fā)揮著重要的作用[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷（Baicalin）能抑制慢性低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，可能具有改善PH的作用。本研究通過建立低氧性肺動脈高壓（hypoxia induced pulmonary hypertension, HPH）模型和低氧肺動脈平滑肌細(xì)胞模型，探討黃芩苷是否通過LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β信號通路來調(diào)控PH的發(fā)生發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞 健康SPF級雄性C57BL/6小鼠18只，體質(zhì)量20～25 g，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，本研究通過動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)批準(zhǔn)。小鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞（murine pulmonary artery smooth muscle cells,MPASMCs）購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（美國ATCC），并在含有10%胎牛血清（美國Gibco公司）和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和造模：將18只C57BL/6小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成3組（每組6只）：常氧對照組（Normal）、慢性低氧性肺動脈高壓組（Hypoxia+Saline）、慢性低氧性肺動脈高壓+黃芩苷組（Hypoxia+Baicalin）。動物造模：將Normal組小鼠置于常壓常氧的SPF屏障中，Hypoxia+Saline組及Hypoxia+Baicalin組小鼠置于全自動常壓低氧大小鼠實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，在CO2、O2、濕度三合一監(jiān)測儀的控制下，最終使得箱體內(nèi)的O2濃度維持在10%±1%，CO2濃度維護(hù)在2%±1%，造模21 d；Hypoxia+Baicalin組小鼠每日入實(shí)驗(yàn)艙前腹腔注射60 mg/kg Baicalin；每日密切關(guān)注C57BL/6小鼠活動情況、飲食情況、精神狀態(tài)。將MPASMCs按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾S機(jī)分為：常氧對照組（Normal）、常氧+高劑量黃芩苷組（Normal+ 100 μmol/L Baicalin）、低氧組（Hypoxia）、低氧對照組（Hypoxia+Saline）、低氧+低劑量黃芩苷組（Hypoxia+50 μmol/L Baicalin）、低氧+高劑量黃芩苷組（Hypoxia+100 μmol/L Baicalin）。細(xì)胞造模：MPASMCs在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，持續(xù)注入92% N2+5% CO2+3% O2，并在37 ℃下持續(xù)培養(yǎng)48 h。對于Normal組，將MPASMCs置于常氧培養(yǎng)箱中，持續(xù)注入74% N2+5% CO2+21% O2，并在37 ℃下持續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 血流動力學(xué)指標(biāo)測定：腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（0.1 mL/20 g）麻醉C57BL/6小鼠，固定小鼠后分離右頸外靜脈，PE微導(dǎo)管插管至右心室，隨即用Powerlab生理信號記錄系統(tǒng)動態(tài)記錄小鼠右心室壓力（right ventricular systolic pressure, RVSP）。分離左頸總動脈，PE微導(dǎo)管插入小鼠左頸總動脈后記錄頸總動脈的壓力（mean carotid arterial pressure, mCAP）。

1.2.3 肺血管結(jié)構(gòu)重塑指標(biāo)及TGF-β、p-smad2、p-smad3測定：取小鼠右肺下葉放入4%多聚甲醛中固定48 h，肺組織常規(guī)石蠟包埋切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色及免疫組化染色。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析肺小動脈管壁直徑/管總直徑（wall thickness/total thickness, WT/TT）、肺小動脈管壁面積/管總面積（wall area/total area,WA/TA）、TGF-β、p-smad2、p-smad3的表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照（miR-NC）、miR-361-3p模擬物（miR-361-3p mimics）和miR-361-3p抑制劑（miR-361-3p inhibitor）購自廣州銳博生物公司。pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)載體（MALAT1 vector）、針對MALAT1的小干擾RNA（siRNA）和siRNA陰性對照（si-NC）購自上海吉瑪生物公司；轉(zhuǎn)染試劑使用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司）。

1.2.5 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）：使用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）分離出總RNA，使用高容cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific, USA）進(jìn)行cDNA合成。使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（大連Takara公 司）進(jìn)行PCR。使用GAPDH或U6對表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并通過2-ΔΔCt方法進(jìn)行量化。引物序列如下：TGF-β， F 5’-GGCCAGATCCTGTCCAAGC-3’、R 5’-GTGGGTTTCCAC CATTAGCAC-3’；MALAT1，F(xiàn) 5’-CAGCACATGACGGAGGTTG T-3’，R 5’-TCATCCAAATACTCCACACGC-3’；GAPDH，F(xiàn) 5’-AGTGGCAAAGTGGAGATT-3’，R 5’-GTGGAGTCATACTGGA ACA-3’；miR-361-3p，F(xiàn) 5’-CCCTCAGTGGCTCAGTAG-3’，R 5’-CCACCAGAGACCCAGTAG-3’；U6，F(xiàn) 5’-CTCGCTTCGG CAGCACA-3’，R 5’-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）法檢測MPASMCs的活力。MPASMCs（每孔5 000個細(xì)胞）接種在96孔板過夜，然后與10 μL CCK-8溶液（美國Thermo Fisher Scientific公司）在37 ℃每孔4 h。最后，每個孔在450 nm處的吸光度通過分光光度計(jì)（美國Bio-Rad公司）檢測。

1.2.7 傷口愈合實(shí)驗(yàn)測定：將MPASMCs置于6孔板上培養(yǎng)，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)到80%時，用移液管在細(xì)胞中劃出一條垂直劃痕。用PBS去除細(xì)胞碎片后，將細(xì)胞培養(yǎng)在新鮮的無血清中培養(yǎng)基24 h。拍照測量MPASMCs的遷移距離以量化細(xì)胞遷移率。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）分析 利用蛋白裂解液（上海碧云天公司）裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度，然后10% SDS PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。應(yīng)用TGF-β、p-smad2、p-smad3，cyclin B1、PCNA、Ki-67、MMP2和MMP9（武漢三鷹公司）進(jìn)行一抗孵育過夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min。室溫下加入熒光二抗抗體（美國Abcam公司）孵育 1.5 h，洗膜3次，每次10 min，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)選擇800通道進(jìn)行掃描條帶，以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化。

1.2.9 熒光素酶報(bào)告基因檢測：TGF-β mRNA 3’UTR或MALAT1結(jié)合序列的突變體（mutant）或野生型（wild）被克隆到熒光素酶報(bào)告基因中，建成pmiR-RB-報(bào)告載體[Promega（北京）公司]。之后，MPASMCs被共轉(zhuǎn)染到使用miR-361-3p模擬物或miRNC模擬物和相應(yīng)的熒光素酶報(bào)告基因。孵育48 h后，雙熒光素酶檢測試劑盒[Promega（北京）公司]用于分析熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對低氧誘導(dǎo)的MPASMCs增殖和遷移能力的影響 與Normal組比，Hypoxia組MPASMCs的增殖能力顯著增加（P＜0.05）；而經(jīng)黃芩苷干預(yù)后，Hypoxia組MPASMCs增殖能力顯著下降，其中Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組較Hypoxia+ 50 μmol/L Baicalin組的抑制作用更明顯（P＜0.05），見圖1A、圖1B。與Hypoxia組比，Hypoxia+ 50 μmol/L Baicalin組和Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs細(xì)胞的遷移能力顯著下降，其中100 μmol/L Baicalin組較50 μmol/L Baicalin組抑制作用更為明顯（P＜0.05），見圖1C、圖1D。與Hypoxia組比，Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中增殖標(biāo)志物cyclin B1、PCNA和Ki-67的蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），見圖1E。與Hypoxia組比，Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中細(xì)胞遷移標(biāo)志物MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)量顯著下降，見圖1F。

圖1 黃芩苷對低氧誘導(dǎo)的MPASMCs增殖和遷移能力的影響

2.2 黃芩苷對肺小動脈重構(gòu)、RVSP、mCAP的影響 HE染色結(jié)果提示與Normal組比，Hypoxia+Saline組小鼠肺組織中肺動脈中膜平滑肌細(xì)胞明顯增生，管腔明顯狹窄；Hypoxia+Baicalin組較Hypoxia+ Saline組肺動脈中膜平滑肌細(xì)胞增生減少，管腔狹窄減輕，見圖2A。與Normal組比，Hypoxia+Saline組小鼠WA/TA、WT/TT和RVSP顯著升高（P＜0.01）；與Hypoxia+Saline組比，Hypoxia+Baicalin組WA/TA、WT/TT和RVSP顯著下降（P＜0.05），見圖2B、圖2C、圖2D。但Normal、Hypoxia+Saline、Hypoxia+Baicalin三組間mCAP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2E。

圖2 黃芩苷對HPH模型小鼠肺病理組織學(xué)以及血流動力學(xué)的影響

2.3 黃芩苷抑制TGF-β信號通路激活 與Normal組比，Hypoxia組MPASMCs中TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與Hypoxia組比，Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見圖3A。與Hypoxia+Saline組比，Hypoxia+Baicalin組小鼠肺動脈內(nèi)TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達(dá)表達(dá)顯著下降（P＜0.05），見圖3B。

圖3 黃芩苷對TGF-β信號通路的影響

2.4 黃芩苷調(diào)控LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸 基于GEO數(shù)據(jù)庫分析了COPD和健康對照人群中差異表達(dá)的miRNA（GSE38974），并利用在線預(yù)測工具（Starbase和miRanda）篩選出能夠靶向TGF-β的miRNA，對上述集合取交集后篩選出候選基因miR-361-3p，見圖4A、圖4B、圖4C。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，與mutant組比，wild組miR-361-3p熒光活性明顯減弱（P＜0.05），見圖4D。MPASMCs細(xì)胞過表達(dá)miR-361-3p后，TGF-β mRNA表達(dá)水平顯著下降；而沉默miR-361-3p后，TGF-β mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖4E。提示miR-361-3p能夠靶向抑制TGF-β表達(dá)。生物信息預(yù)測提示MALAT1能夠靶向吸附miR-361-3p，見圖4F。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)MALAT1能夠抑制MPASMCs中miR-361-3p的表達(dá)（P＜0.05），見圖4G、圖4H。與Normal組比，Normal+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中miR-361-3p和MALAT1表達(dá)水平無明顯變化，而Hypoxia組MPASMCs中miR-361-3p表達(dá)顯著下降，MALAT1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與Hypoxia組比，Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中miR-361-3p表達(dá)顯著升高，MALAT1表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），見圖4I、圖4J。與Normal組比，Hypoxia+Saline組小鼠肺組織中miR-361-3p顯著下降，MALAT1表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與Hypoxia+Saline組比，Hypoxia+Baicalin組小鼠肺組織中miR-361-3p顯著升高，MALAT1表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），見圖4K、圖4L。

圖4 黃芩苷對LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸的調(diào)控

2.5 LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸的體外Western blot鑒定 與Normal組比，Hypoxia組MPASMCs中TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；而對MALAT1進(jìn)行干擾沉默后，TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達(dá)水平較Hypoxia組顯著下降（P＜0.05）；對miR-361-3p進(jìn)行過表達(dá)后，TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達(dá)水平較Hypoxia組顯著下降（P＜0.05），見圖5。

圖5 LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸對TGF-β信號通路的影響

3 討論

PH的特征是肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的異常增殖，最終導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，從而使患者肺血管阻力增加，右心衰竭致死亡[8]。近年來PH的治療取得了一定進(jìn)展，但肺移植依然是其最有效的治療選擇。目前臨床上已被批準(zhǔn)用于治療PH的藥物主要針對以下三個關(guān)鍵途徑：內(nèi)皮素途徑、前列環(huán)素途徑和一氧化氮/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶途徑[9]。這些藥物可以降低肺動脈的張力，從而在一定程度上改善患者的癥狀，但不能預(yù)防或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展[10]。

HPH模型是目前公認(rèn)的兼顧穩(wěn)定性且重復(fù)率較高的PH建模方式[11]。本研究中，小鼠經(jīng)低氧誘導(dǎo)后，肺組織及肺動脈壁產(chǎn)生明顯的病理變化，同時低氧組小鼠RVSP顯著增加，提示小鼠HPH建模成功。黃芩苷（7-葡萄糖醛酸，5，6-二羥基黃酮）是從黃芩中純化提取的類黃酮成分，目前已被廣泛用于治療各種疾病，如支氣管炎、腎炎、肝炎和哮喘[12-13]。 研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗氧化、抗血栓形成、抗腫瘤和抗增殖作用[14]。在心肌炎中，黃芩苷通過下調(diào)IL-6和TNF-α抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥[15]；在口腔炎癥中，黃芩苷通過抑制TNF-α、IL-6和核因子-κB的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[16]。 本研究中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黃芩苷可顯著抑制MPASMCs的增殖能力并且細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也顯著下降；同時黃芩苷還能夠顯著抑制MPASMCs的遷移和侵襲能力。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芩苷能夠改善HPH的肺動脈病理學(xué)變化，進(jìn)而減輕肺動脈結(jié)構(gòu)重塑。以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示黃芩苷能夠緩解HPH的發(fā)生發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，PH患者血漿中的TGF-β表達(dá)量高于正常健康人，PH患者平均肺動脈壓力的增高與TGF-β的血漿濃度水平成正相關(guān)[17]。另有研究表明，使用IN-1233可抑制TGF-β的表達(dá)，且能夠顯著抑制PASMCs的遷移作用，表明TGF-β信號通路可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞遷移，進(jìn)而參與了PH的發(fā)展進(jìn)程[18]。非編碼RNA在體內(nèi)表達(dá)豐富且靈敏高效，作為一類新的免疫調(diào)控因子參與了機(jī)體的固有免疫應(yīng)答和對炎性反應(yīng)的調(diào)控，一系列非編碼RNA已經(jīng)被證實(shí)參與PH的發(fā)病過程，研究發(fā)現(xiàn)對炎癥相關(guān)的非編碼RNA進(jìn)行靶向干預(yù)進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)可能是治療PH的有效手段[19]。本研究中我們利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選并基于實(shí)驗(yàn)證實(shí)了能夠靶向調(diào)控TGF-β的MALAT1/miR-361-3p/TGF-β信號調(diào)控軸。有研究發(fā)現(xiàn)miR-361-3p在PH患者中低表達(dá)，并且miR-361-3p能夠抑制PASMCs細(xì)胞的增殖，與本研究結(jié)果一致[20]。本研究表明MALAT1在低氧MPASMCs模型中顯著上調(diào)，并能夠通過靶向吸附miR-361-3p促進(jìn)TGF-β的表達(dá)。另有報(bào)道同樣也證實(shí)MALAT1能夠促進(jìn)PASMCs的增殖和遷移并抑制其凋亡[21]。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)黃芩苷能夠減輕HPH小鼠的肺動脈壓力，改善肺血管重塑，抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖。進(jìn)一步探究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠抑制LncRNA-MALAT1的表達(dá)水平，繼而通過ceRNA機(jī)制吸附miR-361-3p抑制TGF-β的表達(dá)，最終達(dá)到抑制HPH的發(fā)生發(fā)展。