任繼波，張永春，孫運(yùn)奇，蔡夢(mèng)云，高德艷，張紅*

(1. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院菏澤分院 山東省生物工程技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 菏澤 274000； 2. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 化學(xué)與化工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；3. 山東省葡萄研究院，山東 濟(jì)南 250100)

西瓜為葫蘆科植物西瓜Citrulluslanatus(Thunb.)Matsumu.et Nakai的果實(shí)，瓜呈圓形或橢圓形，瓤多汁而甜，呈濃紅、淡紅、黃或白色[1]。西瓜在我國南北皆有栽培，被稱為“瓜中之王”，其味甘多汁，清爽解渴，是消夏佳果。西瓜含有大量葡萄糖、蘋果酸、果糖、氨基酸、番茄素及豐富的維生素C、鉀鹽等20余種有益健康的物質(zhì)，不含脂肪和膽固醇，營養(yǎng)價(jià)值十分豐富[2](表1)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，西瓜甘淡性寒，能清熱解暑、止渴解煩，通利小便，《日用本草》就提到西瓜寬中下氣利小水，治四痢。西瓜中含有的番茄紅素是類胡蘿卜素中的一種，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以延緩衰老、美容養(yǎng)顏，對(duì)胃癌、皮膚癌、乳腺癌以及心腦血管疾病都具有一定的預(yù)防作用[3]。

表1 西瓜主要營養(yǎng)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Main nutrients and contents of watermelon

西瓜是一種季節(jié)性很強(qiáng)的水果，其產(chǎn)期集中、產(chǎn)量大，且存在不宜長(zhǎng)期儲(chǔ)存、瓜汁易氧化等問題[4]。用西瓜汁做成發(fā)酵酒飲料，不僅可以解決上述問題，而且可以很好地促進(jìn)西瓜深加工產(chǎn)業(yè)和種植業(yè)的發(fā)展，帶動(dòng)農(nóng)民生產(chǎn)的積極性[5]。本研究創(chuàng)新性地采用多菌種協(xié)同發(fā)酵工藝生產(chǎn)西瓜酒飲料，為西瓜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

新鮮西瓜(市售)；白砂糖(山東凌雪糖業(yè)進(jìn)出口有限公司)；Zymaflore X5釀酒酵母(法國Laffort公司)；DV10釀酒酵母(法國Lalvin公司)；Lactoenos SB3乳酸菌(法國Laffort公司，)、果膠酶(北京索萊寶科技有限公司，酶活30 U/mg)；食品級(jí)皂土(法國Laffort公司)、食品級(jí)蛋清粉(法國Laffort公司)、食品級(jí)維生素C(江蘇采薇生物科技有限公司)、食品級(jí)無水檸檬酸(濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司)、食品級(jí)焦亞硫酸鉀(淄博百大化工有限公司)。

1.1.2 儀器

L18-Y915S型榨汁機(jī)(九陽股份有限公司)；HHS-11-1型恒溫水浴鍋(常州諾基儀器有限公司)；HVS-1300超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；JC100型高壓滅菌鍋(山東德強(qiáng)電力工程有限公司)；PHSJ-5型pH計(jì)(上海雷磁儀器有限公司)；ICS445型電子天平(梅特勒-托利多精密儀器有限公司)；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱(常州諾基儀器有限公司)；DLSB-10/20型低溫冷卻液循環(huán)泵(鞏義予華儀器有限公司)；XZJL-20型板框式過濾機(jī)(新鄉(xiāng)新輕機(jī)械有限公司)；SY-1S型實(shí)驗(yàn)室膜過濾機(jī)(紹興海納膜技術(shù)有限公司)；GBJL-10L型發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生工生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司)；10 L儲(chǔ)酒罐、5 L冷凍罐(石家莊恒昌食品包裝機(jī)械有限公司)。

1.2 測(cè)定方法

本工藝生產(chǎn)的西瓜酒理化、微生物指標(biāo)參照國標(biāo)GB 2758—2012《發(fā)酵酒及其配制酒》[6]執(zhí)行。酒體理化指標(biāo)測(cè)定方法如下：

總糖的測(cè)定(以葡萄糖計(jì)，g/L)：按國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[7]執(zhí)行；

總酸的測(cè)定(以酒石酸計(jì)，g/L)：按GB/T 15038—2006執(zhí)行；

酒精度的測(cè)定(以酒精體積分?jǐn)?shù)計(jì)，%)：按GB/T 15038—2006執(zhí)行；

SO2濃度的測(cè)定(以質(zhì)量濃度計(jì)，mg/L)：按GB/T 15038—2006執(zhí)行。

西瓜酒感官品評(píng)參照國標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》[8]，具體方法見表2。

表2 西瓜酒感官評(píng)定方法Table 2 Sensory assessment of watermelon wine

1.3 試驗(yàn)工藝

西瓜酒制備工藝流程如圖1所示。

圖1 西瓜酒制備工藝流程圖Fig.1 Preparation process of watermelon wine

西瓜經(jīng)篩選、清洗、去皮、去籽后進(jìn)行壓榨得到西瓜汁，壓榨過程中添加維生素C、檸檬酸防氧化。西瓜汁經(jīng)酶解、過濾、滅菌后調(diào)整成分，接種Lalvin DV10、Zymaflore X5兩株菌種進(jìn)行主發(fā)酵。主發(fā)酵結(jié)束后加皂土澄清過濾，濾液接種Lactoenos SB3進(jìn)行二次發(fā)酵。二次發(fā)酵結(jié)束后加蛋清粉進(jìn)行二次下膠過濾，之后得到西瓜原酒。西瓜原酒經(jīng)陳釀、冷凍過濾后裝瓶，得到西瓜酒成品。

1.4 多菌株不同接種量的單因素試驗(yàn)

西瓜酒發(fā)酵工藝采用多菌種協(xié)同發(fā)酵，通過單因素試驗(yàn)確定不同酵母菌、乳酸菌接種量對(duì)酒體品質(zhì)的影響。

1.4.1 釀酒酵母(Zymaflore X5)接種量對(duì)西瓜酒發(fā)酵的影響

在Lalvin DV10接種量50 mg/L、Lactoenos SB3接種量30 mg/L、初始醪液pH 4.0、游離SO2質(zhì)量濃度60 mg/L、主發(fā)酵溫度22 ℃(8 d)、二次發(fā)酵溫度18 ℃(15 d)條件下，Zymaflore X5接種量分別為100、200、300、400、500 mg/L，發(fā)酵生產(chǎn)西瓜酒，并于二次過濾后測(cè)定不同的Zymaflore X5接種量對(duì)酒度、酸度、殘?zhí)橇康挠绊憽?/p>

1.4.2 釀酒酵母(Lalvin DV10)接種量對(duì)西瓜酒發(fā)酵的影響

在Zymaflore X5接種量100 mg/L、Lactoenos SB3接種量30 mg/L、初始醪液pH 4.0、游離SO2質(zhì)量濃度60 mg/L、主發(fā)酵溫度22 ℃(8 d)、二次發(fā)酵溫度18 ℃(15 d)條件下，Lalvin DV10接種量分別為50、150、250、350、450 mg/L，發(fā)酵生產(chǎn)西瓜酒，于二次過濾后測(cè)定不同的Lalvin DV10接種量對(duì)酒度、酸度、殘?zhí)橇康挠绊憽?/p>

1.4.3 乳酸菌(Lactoenos SB3)接種量對(duì)西瓜酒發(fā)酵的影響

在發(fā)酵溫度20 ℃、Zymaflore X5接種量100 mg/L、Lalvin DV10接種量50 mg/L、初始醪液pH 4.0、游離SO2質(zhì)量濃度60 mg/L、主發(fā)酵溫度22 ℃(8 d)、二次發(fā)酵溫度18 ℃(15 d)條件下，Lactoenos SB3接種量分別為10、20、30、40、50 mg/L，發(fā)酵生產(chǎn)西瓜酒，并于二次過濾后測(cè)定不同的Lactoenos SB3接種量對(duì)酒度、酸度、殘?zhí)橇坑绊憽?/p>

1.5 多菌株不同接種量的正交試驗(yàn)

為進(jìn)一步研究各菌株不同接種量對(duì)西瓜酒品質(zhì)的影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酒精度為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳菌株接種量組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 工藝操作要點(diǎn)

2.1.1 西瓜的選擇與預(yù)處理

選用的西瓜新鮮、成熟、完整無劃痕，含糖量為126 g/L。西瓜皮要去除干凈以防其影響榨汁后果汁的味道[9]。此外，瓜籽也要去除干凈，因?yàn)楣献阎泻械闹|(zhì)、多糖等成分會(huì)影響最終發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味[10]。西瓜的去皮、去籽、榨汁要迅速，盡量減少西瓜汁的氧化，處理過程中向西瓜汁中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的維生素C和0.2%的檸檬酸作為護(hù)色劑。

2.1.2 西瓜汁的預(yù)處理

榨出的西瓜汁加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.09%的果膠酶，以提高果汁的澄清度。西瓜中含有乙醛、己酸、單乙胺、甲硫醇等物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在會(huì)對(duì)西瓜酒的品質(zhì)產(chǎn)生不良的影響，因此在接種發(fā)酵前須除去。通過加熱的方式，可除去西瓜汁中大部分的醛類、乙胺類、硫醇等物質(zhì)[11]。此外，對(duì)西瓜汁進(jìn)行熱處理同時(shí)可起到滅菌、濃縮的作用，有利于后續(xù)發(fā)酵。

滅菌結(jié)束后，要進(jìn)一步對(duì)西瓜汁的成分進(jìn)行調(diào)整，用白砂糖調(diào)瓜汁的含糖量為160 g/L，用檸檬酸調(diào)pH為3.5～4.0。為抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，加焦亞硫酸鉀調(diào)節(jié)瓜汁游離SO2質(zhì)量濃度為60 mg/L。

2.1.3 接種發(fā)酵

西瓜汁的發(fā)酵過程分為主發(fā)酵和后發(fā)酵。

主發(fā)酵采用兩種釀酒酵母(Zymaflore X5、Lalvin DV10)協(xié)同發(fā)酵，接種前應(yīng)事先分別將兩種酵母菌用調(diào)配好的西瓜汁進(jìn)行活化30 min，再加入到西瓜汁中，接種量控制在100～500 mg/L。主發(fā)酵溫度為22 ℃，發(fā)酵時(shí)間為8 d。

后發(fā)酵也叫二次發(fā)酵，所用菌種是乳酸菌(Lactoenos SB3)。通過二次發(fā)酵可以很好地消除酒體酸澀、粗糙等特點(diǎn)，并提高酒體的生物穩(wěn)定性，改善風(fēng)味[12]。乳酸菌接種量控制在10～50 mg/L，接種前要求醪液中游離SO2的ρ(SO2)<30 mg/L，總SO2的ρ(SO2)<60 mg/L。發(fā)酵溫度為18 ℃，發(fā)酵時(shí)間為15 d。發(fā)酵結(jié)束后立即添加焦亞硫酸鉀，使醪液中游離SO2質(zhì)量濃度達(dá)到60～80 mg/L，以抑制乳酸菌生長(zhǎng)結(jié)束二次發(fā)酵。

2.1.4 下膠過濾

主發(fā)酵結(jié)束后要對(duì)發(fā)酵液立即進(jìn)行下膠處理，以除去醪液中殘留的酵母菌體，而后轉(zhuǎn)入后發(fā)酵。澄清劑選用食品級(jí)皂土，添加量為1000 mg/L。皂土使用時(shí)先用50 ℃純凈水充分溶脹，緩慢加入到酒體中并不斷攪拌。下膠的酒體在15 ℃下放置48 h后過濾得到清酒液。

二次發(fā)酵結(jié)束后下膠選用的澄清劑為蛋清粉。蛋清粉是用新鮮雞蛋清經(jīng)干燥獲得的，呈白色細(xì)末狀。在溶液中，蛋白可與酚類物質(zhì)形成沉淀而增加酒體穩(wěn)定性，能有效改善酒體的結(jié)構(gòu)感，使酒體圓潤豐滿并且保持芳香特征[13]。蛋清粉添加量為60 mg/L，使用時(shí)先將蛋清粉加10倍質(zhì)量的常溫純凈水溶解，3 h后加入酒體中并攪拌均勻。下膠的酒體在15 ℃下放置14 d后過濾得到清酒液。

2.1.5 陳釀

發(fā)酵結(jié)束得到的酒體較為粗糙，口感欠佳，需經(jīng)過陳釀處理[14]。過濾澄清的酒體儲(chǔ)存于玻璃瓶中密封，于12 ℃避光環(huán)境下靜置20 d，以改善酒體口感、豐富香氣[15]。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 釀酒酵母(Zymaflore X5)最佳接種量的確定

Zymaflore X5不同接種量對(duì)發(fā)酵的影響見表3。

表3 Zymaflore X5不同接種量對(duì)西瓜酒發(fā)酵的影響Table 3 Effects of different inoculation amounts of Zymaflore X5 on the fermentation process

從表3可以看出，酒精度隨著Zymaflore X5接種量的增加逐漸升高，當(dāng)接種量高于300 mg/L時(shí)，酒精度有降低趨勢(shì)，且酒體酸度升高明顯。主要是因?yàn)檫^高的接種量會(huì)使發(fā)酵醪液中有限的營養(yǎng)物質(zhì)被酵母菌體生長(zhǎng)繁殖所利用，且過量的菌體生長(zhǎng)導(dǎo)致有機(jī)酸代謝增多，不利于酒體風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[16]。因此，選擇Zymaflore X5接種量為300 mg/L。

2.2.2 釀酒酵母(Lalvin DV10)最佳接種量的確定

Lalvin DV10不同接種量對(duì)發(fā)酵的影響見表4。

表4 Lalvin DV10不同接種量對(duì)西瓜酒發(fā)酵影響Table 4 Effects of different inoculation amounts of Lalvin DV10 on the fermentation process

從表4可以看出，酒精度隨Lalvin DV10接種量的增加逐漸升高，當(dāng)接種量高于250 mg/L時(shí)，酒精度有下降趨勢(shì)，總酸質(zhì)量濃度增加顯著。分析原因與Zymaflore X5菌種相似，過高的接種量導(dǎo)致酵母菌生長(zhǎng)過量，且Lalvin DV10菌種在高接種量時(shí)產(chǎn)酸增加，對(duì)酒體口感產(chǎn)生不利影響。因此選擇Lalvin DV10接種量為150 mg/L。

2.2.3 乳酸菌(Lactoenos SB3)最佳接種量的確定

Lactoenos SB3不同接種量對(duì)發(fā)酵的影響見表5。

表5 Lactoenos SB3不同接種量對(duì)西瓜酒發(fā)酵的影響Table 5 Effects of different inoculation amounts of Lactoenos SB3 on the fermentation process

從表5可以看出，此發(fā)酵條件下Lactoenos SB3不同接種量對(duì)酒精度影響不明顯，對(duì)總酸質(zhì)量濃度影響較大。這是因?yàn)槿樗峋鶯actoenos SB3接種于二次發(fā)酵，此時(shí)酒精發(fā)酵(即主發(fā)酵)已基本結(jié)束，乳酸菌的主要作用是降低酸度并通過菌體代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)以豐富酒體口感。由于乳酸菌較酵母菌在使用成本上更高、使用條件更為苛刻，因此Lactoenos SB3接種量選擇30 mg/L較適宜。

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表6)，考察Zymaflore X5接種量(因素A)、Lalvin DV10接種量(因素B)、Lactoenos SB3接種量(因素C)對(duì)西瓜酒酒精度的影響，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析以確定最佳接種量。優(yōu)化試驗(yàn)組合與結(jié)果見表7。以空白列作為試驗(yàn)誤差進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。

表6 正交試驗(yàn)因素水平表Table 6 Table of factors in orthogonal test

表7 優(yōu)化試驗(yàn)組合與結(jié)果Table 7 Combination and results of the optimization test

表8 正交試驗(yàn)方差分析表Table 8 Analysis of variance of orthogonal test

從表7直觀分析可知，對(duì)酒精度影響最大的是Lalvin DV10接種量，其次是Zymaflore X5，再次是Lactoenos SB3。從表8方差分析可知，因素B的p值<0.1，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響具有顯著性，A、C兩個(gè)因素?zé)o顯著性影響。因此只需對(duì)有顯著影響的B因素選擇最佳水平，其他因素可按實(shí)際需要選擇適當(dāng)水平。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定西瓜酒發(fā)酵最佳的菌株接種量組合是A1B3C2，即Zymaflore X5接種量250 mg/L、Lalvin DV10接種量200 mg/L、Lactoenos SB3接種量30 mg/L。

在最佳菌株接種量組合條件下，平行發(fā)酵生產(chǎn)三組西瓜酒，三組平行產(chǎn)品主要指標(biāo)如表9所示。通過表9可以得出，該工藝生產(chǎn)的西瓜酒酒精度可達(dá)(8.77±0.15)%，總酸質(zhì)量濃度(1.7±0.10) g/L，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度(3.97±0.15) g/L。

2.4 感官品評(píng)

根據(jù)西瓜酒感官品評(píng)方法(表2)，邀請(qǐng)三名品酒師對(duì)在最佳菌株接種量組合條件下生產(chǎn)的西瓜酒進(jìn)行感官品評(píng)。感官品評(píng)得分如表10所示。

表10 西瓜酒感官品評(píng)得分Table 10 Sensory score of the watermelon wine

該工藝生產(chǎn)的西瓜酒酒液呈橘紅色，清亮有光澤，具有西瓜果實(shí)特有的香氣，口感醇厚純凈而無異味，酒體協(xié)調(diào)，具有西瓜酒應(yīng)有的特征和風(fēng)味，綜合平均得分92。

3 結(jié)論

本研究以西瓜為原料，采用多菌種聯(lián)合發(fā)酵工藝生產(chǎn)西瓜酒。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)三株發(fā)酵菌株的最優(yōu)接種量配比進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合直觀分析、方差分析確定最佳菌株接種量組合為：Zymaflore X5接種量250 mg/L、Lalvin DV10接種量200 mg/L、Lactoenos SB3接種量30 mg/L。在此工藝條件下生產(chǎn)的西瓜酒酒精度達(dá)到(8.77±0.15)%，總酸質(zhì)量濃度(1.7±0.10) g/L，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度(3.97±0.15) g/L。酒液呈橘紅色，通體透亮有光澤，具有純正清爽的西瓜果實(shí)香，口感細(xì)膩、純凈，感官評(píng)定綜合得分92。

采用該工藝路線生產(chǎn)西瓜酒，工藝操作簡(jiǎn)便靈活，多菌種混合發(fā)酵在保證西瓜酒酒精度的同時(shí)使酒體更加豐滿，得到的產(chǎn)品在色澤、口感、香氣等方面特點(diǎn)突出，是一款符合現(xiàn)代人消費(fèi)理念的健康飲品，市場(chǎng)推廣前景廣闊。