張 慧，董宏標(biāo)，孫彩云,3，陳 健，黃聰靈，李 勇，段亞飛，張家松

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北秦皇島，066000；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300；3.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306；4.陽(yáng)江市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣東陽(yáng)江 529500；5.珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，廣東珠海 519070)

尖吻鱸(Latescalcarifer)屬尖吻鱸科，尖吻鱸屬，又稱(chēng)金目鱸、盲鰽，主要分布于太平洋西部和印度洋海域，因其廣鹽性、生長(zhǎng)速度快、無(wú)肌間刺、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，深受養(yǎng)殖戶(hù)和消費(fèi)者的喜愛(ài)，是我國(guó)南方沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖對(duì)象之一[1-2]。隨著養(yǎng)殖集約化程度的不斷提高，生產(chǎn)上愈發(fā)追求低成本高產(chǎn)出，由此帶來(lái)的過(guò)度投餌、飼料能量過(guò)高或質(zhì)量下降以及水質(zhì)惡化等問(wèn)題，易導(dǎo)致魚(yú)體脂肪代謝障礙，造成脂肪過(guò)度累積，進(jìn)而影響肝臟功能，誘發(fā)代謝性疾病。本項(xiàng)目組前期在珠海市斗門(mén)區(qū)多家養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)抽檢尖吻鱸養(yǎng)殖成品魚(yú)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)樣品患有不同程度脂肪肝，比例高達(dá)90%以上。脂肪代謝障礙在養(yǎng)殖生產(chǎn)上表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、飼料系數(shù)升高、抗應(yīng)激能力下降，尤其高溫季節(jié)還會(huì)引起養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的大批死亡，給生產(chǎn)造成巨大的損失，嚴(yán)重制約尖吻鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。

當(dāng)飼料中脂肪被消化和水解后，循環(huán)脂蛋白和非酯化脂質(zhì)會(huì)通過(guò)脂蛋白受體、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等被肝細(xì)胞吸收和氧化[4-5]。而當(dāng)脂質(zhì)積累和脂質(zhì)消耗之間處于不平衡狀態(tài)時(shí)就會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)的過(guò)度沉積，加劇肝臟負(fù)荷與氧化損傷，影響機(jī)體肝臟功能。而營(yíng)養(yǎng)與代謝調(diào)控是改善養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)脂肪沉積的根本途徑[6]。目前，已有多種功能性添加劑被用于改善魚(yú)體脂質(zhì)代謝，常見(jiàn)的如中鏈脂肪酸(MCFAs)[7-9]，它是類(lèi)C8-C12的飽和脂肪酸，以辛酸(C8H16O2)、癸酸(C10H20O2)和月桂酸(C12H24O2)為代表，相較于長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFAs)碳鏈更短，更容易被腸道吸收，具有獨(dú)特的消化吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝途徑[10-11]。月桂酸單甘酯(glycerol monolaurate, GML)，又名十二酸單甘酯，主要從椰子油等天然植物提取，是一種中鏈脂肪酸酯[12]，GML安全性非常高且廉價(jià)，常用為食品添加劑。已有研究發(fā)現(xiàn)，GML飼喂對(duì)提高川藏黑豬(Susscrofadomesticus)、肉雞等禽畜生長(zhǎng)性能、消化能力和肌肉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)具有積極的作用[13-14]。此外，GML具有優(yōu)良的乳化性，可以促進(jìn)脂肪的消化吸收，進(jìn)而促進(jìn)肌肉脂肪酸含量的增加[15-16]。在水產(chǎn)動(dòng)物中，GML能促進(jìn)花鱸(Lateolabraxmaculatus)[17]、中華鱉(Pelodiscussinensis)[18]、大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)[19]等的營(yíng)養(yǎng)吸收，增加生長(zhǎng)速度，調(diào)控腸道健康，而其對(duì)魚(yú)類(lèi)肝臟功能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以尖吻鱸為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分析GML對(duì)其臟器系數(shù)、脂質(zhì)代謝與消化酶活性以及肝臟組織形態(tài)、抗氧化酶活性和血清生化指標(biāo)的影響，以期為GML在促進(jìn)魚(yú)類(lèi)脂質(zhì)代謝和肝臟代謝性疾病防治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

實(shí)驗(yàn)用GML獲贈(zèng)于廣東省脂類(lèi)科學(xué)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心?；A(chǔ)飼料為市售鱸魚(yú)配合飼料(珠海海龍生物飼料有限公司)。將GML溶于乙醇溶液和蒸餾水配置成母液，按每公斤飼料0 g、1 g、2 g和4 g的GML設(shè)為4個(gè)梯度，高壓噴壺均勻噴涂于飼料表面，經(jīng)自然風(fēng)干后，4℃冰箱中冷藏備用。

實(shí)驗(yàn)用尖吻鱸體質(zhì)量(442.727±54.423)g、體長(zhǎng)(28.438±1.493)cm，購(gòu)自廣東省珠海市某養(yǎng)殖場(chǎng)，共計(jì)200尾，水車(chē)運(yùn)輸至珠海德洋水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖基地，于室內(nèi)水泥池(4 m×2.5 m×1 m)暫養(yǎng)，暫養(yǎng)密度為20 尾·m-3。穩(wěn)定1周后，選取192尾體表無(wú)損傷、規(guī)格均勻尖吻鱸隨機(jī)分到16個(gè)水泥池(2 m×1.5 m×1 m)中。按0 g·kg-1(G0組、對(duì)照組)、1 g·kg-1(G1組)、2 g·kg-1(G2組)和4 g·kg-1(G4組)設(shè)置4個(gè)試驗(yàn)組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12尾魚(yú)，分別投喂對(duì)應(yīng)飼料。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行8周，每日8∶00和17∶00各飽食投喂一次，上午投喂前池底吸污一次，日換水20%。暫養(yǎng)和養(yǎng)殖期間水溫(28.00±0.22)℃，pH 7.8～8.2，溶解氧≥7.0 mg·L-1，鹽度1.0～1.5，自然光周期。

1.3 樣品采集

經(jīng)飼喂8周后取樣，取樣前停喂24 h，每個(gè)重復(fù)取1尾魚(yú)，合計(jì)每個(gè)處理組4尾魚(yú)。樣品魚(yú)經(jīng)200 mg·L-1MS-222浸泡麻醉后，測(cè)量魚(yú)體長(zhǎng)、體質(zhì)量，再經(jīng)1.5 mL無(wú)菌注射器尾靜脈取血，3 000 r·min-1離心10 min后收集血清，4℃保存，用于血清生化指標(biāo)分析，此后，于冰盤(pán)上剖離內(nèi)臟團(tuán)與沉積脂肪進(jìn)行稱(chēng)重，取部分肝臟組織用于組織形態(tài)學(xué)分析，取剩余部分肝臟和腸道組織置于2 mL離心管中，液氮速凍過(guò)夜后-80 ℃保存，用于相關(guān)酶學(xué)檢測(cè)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及方法

1.4.1 臟器系數(shù)

根據(jù)以下公式計(jì)算肝體比(hepatosomatic index, HSI)、臟體比(viscerosomatic index, VSI)、肥滿(mǎn)度(condition factor, CF)和腹脂率(intraperitoneal fat ratio, IPF)。

HSI(%)=Wh/W×100%

VSI(%)=Wv/W×100%

CF(%)=W/L3×100%

IPF(%)=Wi/W×100%

式(1)～式(4)中，W為魚(yú)體總質(zhì)量(g)；Wi為腹脂質(zhì)量(g)；Wh為肝臟質(zhì)量(g)；Wv為魚(yú)內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量(g)；L為體長(zhǎng)(cm)。

1.4.2 肝臟組織切片制備及觀察

肝臟組織切片的制作及測(cè)定參照區(qū)又君等[20]的方法進(jìn)行：取1/3新鮮肝臟，用0.86%的生理鹽水沖洗干凈后，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上。逐級(jí)脫水之后，按次序進(jìn)行透明、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)、HE染色、脫水、透明、中性樹(shù)脂等步驟。顯微鏡觀察肝臟切片，并進(jìn)行拍照。每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)選取5張400倍鏡下的組織切片，每張隨機(jī)選取5個(gè)視野通過(guò)圖像統(tǒng)計(jì)軟件Image-Pro Plus 6.0 統(tǒng)計(jì)肝細(xì)胞面積、密度和直徑。

1.4.3 肝臟抗氧化酶、脂質(zhì)代謝酶和腸道消化酶活性測(cè)定

酶學(xué)指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所相關(guān)試劑盒測(cè)定。分別稱(chēng)取肝臟和腸道組織樣品0.08～0.10 g，按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入預(yù)冷好的0.85%生理鹽水，冰浴勻漿，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行活性測(cè)定。其中，肝臟抗氧化酶測(cè)定總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)活性，脂質(zhì)代謝酶測(cè)定肝臟中脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)和總脂酶(LPL+HL)活性，腸道消化酶測(cè)量淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)和蛋白酶(PRS)活性。

1.4.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定

血清生化指標(biāo)分析血清中總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)等指標(biāo)。按照深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司商業(yè)試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，中國(guó))檢測(cè)方法，全自動(dòng)生化分析儀(BS200)檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示，運(yùn)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。數(shù)據(jù)間若存有顯著性差異，則采用Duncan’s法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加GML對(duì)尖吻鱸臟器系數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，添加GML組尖吻鱸VSI、HSI、CF、IPF均有所下降，且隨著添加量的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，其中G2組VSI、HSI、IPF均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

表1 飼料中添加GML對(duì)尖吻鱸臟器系數(shù)的影響

2.2 飼料中添加GML對(duì)尖吻鱸肝臟組織學(xué)形態(tài)的影響

與對(duì)照組肝細(xì)胞相比，各試驗(yàn)組肝細(xì)胞面積分別降低了10.70%、68.35%、60.13%，肝細(xì)胞直徑分別降低了27.60%、38.22%、6.91%，而肝細(xì)胞密度(單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù))則相反，分別增加了3.10%、13.92%、0.79%(P<0.05)(表2)。肝臟組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)(圖1)，各處理組肝細(xì)胞內(nèi)均有不同程度空泡化現(xiàn)象。對(duì)照組中細(xì)胞核發(fā)生明顯偏移，呈現(xiàn)出較多細(xì)胞透明空泡化的現(xiàn)象。添加GML組肝細(xì)胞雖仍存在空泡化現(xiàn)象，但空泡化現(xiàn)象得到緩解，其中G2組改善效果最為明顯。

表2 飼料中添加GML對(duì)尖吻鱸肝細(xì)胞密度、面積和直徑的影響

圖1 飼料中添加GML對(duì)尖吻鱸肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE，×400)

2.3 GML對(duì)尖吻鱸肝臟抗氧化能力的影響

拌喂GML后，各試驗(yàn)組肝臟中CAT、SOD的活性及GSH含量和T-AOC較對(duì)照組均有顯著上升(P<0.05)(圖2)，其中G2組最高，且隨著GML添加量的增加，呈先增加后下降的趨勢(shì)；相反的，對(duì)照組MDA濃度顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)，隨著GML添加劑量的提升MDA逐漸降低，但各試驗(yàn)組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.4 GML對(duì)尖吻鱸腸道消化酶活性的影響

腸道消化酶活性結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組腸道AMS、LPS和PRS活性均呈上升趨勢(shì)，其中G2組顯著高于其他組(P<0.05)。

圖3 飼料中添加GML對(duì)尖吻鱸腸道消化酶活性的影響

2.5 GML對(duì)尖吻鱸肝臟脂質(zhì)代謝酶活性的影響

肝臟脂質(zhì)代謝酶活性結(jié)果如圖4所示，飼料中添加GML后，尖吻鱸肝臟中LPL、HL和LPL+HL活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中G2組最高，且隨著GML添加量的增加，呈先增加后下降的趨勢(shì)。

圖4 飼料中添加GML對(duì)尖吻鱸脂質(zhì)代謝酶活性的影響

2.6 GML對(duì)尖吻鱸血清生化指標(biāo)的影響

如表3所示，對(duì)照組血清中TP、GLB、TG、TC、和LDL-C含量顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)，ALT活性則相反，而ALB、AST活性各處理組無(wú)顯著性差異。各試驗(yàn)組間，G2組HDL-C顯著高于其他組(P<0.05)，其他組別差異不顯著。

表3 飼料中添加GML對(duì)尖吻鱸血清生化指標(biāo)的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)脂質(zhì)代謝過(guò)程會(huì)受到多方面因素的影響，如養(yǎng)殖條件、養(yǎng)殖模式和飼料營(yíng)養(yǎng)水平等[23]。近幾年尖吻鱸高密度集約化養(yǎng)殖常發(fā)生代謝性疾病，養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)脂質(zhì)代謝過(guò)程受阻造成脂肪過(guò)度累積，進(jìn)而影響肝臟健康。而研究表明，通過(guò)拌喂中短鏈脂肪酸可以調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝機(jī)能，且在畜禽養(yǎng)殖中已有相關(guān)報(bào)道[10,14,21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼料中添加不同水平的GML可以顯著降低魚(yú)體VSI、HSI、IPF比率。臟器系數(shù)是反映機(jī)體臟器濕重與單位體質(zhì)量的比值，其數(shù)值變化從側(cè)面反映了臟器內(nèi)脂肪含量的變化，因此VSI、HSI、IPF數(shù)值的減少有利于緩解魚(yú)體內(nèi)脂肪堆積，改善魚(yú)體健康。已有研究也有類(lèi)似結(jié)果，如拌喂GML可降低蛋雞、肉雞和真鯛(Pagrusmajor)中VSI、CF的比率，減少體內(nèi)過(guò)剩的脂肪沉積[21,24-25]。

肝臟脂肪變性與沉積極易造成肝損傷與炎癥[4]。肝細(xì)胞會(huì)因細(xì)胞內(nèi)脂肪滴存在，導(dǎo)致細(xì)胞核發(fā)生偏移，進(jìn)而造成肝細(xì)胞腫脹，因此呈現(xiàn)出較多細(xì)胞透明空泡化的現(xiàn)象。肝臟組織形態(tài)學(xué)分析顯示，拌喂GML組中空泡化現(xiàn)象較對(duì)照組有明顯緩解。結(jié)合肝臟的脂質(zhì)代謝酶活性分析及血清肝功能相關(guān)指標(biāo)變化亦可表明，拌喂GML可改善肝臟功能。本研究表明，試驗(yàn)組肝臟脂質(zhì)代謝酶包括HL、LPL、HL+LPL活性均顯著高于對(duì)照組，血清中TG、TC、LDL-C低于對(duì)照組。普遍認(rèn)為，血清中TC和TG是機(jī)體儲(chǔ)存能量的主要形式，是反映機(jī)體脂質(zhì)代謝水平的重要指標(biāo)[26]。而LPS可以催化TG的水解，改善機(jī)體脂質(zhì)沉積[27]。LDL-C和HDL-C是肝臟中TC轉(zhuǎn)運(yùn)到其他組織的載體，其含量的變化可以反映機(jī)體脂質(zhì)代謝狀況[28]。脂肪酸合成酶(FAS)是機(jī)體脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶，是催化脂肪合成的最后一步，而LPL和HL可以分解TG，并水解為甘油及游離脂肪酸(FFA)，從腸道進(jìn)入肝臟后，無(wú)需肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)便可直接進(jìn)入細(xì)胞線粒體進(jìn)行β-氧化，進(jìn)而為機(jī)體提供能量[27]。因此LPL是TG分解FFA和甘油的限速酶，當(dāng)LPL活性升高時(shí)機(jī)體內(nèi)TG的含量會(huì)相應(yīng)的減少，而相應(yīng)的試驗(yàn)組中血清TG較對(duì)照組含量顯著減少。這些結(jié)果與對(duì)黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)[28]和小鼠(Musmusculus)[29]的研究結(jié)果一致。研究表明，黃顙魚(yú)飼料中添加富含GML的黑水虻(Hermetiaillucens)油脂后，肝臟中LPL mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，小鼠高脂飼料中添加GML顯著降低了血清中TG和TC的含量。這些結(jié)果都證明了GML作為一種新型生長(zhǎng)促進(jìn)劑提高飼料水平的潛力。原因可能是GML的添加可以有效地影響肝臟中中鏈脂肪酸的合成和代謝，導(dǎo)致肝臟中過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體(pparγ)和3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶(hmgcr)的基因表達(dá)水平顯著降低[30-31]。同時(shí)SHINOHARA等[32]發(fā)現(xiàn)，中鏈脂肪酸也可以通過(guò)促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的內(nèi)源性氧化，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，抑制肥胖。綜合各研究表明，飼料中添加GML可以有效地促進(jìn)脂肪酸氧化、調(diào)節(jié)TG平衡、緩解尖吻鱸肝細(xì)胞空泡化、抑制脂肪的堆積。GML可以顯著改善機(jī)體脂質(zhì)沉積，緩解肝臟損傷，但是具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍未完全明確，有待進(jìn)一步研究分析。

血清肝功能水平和肝臟抗氧化能力均反應(yīng)了魚(yú)體肝臟健康狀況[33]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組血清內(nèi)ALT活性顯著高于對(duì)照組，GLB含量變化則與之相反，而AST活性在各組之間無(wú)顯著性差異。ALT和AST是肝臟中重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，其會(huì)滲透入血液中，所以其活性的變化反映了機(jī)體的肝臟健康狀況[34]。GLB則是反映機(jī)體免疫水平高低的代表性指標(biāo)之一[35]。研究發(fā)現(xiàn)，拌喂GML 8周后，相對(duì)于對(duì)照組，G2組尖吻鱸肝臟的T-AOC、SOD、CAT的活性和GSH含量顯著提高，且MDA濃度明顯降低。T-AOC、SOD、CAT、MDA、GSH是抗氧化體系中酶體系的主要組成成分，其中SOD、CAT、GSH可以通過(guò)清除機(jī)體內(nèi)的自由基，保護(hù)重要的細(xì)胞大分子和細(xì)胞器免受氧化損傷的影響，維持魚(yú)體正常的新陳代謝過(guò)程。MDA作為過(guò)氧化脂質(zhì)經(jīng)過(guò)降解之后的產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞的組織有一定的損害作用，其含量的變化反映了機(jī)體的細(xì)胞損傷程度[36]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GML有改善肝臟損傷，提高抗氧化能力的作用。這一結(jié)果與孫彩云等[17]和劉夢(mèng)蕓等[21]的結(jié)果類(lèi)似，說(shuō)明GML可以有效地緩解魚(yú)體應(yīng)激狀態(tài)，減少肝組織損傷，提高尖吻鱸的抗炎能力。

除此之外，中鏈脂肪酸還可以改善魚(yú)體的消化能力[37]。最新研究表明，飼料中添加GML可以顯著提高斑馬魚(yú)腸道中LPS、AMS的活性，同時(shí)也有報(bào)道GML對(duì)肉雞的腸道健康有益，有利于其從日糧中吸收能量和營(yíng)養(yǎng)[37-39]。在本研究中，拌喂2 g·kg-1GML可顯著提高尖吻鱸腸道中AMS、LPS和PRS的活性，與上述結(jié)果相符。此外，在對(duì)大西洋鮭(Salmosalar)[40]、豬[41]和大鼠(Rattusnorvegicus)[42]等的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中添加中鏈脂肪酸和相應(yīng)的甘油時(shí)，也會(huì)使其消化率和營(yíng)養(yǎng)利用率提高。原因可能與中鏈脂肪酸被吸收后會(huì)刺激膽囊收縮素的產(chǎn)生有關(guān)，而膽囊收縮素正是位于胃腸組織中能夠引起脂肪酶和蛋白酶分泌的一種多肽激素[37]。GML作為中鏈脂肪酸單甘油酯，可以在酯鍵的保護(hù)下深入到胃腸內(nèi)部[43]，使得GML能有效促進(jìn)魚(yú)體腸道的消化功能。