崔福玲，孟令強(qiáng),王 靜，馬志國(guó)

1.山東省濱州市人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，山東濱州，256610； 2.山東省東營(yíng)市中醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東東營(yíng) 257000；山東省德州市人民醫(yī)院：3.眼科；4.檢驗(yàn)科，山東德州 253000

視網(wǎng)膜色素變性是視網(wǎng)膜變性里最常見的一組以進(jìn)行性光感受器細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮功能喪失為共同表現(xiàn)的致盲性眼病，在臨床表型和潛在的遺傳缺陷方面具有很強(qiáng)的異質(zhì)性[1]。RP發(fā)病率為1/3 500～1/5 000，影響全球約150萬(wàn)人[2]。近年來(lái)視網(wǎng)膜色素變性基因的發(fā)現(xiàn)主要依靠二代測(cè)序技術(shù)，二代測(cè)序技術(shù)能夠并行測(cè)序所有已知的相關(guān)基因，從預(yù)選的基因組區(qū)域產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)個(gè)讀數(shù)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，所有突變患者發(fā)病年齡均在21歲以下，提示可能沒有必要對(duì)50歲以上的患者進(jìn)行常規(guī)篩查[4]。本研究對(duì)本院臨床確診為視網(wǎng)膜色素變性的人群進(jìn)行二代測(cè)序技術(shù)測(cè)序和Sanger驗(yàn)證，分析總結(jié)視網(wǎng)膜色素變性的視網(wǎng)膜色素變性1基因(RP1基因)突變及其引起的特殊臨床表現(xiàn)特征，為后續(xù)臨床確診和遺傳咨詢等工作提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究采用橫斷面研究設(shè)計(jì)。將2018年1月至2019年7月在山東省濱州市人民醫(yī)院確診的視網(wǎng)膜色素變性25個(gè)家系共86例患者納入本研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夜盲史；(2)視力逐漸下降；(3)典型眼底改變，視盤呈蠟黃色萎縮，視網(wǎng)膜有骨細(xì)胞樣色素沉著，血管變細(xì)，視網(wǎng)膜呈青灰色；(4)早期周邊視野呈環(huán)形暗點(diǎn)，晚期視野呈向中心縮窄；(5)病變?cè)缙诩纯沙霈F(xiàn)視網(wǎng)膜電圖(ERG)、眼電圖(EOG)明顯異常。其中，男43例，女43例；年齡9～88歲，平均(49.44±3.67)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不能配合完成相關(guān)檢查者；(2)無(wú)法判斷發(fā)病原因是遺傳因素引起者；(3)無(wú)家系血樣可以進(jìn)行基因驗(yàn)證者。

患者和家系成員均通過標(biāo)準(zhǔn)臨床檢查，以明確診斷，并排除其他非遺傳因素引起的眼部疾病。臨床檢查包括病史詢問、物理檢查等。其中，病史詢問包括基礎(chǔ)個(gè)人信息(包括性別、年齡、籍貫、民族等)，主訴，現(xiàn)病史(初次發(fā)病時(shí)間、發(fā)病規(guī)律、就診情況、用藥情況、并發(fā)癥種類和時(shí)間等)，既往史(全身情況、基因檢測(cè)史等)，家族遺傳史，手術(shù)和藥物使用史，婚育史等。物理檢查包括視力和矯正視力、非接觸性眼壓、色覺、B超(天津邁達(dá)，型號(hào)ODM-2200)、視野(卡爾蔡司，型號(hào)750i)、眼前節(jié)照相、眼底彩色照相(Topcon，型號(hào)TRC NW-300)、光相干斷層掃描(OCT,型號(hào)Cirrus HD-OCT 5000)。除此之外，患者還進(jìn)行常規(guī)肘部靜脈采血，采用高通量二代基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因測(cè)序[5]。

1.2樣本采集 將符合要求的患者及家系成員常規(guī)采集肘部靜脈血5 mL，ETDA抗凝，-80 ℃保存。

1.3提取基因組DNA

1.3.1DNA提取 QIAGEN試劑盒提取外周血的DNA，Qubit 熒光儀檢測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

1.3.2文庫(kù)制備 參考華大基因的BGISEQ-500的文庫(kù)構(gòu)建指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行。(1)將質(zhì)量合格的DNA樣品通過超聲波高性能樣品處理系統(tǒng)(Covaris)隨機(jī)打斷，經(jīng)過片段選擇后得到150～250 bp的片段；(2)隨后進(jìn)行DNA片段末端修復(fù)，3′端加上“A”堿基，兩端加上文庫(kù)接頭；(3)接頭連接后的文庫(kù)進(jìn)行線性擴(kuò)增(LM-PCR)制備成雜交文庫(kù)；(4)雜交文庫(kù)與眼科基因芯片(深圳華大生命科學(xué)研究院提供792個(gè)基因Panel，其中視網(wǎng)膜色素變性基因78個(gè))進(jìn)行捕獲富集，洗脫未富集的片段后進(jìn)行擴(kuò)增；(5)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈分離和環(huán)化處理，環(huán)化文庫(kù)進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制生成DNA納米球。采用Qubit熒光儀檢測(cè)文庫(kù)濃度進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3.3上機(jī)測(cè)序 質(zhì)量控制合格的文庫(kù)采用BGISEQ-500 PE50+10程序上機(jī)測(cè)序，共檢測(cè)792個(gè)眼科目標(biāo)基因，其中含有78個(gè)視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)基因。

1.3.4信息分析 (1)從測(cè)序儀獲取原始數(shù)據(jù)(FASTQ數(shù)據(jù))；(2)過濾：對(duì)原始FASTQ數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)；(3)比對(duì)：利用SOAP和BWA軟件，使用hg19參考序列進(jìn)行比對(duì)；(4)去重復(fù)：基于Picard的去重復(fù)算法，去除重復(fù)序列；(5)變異檢測(cè)：基于GATK對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行變異檢測(cè)；(6)變異注釋：使用Next GENe5.4.5分析軟件對(duì)基因變異與特殊臨床表型的相關(guān)性進(jìn)行分析；使用頻率數(shù)據(jù)庫(kù)dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP6500數(shù)據(jù)庫(kù)、ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)及BGI內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行頻率注釋；使用HGVS對(duì)變異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)命名；使用OMIM、HGMD等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行突變及疾病注釋。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。基因突變以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1測(cè)序結(jié)果 25個(gè)家系共86例患者，目標(biāo)序列平均測(cè)序深度為107.79，目標(biāo)序列覆蓋率平均99.93%。平均99．98%目標(biāo)序列覆蓋率>10×，平均95.41%的目標(biāo)序列覆蓋率>30×，測(cè)序深度和平均覆蓋率均符合檢測(cè)要求。

2.2基因檢出情況 25個(gè)家系先證者中，檢測(cè)出已知致病性基因突變病例13例；檢出疑似致病性基因突變病例9例；臨床意義未明基因突變有3例；未檢出陰性病例，25個(gè)家系均有陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。8號(hào)患者的RP1基因上有2個(gè)突變位點(diǎn)，分別為c.2886delA和c.4129delG突變。25號(hào)患者的RP1基因上有4個(gè)致病突變位點(diǎn)，分別為c.4168_4169insT、c.4196delG、c.4169A>G和c.6353G>A突變。在檢出的基因變異位點(diǎn)中，RP1基因發(fā)現(xiàn)9個(gè)未報(bào)道致病基因突變位點(diǎn)，見表1。

表1 視網(wǎng)膜色素變性家系基因檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)未報(bào)道的RP1基因位點(diǎn)突變

2.3臨床觀察 8號(hào)病例：眼視盤界清色蠟黃，血管纖細(xì)，視網(wǎng)膜萎縮，呈青灰色，后極黃斑旁及赤道部少量骨細(xì)胞樣色素析出，眼底照相提示，色素散在分布，未附著于血管旁。自發(fā)熒光照相提示，視網(wǎng)膜色素背景熒光變淡，左眼黃斑旁機(jī)化瘢痕處點(diǎn)狀強(qiáng)熒光。視野檢查提示，雙眼視野呈不規(guī)則片狀，左眼中央?yún)^(qū)視野尚存。見圖1。25號(hào)病例：眼底照相顯示，雙眼視盤界清色淡，血管極細(xì)，黃斑中心凹處色暗，除后極黃斑區(qū)外，其余視網(wǎng)膜呈青灰色，未見明顯骨細(xì)胞樣色素沉著。自發(fā)熒光照相提示，眼底色素背景熒光極低或消失，呈斑駁樣。雙眼視野檢查提示，視野呈管狀，周邊視野完全喪失。OCT提示雙眼黃斑中心凹處極度萎縮，厚度僅為右眼37 μm，左眼31 μm。橢圓體帶嚴(yán)重萎縮，未見明顯反射，視網(wǎng)膜厚度中度萎縮。見圖2。

注：A、B為眼底照相，C、D為自發(fā)熒光照相，E、F為視野檢查；A、C、E示右眼，B、D、F示左眼。

注：A、B為眼底照相，C、D為自發(fā)熒光照相，E、F為視野檢查，G、H為OCT檢查；A、C、E、G示右眼，B、D、F、H示左眼。

3 討 論

RP1基因于1999年首次被鑒定，它由4個(gè)外顯子組成，編碼2 156個(gè)氨基酸[6]。RP1基因編碼一種光感受器特異性微管相關(guān)蛋白，定位于連接纖毛處，可能參與光感受器內(nèi)外段之間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)或纖毛結(jié)構(gòu)的維持，在視桿和視錐光感受器外段的結(jié)構(gòu)中起重要作用[7]。

視網(wǎng)膜色素變性包括一組以視桿狀細(xì)胞為特征的異質(zhì)性遺傳性視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良，其特征是視錐細(xì)胞變性之前的視桿細(xì)胞變性。視網(wǎng)膜色素變性的遺傳可以是常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖隱性遺傳或單純型。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約80個(gè)致病基因與視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)，其中58個(gè)與常染色體隱性遺傳形式有關(guān)。RP1基因是與視網(wǎng)膜色素變性關(guān)聯(lián)的80多個(gè)基因之一，在常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性和常染色體隱性遺傳視網(wǎng)膜色素變性的病例中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)基因的突變，除了RP1基因，還有bestrophin 1(BEST1)、神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈、核受體亞家族2 E組成員3(NR2E3)、視紫紅質(zhì)(RHO)、視網(wǎng)膜色素上皮基因(RPE65)[8]。RP1基因相關(guān)的常染色體隱性遺傳視網(wǎng)膜色素變性患者通常比RP1基因相關(guān)的常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性患者有更嚴(yán)重的視力損害[9]。

本研究納入的25個(gè)家系，全部找到已知或疑似致病突變或臨床意義未明的突變，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)RP1基因有9個(gè)未報(bào)道的新突變。

特別值得注意的是，本研究中患者編號(hào)為8號(hào)和25號(hào)家系的致病突變基因是RP1基因，均指向RP1基因型視網(wǎng)膜色素變性。8號(hào)患者RP1基因的c.2886delA和c.4129delG突變?yōu)槿笔б拼a突變，屬于烈性突變，該突變極可能引起編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生改變而致病。25號(hào)患者RP1基因上有4個(gè)致病突變位點(diǎn)，c.4168_4169insT和c.4196delG突變?yōu)椴迦牒腿笔б拼a突變，屬于烈性突變，而c.4169A>G和c.6353G>A突變?yōu)殄e(cuò)義突變。經(jīng)過家系共分離檢測(cè)確認(rèn)，筆者發(fā)現(xiàn)c.4168_4169insT和c.4169A>G突變位于DNA單鏈，而c.4196delG和c.6353G>A突變位于另一條鏈。在臨床表現(xiàn)上，筆者也能看到，25號(hào)患者的眼底病變程度遠(yuǎn)比8號(hào)患者嚴(yán)重，25號(hào)患者黃斑萎縮嚴(yán)重，中心凹處視錐細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，自發(fā)熒光照相顯示色素上皮背景熒光幾乎消失，動(dòng)脈血管萎縮尤其明顯。25號(hào)患者臨床表現(xiàn)出全色盲，考慮與黃斑的發(fā)育異常有關(guān)。因?yàn)榕c色盲有關(guān)的基因如CNGA3與CNGB3等均沒有發(fā)現(xiàn)異常，而該患者的黃斑發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，視錐細(xì)胞的發(fā)育缺失，從而導(dǎo)致色覺缺失。而8號(hào)患者無(wú)色盲，自發(fā)熒光照相顯示仍有少量色素上皮背景熒光，動(dòng)脈血管萎縮不明顯。綜合以上表現(xiàn)筆者認(rèn)為，RP1基因的多發(fā)位點(diǎn)突變導(dǎo)致的視網(wǎng)膜色素變性癥狀更顯著，危害更嚴(yán)重，這在國(guó)內(nèi)其他同類研究中鮮見報(bào)道。

已有研究顯示，RP1基因的突變可導(dǎo)致不同的臨床表型，可以將這些表型根據(jù)臨床發(fā)現(xiàn)、遺傳模式、發(fā)病年齡和病程在臨床上相互區(qū)分[10]?；蚍治鍪寡芯空吣軌蜻M(jìn)行有針對(duì)性的診斷測(cè)試，并確定基因治療的治療方法[11]。隨著基因治療等新型治療手段的出現(xiàn)，識(shí)別與RP1基因突變相關(guān)的整個(gè)臨床表型，對(duì)于幫助選擇合適的患者及評(píng)估所提供治療的效果至關(guān)重要。

視網(wǎng)膜色素變性的高發(fā)突變基因和突變位點(diǎn)具有異質(zhì)性，本研究新發(fā)現(xiàn)的RP1基因變異位點(diǎn)具有特殊臨床表型。但是HUCKFELDT等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，盡管RP1基因型相同，但臨床診斷包括黃斑營(yíng)養(yǎng)不良(MD)、椎桿營(yíng)養(yǎng)不良(CRD)和視網(wǎng)膜色素變性；VERBAKEL等[10]的研究也顯示，RP1基因的突變可導(dǎo)致不同的臨床表型，具體表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素變性、常染色體隱性遺傳MD或常染色體隱性遺傳CRD，取決于殘留的視網(wǎng)膜細(xì)胞的數(shù)目和生理功能等情況。

RP1基因是與RP關(guān)聯(lián)的80多個(gè)基因之一，MIZOBUCHI等[13]的研究表明，RP1基因變異類型/位置和臨床表型之間存在基因型-臨床表型相關(guān)性。RIERA等[14]的研究描述了由RP1基因突變引起的黃斑營(yíng)養(yǎng)不良表型，并在該基因中建立了新的基因型-表型相關(guān)性。本研究所發(fā)現(xiàn)這9個(gè)RP1基因突變位點(diǎn)，與視網(wǎng)膜色素變性之間及這些相關(guān)病例所表現(xiàn)出來(lái)的特殊臨床表型之間，是否存在必然的聯(lián)系，還需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、基因敲除、基因修復(fù)等進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證。

近年來(lái)二代高通量基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，可利用特制探針或基因擴(kuò)增，對(duì)特定的蛋白編碼區(qū)域DNA或某段特定序列進(jìn)行目標(biāo)捕獲并富集，進(jìn)行高通量測(cè)序。該技術(shù)具有效率高、費(fèi)用低、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，為大量表型復(fù)雜的視網(wǎng)膜色素變性家系研究提供了技術(shù)支持，是遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病的有效檢測(cè)手段，有助于研究者發(fā)現(xiàn)新發(fā)位點(diǎn)突變，并且臨床上可以輔助診斷視網(wǎng)膜色素變性類型，提高該類疾病臨床診治能力。此外，對(duì)于臨床RP1基因治療，必須全面了解疾病的自然病程，特別是要了解不同的表型，才能較好地評(píng)估治療效果。