卞宏生，岳驪酈，沙吾列西·木拉提別克，毛登烜，郭紅麗，黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學院藥學院，哈爾濱 150040)

隨著移動通信技術的進步，手機與我們的日常生活密不可分。手機在使用時會產(chǎn)生電磁波，一部分會被我們的身體吸收，從而形成手機輻射[1]。我國現(xiàn)行《電磁環(huán)境控制限制》(GB8702-2014)中對公眾照射限值進行規(guī)定，其中手機頻段限值是0.4 W·(m2)-1[1]。通過對大量文獻進行研究，發(fā)現(xiàn)手機輻射對神經(jīng)系統(tǒng)[2-6]、內(nèi)分泌系統(tǒng)[7-10]、生殖系統(tǒng)[11-12]有不同程度的損害，尤其影響人類睡眠，且存在性別差異和年齡差異[13-15]。

睡眠是一種適應個人需要并受到許多外部和內(nèi)部刺激影響的行為。除了具有適應性行為外，睡眠還可以在神經(jīng)元之間的突觸連接水平上調(diào)節(jié)大腦的可塑性，而神經(jīng)元的可塑性會影響睡眠[16]。對于睡眠研究的模式生物由線蟲到斑馬魚逐漸發(fā)展到大鼠[17]，近年來因為果蠅與哺乳動物具有很多相同的重要特征而作為睡眠研究的新寵[18]。

近年來將果蠅用于輻射研究涉及基因、細胞。2020年AYA等[19]研究2.45 GHz微波對果蠅的生理和行為影響，檢測到與微波輻射有關的遺傳毒性和行為變化，歸因于波的非熱效應，并且觀察到存在性別差異。PARK等[20]將果蠅照射后表皮為模型用于生物監(jiān)測，定量分析細胞形態(tài)。李志輝等[21]通過建立手機輻射剝奪果蠅睡眠模型，實時連續(xù)監(jiān)測果蠅在光照、RF[1 800 MHz，1 W·(m2)-1，12 h·d-1]及黑暗條件下的行為變化，對比分析各條件下果蠅運動和睡眠的異同。

刺五加具有益氣健脾、補腎安神的功效，能夠治療失眠、多夢、健忘癥等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)刺五加對睡眠節(jié)律有調(diào)節(jié)作用，在治療失眠、神經(jīng)衰弱等方面有顯著療效。研究發(fā)現(xiàn)刺五加中有多種成分均具有使患者提前入睡、增加睡眠時間和深度的功效[22]。刺五加對睡眠節(jié)律有調(diào)節(jié)作用，可減少24 h持續(xù)黑暗環(huán)境下果蠅的片段化睡眠[23]。芮施等[24]以小鼠為模式生物研究發(fā)現(xiàn)，刺五加鎮(zhèn)靜催眠作用機制為上調(diào)腦組織中5-羥色胺(5-HT)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)水平。刺五加可用于輻射研究，基于Nrf2-ARE通路對復方四物湯加味方中抗輻射的有效活性成分進行篩選，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷具有很好的活性作用[25]。以上研究為本實驗探究刺五加浸膏對手機輻射剝奪果蠅睡眠的干預作用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1實驗動物 野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)，由北京大學生命科學學院提供。

1.2實驗試劑與儀器 蔗糖(分析純，天津市化學試劑一廠，批號：20090410)；瓊脂(細菌學級，產(chǎn)地日本，批號：20090328)；丙酸 (分析純，天津市光復精細化工研究所，批號：20091008)；酵母粉(食品級，安琪酵母股份有限公司，批號：20181221)；玉米粉(食品級)；刺五加浸膏(刺五加苷B含量為0.546%，刺五加苷E含量為0.328%，由黑龍江中醫(yī)藥大學中藥藥理教研室提供)；二氧化碳(CO2)麻醉裝置(自制)；果蠅雌雄分離裝置(自制)；果蠅活動監(jiān)測系統(tǒng)(drosophila activity monitor system，DAMS)(版本v3.03，Trikinetics Inc.Waltham，MA，USA)。

1.3實驗環(huán)境 空白對照組：采用自動定時光控系統(tǒng)對果蠅生活環(huán)境實行每天12 h ：12 h明暗光照周期處理，光照強度為400 lx，溫度(24±1) ℃，相對濕度50%～60%。模型對照組和給藥組：根據(jù)實驗室前期預實驗結果，對果蠅生活環(huán)境實行手機輻射干預，輻射量：30～190 μW·(cm2)-1，干預點：20：00—22：00，每30 min撥打電話10 min。注意在睡眠剝奪造模時，手機靜音、息屏，且排除光刺激及聲音刺激等影響，單純?yōu)榇艌鲚椛涓深A。其余條件同空白對照組。

1.4實驗分組 以7日齡野生型Canton S品系黑腹果蠅作為觀察對象。收集8 h內(nèi)羽化未交配的果蠅，CO2輕微麻醉后區(qū)分雌、雄，隨機分為空白對照組、模型對照組，低、中、高濃度給藥組，每組32只。將新生果蠅置于相應環(huán)境中飼養(yǎng)，待用。

1.5實驗方法

1.5.1果蠅培養(yǎng)基的制備 ①基礎培養(yǎng)基制備。將玉米粉42 g與三級水160 mL充分攪拌混勻，配成A溶液備用。將蔗糖31 g、瓊脂3 g和三級水300 mL充分攪拌、混勻，加熱煮沸至瓊脂完全融化，將上述A溶液緩慢加入，并不斷攪拌，煮沸至糊狀后停止加熱。待溫度降至約70 ℃，加入酵母粉3 g，充分攪拌，接著加入丙酸3 mL，并快速攪拌均勻，趁熱立即分裝于潔凈的培養(yǎng)基管中(培養(yǎng)基若不慎附于管壁上，應舍去重新分裝)，厚度約2 cm，待培養(yǎng)基完全凝固后，將培養(yǎng)管倒置于操作室內(nèi)，靜置24 h后方可使用。②含藥培養(yǎng)基配制。準確稱取不同質量的刺五加浸膏，見表1，同法進行制備，浸膏與酵母粉同時加入，充分攪拌使其均勻分散。

表1 不同濃度含藥培養(yǎng)基的配方Tab.1 Formulation of medicated medium with different concentrations

1.6果蠅飼養(yǎng)及監(jiān)測 ①空白對照組：果蠅給予基礎培養(yǎng)基飼養(yǎng)5 d，于第6天移入監(jiān)測管中，適應12 h。

輕微麻醉，用毛筆逐個裝入細小玻璃管(內(nèi)徑5 mm，長65 mm，一端內(nèi)裝入基礎培養(yǎng)基后用黑色小帽密封，另一端用棉球封住)。采用DAMS，在12 h ：12 h光照-黑暗交替條件下監(jiān)測果蠅早7 ：00至次日早7 ：00的睡眠。DAMS數(shù)據(jù)采集軟件每隔5 min自動記錄一次活動次數(shù)。若持續(xù)5 min以上活動次數(shù)記錄為零，即果蠅靜止時間持續(xù)>5 min時，就認為果蠅處于睡眠狀態(tài)，其他時間為果蠅處于覺醒時間[15]。②模型對照組：將手機置于監(jiān)測儀旁，以輻射量30～190 μW·(cm2)-1，20：00—22：00，每30 min撥打電話10 min(將手機置于距監(jiān)測儀1 cm處，使用電磁場輻射監(jiān)測儀對手機輻射進行測量，確保輻射量在穩(wěn)定范圍內(nèi))對果蠅進行干預，其余條件同空白對照組。③給藥組：果蠅給予含藥培養(yǎng)基。小管一端內(nèi)裝入的是含藥培養(yǎng)基。其余條件同模型對照組。

2 結果

2.1刺五加干預對果蠅睡眠-覺醒節(jié)律的影響 結果見圖1和圖2。通過圖1分析可知，空白對照組雄果蠅白天(7：00—19：00)和夜晚(19：00—7：00)較多處于睡眠狀態(tài)。與空白對照組比較，模型對照組果蠅白天(7：00—19：00)集中處于睡眠狀態(tài)，夜晚(20：00—22：00，圖中紅色框區(qū)域，藍框為空白對照組對照區(qū)域)期間因進行手機輻射干預，果蠅睡眠、覺醒出現(xiàn)交替性變化現(xiàn)象(片段化睡眠)，在干預結束后(22：10—7：00)，果蠅又恢復睡眠狀態(tài)，這一現(xiàn)象表明手機輻射對果蠅睡眠具有負性影響作用。與模型對照組比較，3個給藥組果蠅在輻射干預期間片段化睡眠減少，睡眠時長呈增長狀態(tài)，其中低濃度給藥組的睡眠-覺醒節(jié)律變化最為明顯，同時與空白對照組的節(jié)律分布也最為接近。圖2結果顯示，空白對照組雌果蠅白天(7：00—19：00)集中處于覺醒狀態(tài)，夜晚(19：00—7：00)集中處于睡眠狀態(tài)。與空白對照組比較，模型對照組果蠅，白天(7：00—19：00)集中處于覺醒狀態(tài)，夜晚(20：00—22：00，圖中紅色框區(qū)域，藍框為空白對照組對照區(qū)域)期間因進行手機輻射干預，果蠅睡眠、覺醒出現(xiàn)交替性變化現(xiàn)象(片段化睡眠)，在干預結束后(22：10—7：00)，果蠅又恢復睡眠狀態(tài)，這一現(xiàn)象表明手機輻射對果蠅睡眠具有負性影響作用。與模型對照組比較，給藥組果蠅在輻射干預期間片段化睡眠減少，睡眠時長呈增長狀態(tài)，其中高濃度給藥組睡眠-覺醒節(jié)律變化最為明顯，同時與空白對照組的節(jié)律分布也最為接近。

白色部分表示活動，黑色部分表示睡眠。圖1 刺五加干預后雄果蠅的睡眠-覺醒節(jié)律圖The white is activity, the black is sleep.Fig.1 Sleep wake rhythm of male Drosophila melanogaster after Acanthopanax senticosus intervention after Acanthopanax senticosus intervention

白色部分表示活動，黑色部分表示睡眠。圖2 刺五加干預后雌果蠅的睡眠-覺醒節(jié)律圖The white is activity, the black is sleep.Fig.2 Sleep wake rhythm of female Drosophila melanogaster after Acanthopanax senticosus intervention

2.2刺五加對手機輻射后的果蠅睡眠時間變化的影響研究 結果見表2。通過表2分析可知，與空白對照組比較，模型對照組雄、雌果蠅夜晚12 h內(nèi)睡眠時間減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明造模成功。與模型對照組比較，雄性低濃度給藥組白天、夜晚、全天睡眠時間明顯延長，均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，高濃度給藥組白天、全天睡眠時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)。與模型對照組比較，雌性中濃度給藥組白天睡眠時間明顯縮短，高濃度給藥組夜晚睡眠時間明顯延長，均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 刺五加干預對雄雌果蠅平均睡眠時間的影響Tab.2 Effect of Acanthopanax senticosus intervention on average sleep time of male and female Drosophila melanogaster

3 討論

本課題組自2014年起，結合實驗室前期研究基礎，一直進行黑龍江道地藥材刺五加與睡眠-覺醒節(jié)律的研究。先后利用果蠅模式生物，發(fā)現(xiàn)刺五加具有增加果蠅連續(xù)活動時間，減少片段化睡眠，影響睡眠節(jié)律的作用[23]；其主要成分刺五加總苷和刺五加苷B對果蠅睡眠時間、睡眠-覺醒節(jié)律和睡眠時間百分比的影響特征[27]。通過上述實驗結果，課題組初步得出“刺五加可能通過調(diào)節(jié)生物節(jié)律來改善果蠅的睡眠”。

生物鐘是調(diào)節(jié)大多數(shù)生物的許多行為和生理參數(shù)的先天計時機制。在現(xiàn)代生活中，高頻率使用手機對生物產(chǎn)生了巨大的壓力，因為電磁輻射通常會對包括生物節(jié)律在內(nèi)的生物系統(tǒng)造成不同程度的損害。研究表明持續(xù)暴露于低強度微波輻射可能會通過改變晝夜節(jié)律系統(tǒng)和DNA損傷速率對大腦功能產(chǎn)生不利影響[28]。不僅果蠅長時間暴露于手機信號電磁輻射可能會引起運動障礙[29]，而且生物體許多其他行為變量也會在暴露于射頻電磁場后發(fā)生變化[30-31]。手機輻射在一定程度上影響生物體的睡眠，而睡眠會影響整個動物界的神經(jīng)行為表現(xiàn)。因此，為了進一步驗證這一假說，課題組通過查閱文獻并結合當前人們普遍實際，在前期實驗基礎上，探討刺五加對手機輻射下的果蠅睡眠時長及節(jié)律特征。

果蠅睡眠-覺醒圖的應用是研究果蠅睡眠節(jié)律的主要分析方法[32]，也是本研究的特色和難點。動物的節(jié)律研究往往存在數(shù)據(jù)量龐大、不易統(tǒng)計分析、難以發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)規(guī)律等問題。為了解決這些問題，課題組結合國外研究方法，并通過前期研究從硬件參數(shù)的精確設置和軟件自主編程兩個方面進行優(yōu)化，構成本實驗的特色技術。從而解決果蠅睡眠監(jiān)測的大數(shù)據(jù)的分析問題，保障本項目的順利實施。①在硬件方面。DAMS是支持項目順利實施的關鍵儀器之一。該儀器是在不損傷果蠅的前提下，通過果蠅撞擊紅外光束IR，判斷果蠅活動次數(shù)。DAMS系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集軟件每隔5 min自動記錄一次活動次數(shù)。每天累計采集288個數(shù)據(jù)。若持續(xù)>5 min活動次數(shù)記錄為零，即果蠅靜止時間持續(xù)>5 min時，就認為果蠅處于睡眠狀態(tài)。②在軟件方法。應用Visual Basic語言編程繪制睡眠-覺醒節(jié)律圖，是支持項目順利實施的第二個關鍵技術。該節(jié)律圖是通過將果蠅活動數(shù)值數(shù)字化得到的，在區(qū)分活動數(shù)值0或非0的基礎上繪制每一個點，提供一個確定睡眠-覺醒相位的簡易方法。其統(tǒng)計方法具有效率高、誤差小、不易出錯等優(yōu)點，對睡眠-覺醒節(jié)律的深入研究具有一定的參考價值，方便進行大數(shù)據(jù)的整體定性分析。

基于此，本研究初步從果蠅睡眠-覺醒節(jié)律和睡眠時間，定性和定量兩個方面分析刺五加干預后果蠅在手機輻射下的睡眠情況。定性的節(jié)律圖分析，可以從整體上了解果蠅睡眠-覺醒的大致分布情況，便于發(fā)現(xiàn)差異性規(guī)律，而定量的睡眠時間分析，可以找到這種差異性規(guī)律的統(tǒng)計學意義。

通過果蠅睡眠-覺醒圖和平均睡眠時間的定性定量分析發(fā)現(xiàn)：刺五加浸膏對手機輻射條件下果蠅的睡眠時間和睡眠-覺醒節(jié)律的負性影響具有正向干預作用，但雌雄果蠅的特征不同，其最佳劑量也不同。這可能是果蠅的性別差異決定的[24，33]。 刺五加通過減少輻射干預期間果蠅的片段化睡眠，增加睡眠時長，改善果蠅的睡眠-覺醒節(jié)律狀態(tài)。雄果蠅2%給藥劑量白天、夜晚、全天睡眠時間明顯延長，其睡眠-覺醒節(jié)律變化最為明顯，與空白對照組節(jié)律分布也最為接近；雌果蠅8%給藥劑量夜晚睡眠時間明顯延長，其睡眠-覺醒節(jié)律變化最為明顯，與空白對照組的節(jié)律分布也最為接近。此外，手機輻射對雌雄果蠅的干預表現(xiàn)基本相同。表現(xiàn)為：雌雄果蠅夜晚手機輻射干預期間(20：00—22：00)，果蠅睡眠、覺醒出現(xiàn)交替性變化現(xiàn)象(片段化睡眠)，在干預結束后(22：10—7：00)，果蠅又恢復睡眠狀態(tài)，這一現(xiàn)象表明手機輻射對果蠅睡眠具有負性影響作用。這一現(xiàn)象與文獻[34]報道基本一致。

通過實驗結果分析發(fā)現(xiàn)，雌雄果蠅的睡眠-覺醒特征和對刺五加干預的反映均不同。因此，在研究中應該考慮果蠅性別的差異性。作為一種模式生物，雌果蠅白天較多處于覺醒狀態(tài)，夜晚較多處于睡眠狀態(tài)的節(jié)律分布規(guī)律，與人類的行為更加吻合。因此，在手機輻射對果蠅干預作用基本相同的基礎上，筆者認為選擇雌果蠅作為此類研究的模式生物，人們對果蠅睡眠行為和藥物干預研究更便捷。另外，盡管4%給藥劑量雌果蠅的白天睡眠時間呈縮短趨勢，但從節(jié)律圖分析，其睡眠-覺醒節(jié)律的分布與其他組白天較多處于覺醒狀態(tài)，夜晚較多處于睡眠狀態(tài)的基本規(guī)律吻合，其進行手機輻射剝奪研究，更重要的是觀察夜晚手機輻射干預期間(20：00—22：00)的睡眠時間和節(jié)律變化，因此，其白天睡眠時間縮短的趨勢，不影響整體節(jié)律的分析。

此外，本研究有一定的局限性，首先，果蠅的節(jié)律也會受到自然、人為的環(huán)境影響。本研究在黑龍江省冬季進行，這個地區(qū)較其他地區(qū)更為寒冷，未來可以在一些氣候溫暖的地區(qū)實驗，來觀察結果是否有所不同。其次，在實驗中使用手機輻射，未來的研究應該采用其他種類的輻射，如電腦屏幕、WIFI、電磁爐、微波爐、信號基站、高壓變壓器等。第三，使用果蠅的數(shù)量較少，在以后的實驗中，可以采用大數(shù)據(jù)來觀察結果的重復性及有效性。第四，刺五加的不同功效與刺五加中不同成分密切相關，而此實驗中并沒有分開其成分進行探究，接下來會對其成分探索看其相關性。第五，本實驗的對象種類單一，后期實驗可以進行多物種實驗，從而增加其普遍性。