封雍婕，崔 娜，趙 鵬

(昆明理工大學 生命科學與科技學院，昆明 650500)

近年來，微藻產(chǎn)生的油脂和生物活性物質(zhì)受到國內(nèi)外研究者們的廣泛關(guān)注[1-2]。微藻油脂作為第三代生物柴油的原料，具有環(huán)境友好、可持續(xù)再生等優(yōu)點，但由于其產(chǎn)率低和微藻采收成本高，制約了微藻生物柴油的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[3]。微藻油脂積累能力受微藻菌株差異性影響較大，常見產(chǎn)油微藻如：Endogenouschlorellasp.培養(yǎng)后生物量為2.14 g/L，油脂含量為10.80%，油脂產(chǎn)率為21.60 mg/(L·d)[4]；ChlorellasorokinianaCY-1培養(yǎng)后生物量為1.68 g/L，油脂含量為15.07%，油脂產(chǎn)率為18.08 mg/(L·d)[5]；Scenedesmusobliquus培養(yǎng)后生物量為2.32 g/L，油脂含量為25.00%，油脂產(chǎn)率為41.37 mg/(L·d)[6]。因此，選擇合適的微藻菌株是提高微藻油脂積累能力的關(guān)鍵。

微藻因其在培養(yǎng)基中濃度低，體積小，細胞表面帶負電荷等原因，其采收成本高，占生物柴油生產(chǎn)總成本的20%～30%，嚴重制約了微藻生物柴油的商業(yè)化[7]。因此，選擇合適的采收方法，降低微藻的采收成本，是實現(xiàn)微藻生物柴油可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。目前，常見的微藻采收方法有離心法、過濾法、氣浮法等[8-9]。但這些方法都存在能耗高、步驟多、成本高等缺點。近年來，絮凝法開始運用于微藻采收。絮凝法有化學絮凝法、生物絮凝法和自發(fā)絮凝法[9-10]。添加化學絮凝劑(化學絮凝法)或生物絮凝劑(生物絮凝法)雖然能提高微藻采收效率，卻增加了工藝步驟和添加劑成本，并容易造成水體二次污染[11]。自發(fā)絮凝法是一種很好的微藻采收方法，在培養(yǎng)結(jié)束后，微藻細胞自發(fā)絮凝沉降，整個過程中無需添加任何外源添加劑，具有無毒、無二次化學污染、成本低等優(yōu)點[12]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞外聚合物(EPS)是影響微藻自發(fā)絮凝的關(guān)鍵因素之一[13]。EPS是一種由微生物分泌的胞外高分子聚合物，主要包括多糖和蛋白質(zhì)，可以改善細胞黏附力，促進絮凝物形成，對絮凝有積極作用。EPS可以分為可溶性EPS(S-EPS)，松散附著EPS(LB-EPS)和緊密黏附EPS(TB-EPS)3類[3]。各類EPS對微藻自發(fā)絮凝會產(chǎn)生不同程度的影響。

具有自發(fā)絮凝能力的微藻菌株有ScenedesmusobliquusAS-6-1、ChlorellavulgarisJSC-7、AnkistrodesmusfalcatusSAG202-9及EttliatexensisSAG79.80等[13-16]，但是這些菌株的油脂積累能力并不理想。因此，找尋同時具有自發(fā)絮凝能力與較高油脂積累能力的微藻菌株將有利于降低微藻油脂的生產(chǎn)成本。

目前，微藻油脂的研究對象主要集中在水生微藻，而對氣生微藻研究頗少。氣生微藻主要存在于樹木、巖石和土壤的表面[17]。研究表明，氣生微藻不僅能夠積累油脂，還能分泌大量的EPS來適應陸地生活[18]。氣生微藻的多樣性為找尋同時具有自發(fā)絮凝和高油脂積累能力的微藻菌株提供了可能。

微藻也是生物活性物質(zhì)的來源之一[17]。γ-氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白氨基酸，主要存在于動物、植物與微生物中，在微藻中鮮有報道[19]。GABA作為生物體的信號分子，調(diào)節(jié)多種生理信息，對多種精神疾病也有一定的療效，具有較高的藥用價值[20-21]。

本文對氣生微藻Heveochlorellasp. Yu的生物量、油脂含量、油脂產(chǎn)率、沉降率以及GABA含量進行檢測，旨在開發(fā)具有高油脂積累能力、細胞自發(fā)絮凝能力和生物活性物質(zhì)潛力的微藻，拓寬可為生物柴油生產(chǎn)提供油脂原料的微藻菌株資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

氣生微藻Heveochlorellasp. Yu(GenBank：MK829186)，由昆明理工大學生物煉制課題組提供。Tris-醋酸-磷酸鹽(TAP)培養(yǎng)基，pH調(diào)至7.0后121℃高溫滅菌20 min。實驗所用試劑均為分析純。

恒溫光照振蕩搖床，90plus PALS Zeta電位分析儀，冷凍干燥機，超低溫冰箱，高效液相色譜儀，高速冷凍離心機，Specord Plus分光光度儀，血細胞計數(shù)板，GC-MS分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 微藻的培養(yǎng)

將微藻接種到含有300 mL TAP培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，初始細胞濃度為4.00×106個/mL，于25℃、150 r/min恒溫搖床上進行培養(yǎng)。

1.2.2 生長曲線的繪制和生物量的測定

通過血細胞計數(shù)板對微藻細胞計數(shù)并繪制微藻的生長曲線。

將微藻培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，于13 000×g離心5 min，去除上清液后，用去離子水反復沖洗沉淀并離心，重復3次后得濕藻體，冷凍干燥后稱重，計算生物量(以每升培養(yǎng)基中所含干藻體的質(zhì)量表示)。

1.2.3 油脂的提取及油脂產(chǎn)率的測定

取1.2.2獲得的干藻體，采用Bligh & Dyer法[22]提取油脂，按式(1)、式(2)分別計算微藻油脂含量和油脂產(chǎn)率。

CL=mL/mA×100%

(1)

式中：CL為油脂含量；mL為提取油脂的質(zhì)量，mg；mA為干藻粉的質(zhì)量，mg。

PL=mACL/(VT)

(2)

式中：PL為油脂產(chǎn)率，mg/(L·d)；V為培養(yǎng)基體積，L；T為培養(yǎng)時間，d。

1.2.4 微藻油脂脂肪酸組成分析及相關(guān)指標測定

取100 mg微藻油脂，加入2 mL 3%硫酸-甲醇溶液，充分混合后，于70℃水浴中冷凝回流4 h，再加入2 mL正己烷，置于室溫且轉(zhuǎn)速為100 r/min的搖床上振蕩萃取4 h，靜置后取上清液(微藻油脂脂肪酸甲酯)用0.45 μm有機相濾膜過濾，進行GC-MS分析(分析條件見文獻[23])。采用面積歸一化法對脂肪酸進行定量。

微藻油脂脂肪酸甲酯的十六烷(CN)值和冷濾點(CFPP)等相關(guān)指標按照Ramos等[24]的方法進行測定。

1.2.5 微藻沉降率的測定

在自然條件下，將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的藻液移至英霍夫沉降管(Imhoff Cones)中，沉降2 h后，取藻液液面下5 cm的藻液樣于1 cm光程750 nm波長下進行比色，按式(3)計算沉降率(η)。

η=(Da-Db)/Da×100%

(3)

式中：Da為開始沉降時藻液的光密度；Db為沉降2 h時藻液的光密度。

1.2.6 不同類型EPS的去除

根據(jù)Zhao等[25]的方法去除EPS。藻液于2 500×g離心15 min，獲得的上清液為可溶性EPS(S-EPS)溶液。將沉淀(微藻細胞)重新懸浮在0.05%的氯化鈉溶液中，于6 000×g離心15 min，獲得的上清液為松散附著EPS(LB-EPS)溶液。然后，將沉淀重復懸浮過程，在磁力攪拌器混合攪拌30 min后，于11 000×g離心20 min，得到的上清液為緊密黏附EPS(TB-EPS)溶液。每步的沉淀用蒸餾水重懸測定微藻沉降率，可得到不同類型EPS對微藻沉降的影響。

1.2.7Zeta電位的測定[3]

采用Zeta電位分析儀測定微藻液的Zeta電位。

1.2.8 GABA含量的測定

采用高效液相色譜(HPLC)法測定微藻中的GABA含量[26]。

2 結(jié)果與討論

2.1 微藻的油脂產(chǎn)率

微藻在不同的生長階段，積累油脂的能力有很大差異。大量實驗認為，微藻在穩(wěn)定期前期油脂積累能力較強[27]。按照1.2.1和1.2.2的方法繪制氣生微藻Heveochlorellasp. Yu的生長曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可見，氣生微藻Heveochlorellasp. Yu在第9天進入穩(wěn)定期。

圖1 Heveochlorella sp. Yu的生長曲線

按1.2.1方法將氣生微藻Heveochlorellasp. Yu培養(yǎng)9 d，測定其生物量和油脂產(chǎn)率，結(jié)果見表1。

表1 不同微藻的生物量、油脂含量以及油脂產(chǎn)率

由表1可見，Heveochlorellasp. Yu的生物量為4.14 g/L，油脂含量為39.43%。微藻的生物量和油脂含量并無關(guān)聯(lián)，且往往不是同步增加的，如：Aphanothece具有5.00 g/L的生物量，而油脂含量僅為8.00%[28]；Neochlorisoleabundans則具有56.00%的油脂含量，但生物量僅為0.09 g/L[29]。因此，將油脂產(chǎn)率作為衡量微藻油脂生產(chǎn)能力的綜合性指標已經(jīng)成為廣大科研者的共識。由表1還可看出，與其他研究相比，Heveochlorellasp. Yu顯示出較高的油脂產(chǎn)率(181.38 mg/(L·d))，具有較好的開發(fā)潛力。

2.2 微藻油脂脂肪酸組成

Heveochlorellasp. Yu油脂脂肪酸組成及含量見表2。

表2 Heveochlorella sp. Yu油脂脂肪酸組成及含量%

從表2可以看出，Heveochlorellasp. Yu油脂的主要脂肪酸是棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)，均為16～18個碳原子的脂肪酸，符合生產(chǎn)生物柴油的要求。十六烷(CN)值是評價生物柴油燃料性能和抗爆的指標，按照生物柴油標準《生物柴油調(diào)合燃料(B5)》(GB 25199—2017)規(guī)定B5普通柴油CN值不低于45。經(jīng)測定，Heveochlorellasp. Yu油脂脂肪酸甲酯的CN值為50.91，完全符合國家標準。冷凝點(CFPP)是衡量生物柴油低溫下防凍性能的重要指標，CFPP值越低，則生物柴油的低溫流動性越好，越利于運輸和儲存。根據(jù)所處的氣候環(huán)境不同，各國對CFPP值有不同的規(guī)定。經(jīng)測定，Heveochlorellasp. Yu油脂脂肪酸甲酯的CFPP值為-15.66℃，低溫流動性較好，能夠滿足絕大部分國家標準中的規(guī)定。

2.3 微藻沉降率

采用絮凝法采收微藻，可使水體大幅濃縮，為下一步采用成熟的采收技術(shù)如離心等創(chuàng)造了較好的條件，有利于降低采收成本。已有許多研究者對微藻的絮凝進行了大量研究，如：Tan等[33]報道Scenedesmusdimorphus的自然沉降率為40%，加入高嶺土絮凝劑后沉降率達到93%；Zhu等[34]在Chlorellavulgaris中加入250 mg/L殼聚糖后沉降率達到91.9%；Rahul等[35]在Botryococcussp.藻液中加入60 mg/L陽離子菊粉后沉降率為88.6%；Reyes等[36]向藻液中加入1 500 mg/L硫酸鐵后，Scenedesmusspinosus的沉降率達到了61.6%。添加絮凝劑，微藻的沉降率有了很大的提升，但增加了絮凝的工藝步驟、微藻采收成本及水體二次污染。Salim等[37]發(fā)現(xiàn)具有自發(fā)絮凝的微藻Ettliatexensis在3 h內(nèi)的自然沉降率可達到90%，但油脂含量僅有5.9%。實驗發(fā)現(xiàn)，Heveochlorellasp. Yu在2 h內(nèi)的自然沉降率為65.28%，隨著沉降時間的延長可達到90%以上(數(shù)據(jù)未列)。雖然Heveochlorellasp.Yu的自發(fā)絮凝能力相比Ettliatexensis略遜一籌，但其卻具有較高的油脂含量，能在降低采收成本的同時兼顧油脂積累，具有生物柴油原料的開發(fā)價值。

EPS與微藻的自發(fā)絮凝密切相關(guān)，微藻細胞可通過EPS連接聚集在一起形成細胞團塊，加速細胞的絮凝沉降[13，37]。為了進一步了解不同類型的EPS在微藻自發(fā)絮凝中的作用，在本實驗中依次去除各類型EPS，測定微藻細胞沉降率的變化，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見：去除S-EPS后，Heveochlorellasp.Yu的沉降率由65.28%下降為52.03%；進而去除LB-EPS后，沉降率下降為20.73%；最后去除TB-EPS后，沉降率下降為17.85%。S-EPS與微藻細胞結(jié)合較弱，往往溶于藻液中，因此對微藻細胞的黏附性影響不大。Pellicer-Nacher等[38]認為TB-EPS 較LB-EPS更具有黏連細胞的能力，有助于提高細胞絮凝能力。而本研究表明LB-EPS在微藻自發(fā)絮凝中起主要作用，可能是菌株差異所導致本研究中的LB-EPS具有特殊的多糖組分，尚需后續(xù)進一步的分析。

圖2 去除不同EPS后Heveochlorella sp.Yu的沉降率

微藻細胞表面帶有相同的電荷，會使細胞難以相互聚集，影響絮凝沉降。按1.2.1方法培養(yǎng)Heveochlorellasp.Yu 9 d，調(diào)節(jié)藻液pH后，測定藻液的Zeta電位和沉降率，結(jié)果如表3所示。

表3 pH對微藻Zeta電位和沉降率的影響

由表3可見，Heveochlorellasp.Yu自發(fā)絮凝時的Zeta電位為-10.00 mV，調(diào)節(jié)pH為3.42后，微藻細胞表面Zeta電位變?yōu)?5.00 mV，沉降率上升為72.89%，說明微藻細胞表面Zeta電位接近于零，有利于Heveochlorellasp.Yu的自發(fā)絮凝。

2.4 GABA含量

不同生物體GABA含量見表4。由表4可見：Heveochlorellasp. Yu的GABA含量為9.50 mg/g；Monoraphidiumsp. QLZ-3在自然培養(yǎng)情況下GABA含量可達到10.97 mg/g[38]；發(fā)芽的蠶豆在缺氧-NaCl脅迫培養(yǎng)4 d后，GABA的含量為6.92 mg/g[39]；Monoraphidiumsp. QLY-1在缺氮且添加茉莉酸和獨角金內(nèi)酯的條件下，GABA的含量為21.00 mg/g[40]；Haematococcuspluvialis通過兩階段培養(yǎng)和鹽脅迫的方法，達到38.57 mg/g的GABA含量[26]。GABA的含量差異較大，主要是由于物種和培養(yǎng)條件的不同所致。

3 結(jié) 論

將氣生微藻Heveochlorellasp. Yu培養(yǎng)后油脂產(chǎn)率可達181.38 mg/(L·d)，2 h自然沉降率為65.28%，且GABA含量為9.50 mg/g。Heveochlorellasp. Yu在具有較高油脂產(chǎn)率的同時又含有生物活性物質(zhì)GABA，且具有自發(fā)絮凝能力，可大幅濃縮水體，為后續(xù)的采收減低負荷，具有為生物柴油生產(chǎn)提供油脂原料的開發(fā)潛力。