付 杰，宋 倫，于旭光，宋廣軍，王 昆，劉 印，劉蘇萱

(1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院,遼寧省海洋生物資源與生態(tài)學重點實驗室,遼寧大連 116023; 2.大連海洋大學,遼寧大連 116023)

遼寧丹東鴨綠江口海域是菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的主要增養(yǎng)殖區(qū)，2020年貝類養(yǎng)殖面積為4.5萬hm2，產(chǎn)量為24萬t，占遼寧省菲律賓蛤仔總產(chǎn)量的20%、占全國的6%，對漁業(yè)碳匯貢獻較大[1-2]。但近兩年發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔出現(xiàn)肥滿度降低、生長周期延長、種質退化、病害增多和死亡率升高等現(xiàn)象，引起了養(yǎng)殖企業(yè)和科研工作者的關注[3]。初步分析，上述現(xiàn)象應為內因(種質退化)和外因(生態(tài)演變)共同作用。有學者發(fā)現(xiàn)，濾食性貝類對餌料微藻粒徑大小有攝食選擇性，而海洋微藻有小型化和甲藻化趨勢[4-6]。宋廣軍等[7]利用全粒級微藻生物量測算2012年鴨綠江口海域貝類養(yǎng)殖容量為春季1 480 g·m-2、夏季320 g·m-2、秋季1 100 g·m-2。張雪等[8]利用大粒級微藻(粒徑>10μm)生物量測算2019年黃海北部菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量為春季100 g·m-2、夏季34 g·m-2、秋季63 g·m-2，修正的養(yǎng)殖容量明顯偏低，同時研究發(fā)現(xiàn)，黃海北部海域微藻粒級偏小，春、夏、秋季大粒級微藻生物量占比分別為(39±10)%、(35±14)%、(38±11)%。餌料微藻供應能力春季最高，秋季次之，夏季最低。對于濾食性貝類，餌料基礎中實際被利用的那一部分即是供餌力，其對揭示貝類營養(yǎng)能量及免疫水平至關重要。而有效餌料微藻(大粒級藻類)的比例、總量及存在周期可反映濾食性貝類增養(yǎng)殖區(qū)的供餌力水平。

過往研究微藻粒級結構主要利用葉綠素a分級法對微藻生物量進行粗略區(qū)分[9-12]，由于大孔徑濾膜截留率較高導致小粒級微藻的貢獻被嚴重低估，而高估了大粒級微藻(粒徑>10μm)即有效餌料的貢獻，進而會使研究區(qū)內的貝類養(yǎng)殖容量被高估。隨著高通量測序-分子鑒定技術的發(fā)展，通過真核微藻分子鑒定獲取的序列數(shù)可極大提高小粒級微藻的檢出率，用于微藻全粒級結構的統(tǒng)計分析，可客觀表征有效餌料微藻生物量大小。本文采用該技術對鴨綠江口海域16個站位的微藻粒級結構進行了逐月研究，采用反距離權重插值模型進行了餌料微藻供餌力分布圖繪制，同時測算了該海域貝類養(yǎng)殖容量，以期對鴨綠江口菲律賓蛤仔可持續(xù)健康增養(yǎng)殖提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 研究海域與采樣站位

2020年，在丹東東港鴨綠江口海域垂岸布設16個站位(圖1)，于3—12月每個月采集1次海水過濾樣品，鑒定真核微藻種類、檢測葉綠素a含量。每個站位采集表層海水1 L，首先現(xiàn)場用200 μm篩絹過濾去除大型浮游生物，然后用0.22 μm微孔濾膜收集全部微藻，最后將濾膜轉移至1.5 mL無菌離心管中，置于-80 ℃冷凍保存、運輸，用于真核微藻分子鑒定，同期進行葉綠素a指標監(jiān)測。調查、檢測和質量控制方法均參照《海洋調查規(guī)范》(GB/T 12763—2007)[13]和《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378—2007)[14]執(zhí)行。

圖1 采樣站位示意

1.2 分析方法

1.2.1 餌料微藻分子鑒定

提取濾膜上真核微藻宏基因組18S rDNA，檢測18S rDNA濃度及純度，提取采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)，利用SEQ ID NO.1～2所述的核苷酸序列分別作為上游引物和下游引物，以提取的18S rDNA為模板，進行可變區(qū)V4的PCR(聚合酶鏈式反應)擴增，對于PCR擴增引物，構建DNA文庫，對于構建的文庫，使用Hiseq2500 PE250模式進行上機測序，測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、截取、過濾，得到可操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)，使用 Uparse 軟件(http://drive5.com/uparse/)對有效數(shù)據(jù)進行聚類和物種分類，采用樸素貝葉斯分類方法與數(shù)據(jù)庫(https://www.arb-silva.de/,Version 108)對OTUs代表序列進行物種注釋[15]，最終得到微藻注釋信息[2]。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

由于不同真核生物中rDNA的拷貝數(shù)差異較大，因此rDNA擴增子測序所獲的序列數(shù)并不能表征環(huán)境樣本中真核微藻的豐度[16-17]，但相關研究發(fā)現(xiàn)，rDNA序列多態(tài)性與細胞中rDNA的拷貝數(shù)成正比，而真核微藻細胞體積與rDNA的拷貝數(shù)成正比，因此，真核微藻分子鑒定獲取的序列數(shù)可表征其生物量大小，用于微藻全粒級結構研究是可行的[16-18]。將16個站位所獲得的優(yōu)勢度超過0.1%的種類均作為整體優(yōu)勢種參與粒級生物量比例統(tǒng)計，參照相關文獻將篩查出的優(yōu)勢種粒徑按微微型(<3 μm)、微型(3～20 μm)、小型(>20 μm)進行篩檢分級[16-22]，研究微藻粒級結構，同時由于大部分濾食性貝類對10 μm以上餌料微藻截留效率較高[6]，為研究微藻對貝類的供餌能力，再將優(yōu)勢種按粒徑大小劃分為2組，即大粒級(>10 μm)和小粒級(<10 μm)。根據(jù)各粒徑真核微藻序列數(shù)占比統(tǒng)計其粒級組成結構，同時利用其序列數(shù)占比和總葉綠素a含量測算某種粒級微藻的葉綠素a含量，計算公式[8]：

(1)

式(1)中，DBi為某粒徑微藻的葉綠素a濃度，單位：μg·L-1；NBi為總葉綠素a濃度，單位：μg·L-1；DC為某粒徑微藻的序列數(shù)；NC為所有微藻的序列數(shù)。

物種生物量優(yōu)勢度(Y)表示微藻群落中某一物種質量所占的優(yōu)勢程度[4]：

(2)

式(2)中，ni為第i種微藻種類的OTUs數(shù)，N為OTUs總數(shù)，fi為第i種微藻種類在各樣品中出現(xiàn)的頻率。

由于菲律賓蛤仔對大粒級餌料微藻攝食效率較高，根據(jù)供餌力含義，即有效餌料微藻供應能力，本文供餌力指數(shù)(Ai)專指大粒級微藻生物量與其占比乘積[8]：

Ai=Bi·Ci%

(3)

式(3)中，Bi為第i站位大粒級微藻生物量，Ci%為第i站位大粒級微藻占比。

根據(jù)PARSONS-TAKAHASHII營養(yǎng)動態(tài)模型對東港鴨綠江口海域菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量進行估算，利用海域初級生產(chǎn)者微藻的生產(chǎn)量和生態(tài)效率，估算菲律賓蛤仔的現(xiàn)存生物量[23]。

Q=(BEn)·k

(4)

式(4)中，Q為貝類的生物量；B為微藻的生物量；E為生態(tài)效率；n為貝類營養(yǎng)階層；k為貝類帶殼鮮質量與軟組織鮮質量比值。

1.2.3 插值方法

鴨綠江口海域月際及平均供餌力分布圖采用反距離權重(inverse distance weight,IDW)模型進行空間插值，即以16個站位供餌力指數(shù)的測算值推算未測海域供餌力指數(shù)，不同站位的供餌力指數(shù)對距它不同遠近的點影響大小不同，距離越近影響越大。而且IDW插值計算有高效、便捷等諸多優(yōu)點，常被用于生態(tài)環(huán)境評價中。供餌力指數(shù)插值計算結果僅跟周邊監(jiān)測點的樣本數(shù)據(jù)有關，插值過程中，還要顧及采樣數(shù)據(jù)的空間異質性。計算模型如下：

(5)

式(5)中，Z(x)為插值結果，待插值點的屬性值；zi為監(jiān)測站位供餌力指數(shù)；Di為監(jiān)測站位與待插值點之間的歐氏距離；n為冪指數(shù)；m為參與插值運算的監(jiān)測站位數(shù)。

對上述公式計算、數(shù)據(jù)分析、分布圖均通過WPS Office、SPSS 22.0、ArcGIS軟件完成。

2 結果與分析

2.1 微藻粒級結構

為了解鴨綠江口海域微藻粒徑結構分布規(guī)律，按照微藻粒級分級習慣，方便與之前和之后的研究結果進行對比，對微藻粒徑按微微型、微型、小型進行生物量占比分析(表1)，并用餅狀圖大小代表各站位微藻生物量(圖2)。微型微藻在春、夏季占優(yōu)勢，小型微藻在秋、冬季占優(yōu)勢，而微微型微藻只在春、夏季生物量較高，秋、冬季生物量極低。其中位于11號站位總生物量最多，微型微藻在各站位占比均較高。

圖2 鴨綠江口海域微藻粒級分布圖

表1 鴨綠江口各月份微藻粒級分布

2.2 貝類供餌力分布

由于濾食性貝類對大粒級微藻(>10 μm)利用率較高，通過對微藻粒徑重新劃分，發(fā)現(xiàn)大粒級微藻基本為微型微藻和小型微藻。鴨綠江口海域大粒級餌料微藻生物量春季占20%、夏季占29%、秋季占63%、冬季占56%，在秋、冬季占優(yōu)勢；小粒級微藻(<10 μm)生物量春季占80%、夏季占71%、秋季占37%、冬季占44%，在春、夏季占優(yōu)勢。每個月供餌力指數(shù)平均數(shù)的分布規(guī)律見圖3，根據(jù)數(shù)值分布供餌力指數(shù)可劃分3個級別，其中高供餌力組平均指數(shù)>6，中供餌力組平均指數(shù)在3～6，低供餌力組平均指數(shù)<3。春、秋季供餌力較高，分別在4月和10月形成2個高峰(圖4)。

圖3 鴨綠江口海域供餌力指數(shù)月際站位分布

圖4 鴨綠江口海域供餌力指數(shù)月際變化

鴨綠江口海域平均供餌力指數(shù)平面分布見圖5。各月份供餌力空間分布不盡相同，整體來看，鴨綠江口海域月際整體處于中供餌力水平，其中，10月供餌力最高，7月供餌力最低。

圖5 鴨綠江口海域平均供餌力指數(shù)分布圖

鴨綠江口海域供餌力指數(shù)與環(huán)境因子關聯(lián)性見圖6。在空間尺度上，鴨綠江口東側海域(1～6#站位)供餌力指數(shù)與葉綠素a、溶解氧、無機氮磷比正相關，與鹽度負相關；中部海域(7～10#站位)供餌力指數(shù)與葉綠素a、無機氮、硝酸鹽、總氮正相關，與鹽度負相關；西側海域(11～16#站位)供餌力指數(shù)與葉綠素a、無機氮磷比、無機氮、硝酸鹽、總氮正相關，與鹽度負相關。總體而言，空間尺度上，鴨綠江口海域供餌力指數(shù)與葉綠素a、無機氮磷比、無機氮、硝酸鹽、總氮正相關，與鹽度負相關(圖6-A)。

在時間序列上，各站位供餌力指數(shù)4、12月受環(huán)境因素影響最多，主要受總氮、總磷、COD、無機磷、硅酸鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、無機氮、有機氮、葉綠素a正向影響，受pH、溶解氧、無機氮磷比負向影響(圖6-B)。

圖6 供餌力指數(shù)與環(huán)境因子關聯(lián)(*P≤0.05，**P≤0.01)

2.3 貝類養(yǎng)殖容量估算

由于大部分濾食性貝類對10 μm以上餌料微藻截留效率較高[6,24-25]，參照PARSONS-TAKAHASHII營養(yǎng)動態(tài)模型[11]，利用10 μm以上粒級微藻生物量估算菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量。圖7顯示，鴨綠江口海域月際實際可承載菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量為41～338 g·m-2，平均為195 g·m-2。其中，春季為248 g·m-2、夏季為117 g·m-2、秋季為262 g·m-2、冬季為67 g·m-2，貝類養(yǎng)殖容量主要為春、秋季的貢獻。其中10月份最高，5月份次之。

圖7 基于大粒級微藻生物量估算的月際貝類養(yǎng)殖容量

3 討論

宋倫等[26]研究發(fā)現(xiàn)，2019年黃海北部鴨綠江口臨近海域(靠近10號站位)春季(5月)微型微藻生物量占比最大，秋季(10月)小型微藻生物量占比最大，本研究結果與其一致。但2019年夏季(8月)微微型微藻生物量占比最大，2020年則為微型微藻占比最大，出現(xiàn)差異的原因是優(yōu)勢種發(fā)生改變，2019年夏季鴨綠江口臨近海域(靠近10號站位)第一優(yōu)勢種為青綠藻(Mamiellagilva)，第二優(yōu)勢種為劇毒卡羅藻(Karlodiniumveneficum)。LIU等[30]研究發(fā)現(xiàn)，鴨綠江口海域菲律賓蛤仔主動選擇攝食微型微藻，避食微微型微藻，但秋、冬季對微微型微藻的選擇性指數(shù)相對春、夏季較高，對于微藻類群，菲律賓蛤仔避食硅藻、金藻、隱藻，主動選擇甲藻、綠藻。本研究區(qū)域劇毒卡羅藻(Karlodiniumveneficum)生物量較高，該種為微型甲藻，也是供餌力主要貢獻微藻，可能會影響貝類衛(wèi)生質量安全。劇毒卡羅藻是一種有毒甲藻，近年來在我國沿海海域已經(jīng)暴發(fā)過赤潮。營養(yǎng)鹽作為微藻生長的基礎，對鴨綠江口海域全年的優(yōu)勢種劇毒卡羅藻毒性也起調控作用，有研究發(fā)現(xiàn)，高濃度氮可刺激劇毒卡羅藻的毒性作用，隨著氮濃度的升高，毒力也逐漸增強[31-32]，本研究區(qū)域為菲律賓蛤仔的主要增養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖面積為4.5萬hm2，年產(chǎn)量為24萬t，占遼寧省菲律賓蛤仔總產(chǎn)量20%、占全國6%，貝類衛(wèi)生質量安全應引起重視[33-35]。

利用葉綠素a分級法研究發(fā)現(xiàn)[27]，2016年夏季(8月)鴨綠江口鄰近海域微藻以大粒級(小型)為主(55%)，小粒級(微微型)次之(28%)，中粒級(微型)最少(17%)，本文高通量測序-分子鑒定分級法研究結果與其差異較大。葉綠素a分級法由于大孔徑濾膜截留率較高導致小粒級微藻的貢獻被嚴重低估，SONG等[28]利用分子鑒定微藻粒級分級法和葉綠素a分級法對比結果顯示，同一種微藻在分級濾膜上均有檢出，在不同濾膜上截留率不同，不同種類在同一濾膜上截留率也有所差異，微微型浮游植物在20 μm和3 μm濾膜上的截留率均較高，在20 μm濾膜上最高截留86.2%，在3 μm濾膜上最高截留99.5%，分子鑒定分級法修正結果顯示，遼東灣四季微微型浮游植物占有絕對優(yōu)勢，其次是微型浮游植物，相反，粒徑較大的小型浮游植物總生物量貢獻率四季始終最低，葉綠素a分級法對微微型浮游植物的測算誤差春季最高達到(82±8)%。孫軍等[29]對顯微測量粒徑分析、葉綠素a分級、電子粒度分析儀這3種浮游植物粒級結構研究方法進行了分析比較，發(fā)現(xiàn)使用葉綠素a分級法、電子粒度分析儀法會低估小粒徑種類，20 μm孔徑的篩絹對微型浮游植物的截留率高達85.63%，顯微測量粒徑分析修正后<20 μm的浮游植物(微微型+微型)組分占82.27%，分子鑒定技術極大的提高了小粒級微藻檢出率，為微藻粒級研究提供了新思路。

影響供餌力指數(shù)的正相關環(huán)境因子主要為氮、磷、硅等營養(yǎng)元素，尤其是無機氮、磷影響更為顯著，而有機氮、磷影響相對較小，可能是無機氮、磷的輸入提高了大粒級微藻的占比和生物量[25-26]。當然，微藻供餌力指數(shù)可能還受浮游動物等上級食物網(wǎng)的下行控制影響[36]，今后需要應加強關注。

本文對該海域菲律賓蛤仔養(yǎng)殖容量評估結果低于之前的測算結果進行了評估[7]，主要是對用于評估的營養(yǎng)動態(tài)模型中微藻生物量參數(shù)進行了優(yōu)化，篩選了可被貝類利用的大粒級微藻生物量進行測算，使得貝類養(yǎng)殖容量測算結果偏低，但更加符合實際。另外，近些年也可能由于微藻粒級結構發(fā)生變化，粒級變小，導致實際的貝類養(yǎng)殖容量降低，另外，各營養(yǎng)級生物群落間相互影響等還需后續(xù)繼續(xù)研究[37-38]。