張?jiān)孪?，?翔，張永苗，董 莉

1.南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇南京 210014；2.南京市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210022；3.南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210014

子癇前期(PE)是一種妊娠并發(fā)癥，是造成胎兒和產(chǎn)婦死亡的主要原因[1]。全球有3%～8%的妊娠期女性受到PE的影響[2-3]。PE主要表現(xiàn)為在妊娠中期或晚期、分娩過程中或分娩后出現(xiàn)的產(chǎn)婦高血壓、蛋白尿、血小板減少等癥狀，危及產(chǎn)婦和胎兒的生命。滋養(yǎng)層細(xì)胞的異常增殖和遷移侵襲會促進(jìn)胎盤釋放可溶性因子從而導(dǎo)致PE的發(fā)生[4]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的異常表達(dá)可影響PE的進(jìn)展[5-7]。微小RNA-433(miR-433)與多種腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散、遷移侵襲有關(guān)[8-9]。然而，目前鮮見miR-433對PE患者滋養(yǎng)層細(xì)胞的影響研究。因此，本研究旨在探討miR-433在PE患者中的表達(dá)及其影響機(jī)制，為PE患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集于2018年3月至2019年12月南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院就診的23例PE妊娠期女性和25例健康妊娠期女性的胎盤標(biāo)本(孕32～40周)。術(shù)后(PE妊娠期女性行剖宮產(chǎn)術(shù)，健康妊娠期女性行引產(chǎn)術(shù)及會陰側(cè)切術(shù))立即將胎盤組織在液氮中快速冷凍，-80 ℃保存，待進(jìn)一步試驗(yàn)。

PE的診斷標(biāo)準(zhǔn):既往血壓正常，孕20周后，收縮壓≥140 mm Hg或舒張壓≥90 mm Hg，24 h尿蛋白≥0.3 g[9]。納入標(biāo)準(zhǔn)：孕32～40周，符合PE診斷標(biāo)準(zhǔn)的妊娠期女性，自愿參與。排除標(biāo)準(zhǔn):高血壓高危情況、血液系統(tǒng)疾病和異常妊娠與其他產(chǎn)科并發(fā)癥。本研究經(jīng)南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署書面知情同意。PE妊娠期女性年齡19～34歲，平均(25.12±4.11)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(24.41±2.78)kg/m2；收縮壓(154.06±7.65)mm Hg；舒張壓(102.25±6.48)mm Hg；尿蛋白(3.67±0.73)g/24 h；孕周(35.33±3.28)周；胎兒體質(zhì)量(2.28±0.52)kg。健康妊娠期女性年齡22～31歲，平均(25.37±3.19)歲；BMI(25.63±3.10)kg/m2；收縮壓(109.55±5.93)mm Hg；舒張壓(70.69±5.07)mm Hg；尿蛋白未檢出；孕周(36.05±3.10)周；胎兒體質(zhì)量(3.16±0.74)kg。兩組年齡和BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 人滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo、AR和JEG-3及人胚腎細(xì)胞293T購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI-1640完全培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR試劑盒購于Takara公司。引物購于上海生工公司。熒光素酶報(bào)告基因檢測盒購于Promega公司。JNK1抗體和GAPDH購于Abcam公司。Lipofectamine 3000試劑購于Invitrogen公司；SDS試劑盒、抗體稀釋液、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于碧云天公司。 miR-433 mimic、anti-miR-433及各自的陰性對照物(miR-NC和anti-miR-NC)、JNK1過表達(dá)質(zhì)粒及其陰性對照均來自上海GeneChem公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HTR-8/SVneo細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 3000試劑說明書進(jìn)行操作，具體方法如下：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行消化，將消化后的細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，使細(xì)胞融合度為60%左右，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，加入目的質(zhì)粒2.5微克/孔，加入轉(zhuǎn)染試劑4.5 μL，“十”字法混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，處理細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.3.2qRT-PCR 使用Trizol試劑(美國Thermo公司)根據(jù)試劑操作說明提取細(xì)胞和組織總RNA。采用NanoDrop 2000(美國Thermo公司)對提取的RNA進(jìn)行定量。通過Semi qRT-PCR來定量miRNA。每一次Semi qRT-PCR反應(yīng)使用1 μg總RNA。將miR-433的表達(dá)正?；癁閁6表達(dá)作為內(nèi)源性調(diào)控。采用qRT-PCR檢測JNK1表達(dá)，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)條件和體系參照SYBR試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.3劃痕試驗(yàn) 采用劃痕試驗(yàn)測定細(xì)胞遷移能力。方法如下：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶進(jìn)行消化，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，取1×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔板中，將12孔板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右，用200 μL Tip在孔內(nèi)劃3條直線，用PBS吸取刮下來的細(xì)胞，更換RPMI-1640無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在0和24 h采用顯微鏡進(jìn)行拍照，記錄創(chuàng)面的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移距離。

1.3.4遷移侵襲試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的HTr-8/SVneo細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，PBS洗滌，采用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸后，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。將Transwell小室(遷移侵襲試驗(yàn)需用基質(zhì)膠將小室進(jìn)行包被)，插入24孔板內(nèi)，在小室上室內(nèi)加入1×104個(gè)細(xì)胞(遷移侵襲試驗(yàn)細(xì)胞數(shù)為2×104)。在下室內(nèi)加入500 μL含10%胎牛血清的LRPMI-1640完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽將附著在膜上方的細(xì)胞去除。將膜下方的細(xì)胞采用甲醇固定20 min，之后用0.1%結(jié)晶紫染色10～15 min，采用光學(xué)顯微鏡(DMI6000 B顯微鏡)對染色的細(xì)胞進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。

1.3.5Western blot 采用RIPA試劑裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白。30 μg蛋白通過12%SDS凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在Tris緩沖鹽溶液中室溫封閉1 h，洗滌后用兔抗人JNK1抗體(1∶2 000稀釋)、GAPDH抗體(1∶2 000稀釋)在4 ℃孵育過夜。洗滌后用帶有相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔二抗(1∶8 000稀釋)在室溫下避光孵育2 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(美國Thermo公司)檢測蛋白印跡。

1.3.6雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 為了研究miR-433抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移的機(jī)制，筆者利用TargetScan和miRanda來預(yù)測miR-433的直接靶基因并選擇JNK1作為miR-433的候選靶基因進(jìn)行進(jìn)一步評估。在pmirGLO載體的SacI/XboI限制性位點(diǎn)之間插入帶有miR-433結(jié)合位點(diǎn)的JNK1的3′-UTR構(gòu)建質(zhì)粒pmirGLO-WT-JNK1。通過去除miR-433的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建pmirGLO-MUT-JNK1質(zhì)粒。使用lipo3000將pmirGLO-WT-JNK1/pmirGLO-MUT-JNK1和miR-433 mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染36 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1miR-433在PE患者胎盤組織中的表達(dá)情況 與正常胎盤組織比較，PE患者胎盤組織內(nèi)miR-433表達(dá)明顯上調(diào)，見圖1。此外，在HTR-8/SVneo、JAR和JEG-3 3種滋養(yǎng)層細(xì)胞株中，miR-433在JAR細(xì)胞中表達(dá)最高，在HTR-8/SVneo細(xì)胞中表達(dá)最低，見圖2。隨后采用劃痕試驗(yàn)檢測了上述3種滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移能力，發(fā)現(xiàn)miR-433表達(dá)最高的JAR細(xì)胞的遷移能力最弱，明顯低于miR-433表達(dá)最低的HTR-8/SVneo細(xì)胞，見圖3。

注：與正常胎盤組織比較，aP<0.01。

注：與JAR細(xì)胞比較，aP<0.05;與JEG-3細(xì)胞比較，bP<0.05。

注：與JAR細(xì)胞比較，aP<0.05;與JEG-3細(xì)胞比較，bP<0.05。

2.2miR-433抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移和侵襲能力 通過使用miR-433 mimic和anti-miR-433轉(zhuǎn)染細(xì)胞來干擾miR-433的表達(dá)進(jìn)而評估m(xù)iR-433對HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。與轉(zhuǎn)染陰性對照細(xì)胞(miR-NC)相比，轉(zhuǎn)染miR-433 mimic后，通過Transwell孔的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明miR-433過表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲能力降低，見圖4、5。除此之外，與陰性對照細(xì)胞(anti-miR-NC)相比，轉(zhuǎn)染anti-miR-433后，通過Transwell孔的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，表明抑制miR-433表達(dá)后細(xì)胞遷移和侵襲能力增加，見圖6、7。

注：A、B為分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-433 mimic后HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移情況；C、D為分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-433 mimic后HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲情況。

注：與miR-NC比較，aP<0.05。

注：A、B為分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-433后HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移情況；C、D為分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-433后HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲情況。

注：與anti-miR-NC比較，aP<0.05。

2.3JNK1為miR-433的下游靶基因 結(jié)果顯示，與miR-433共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶相對活性明顯下降，說明miR-433直接抑制JNK1，見圖8、9。此外，通過Western blot檢測miR-433對JNK1表達(dá)的影響，結(jié)果表明，miR-433轉(zhuǎn)染明顯抑制了HTR-8/SVneo細(xì)胞中JNK1蛋白的相對表達(dá)水平，見圖10。

圖8 JNK1 mRNA與miR-433相互作用的野生型(WT)和突變型(MUT)3′-UTR序列

注：與miR-NC比較，aP<0.05。

圖10 轉(zhuǎn)染miR-433 mimic或miR-NC的HTR-8/SVneo細(xì)胞中JNK1蛋白相對表達(dá)水平

2.4miR-433通過抑制JNK1的表達(dá)影響HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移和侵襲能力 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-433通過JNK1影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲能力，筆者將miR-433 mimic和JNK1共轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細(xì)胞，采用Transwell遷移侵襲試驗(yàn)檢測在過表達(dá)miR-433的細(xì)胞中重新表達(dá)JNK1對細(xì)胞遷移侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，過表達(dá)JNK1能逆轉(zhuǎn)miR-433對HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用(P<0.001)，見圖11、12、13。以上結(jié)果表明，miR-433通過抑制JNK1的表達(dá)影響HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

注：A、B、C為分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-433 mimic、miR-433 mimic+JNK1后HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移情況；D、E、F為分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-433 mimic、miR-433 mimic+JNK1后HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲情況。

注：A為遷移細(xì)胞數(shù)情況，B為侵襲細(xì)胞數(shù)情況；與miR-433比較，aP<0.05。

圖13 miR-NC、miR-433 mimic及miR-433 mimic+JNK1單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染至HTR-8/SVneo細(xì)胞中JNK1蛋白相對表達(dá)水平

3 討 論

PE的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，多種因素影響PE的發(fā)生[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，人滋養(yǎng)層細(xì)胞的異常增殖和侵襲在PE的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[12-14]。因此，研究滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制，為治療PE尋找新的有效的分子靶點(diǎn)具有重要意義。越來越多的研究表明，PE患者胎盤組織中mi-RNA表達(dá)存在異常[15-18]。PE患者胎盤組織中表達(dá)異常的mi-RNA及其靶基因的鑒定為研究PE的發(fā)生提供了基礎(chǔ)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，PE患者胎盤miR-433表達(dá)上調(diào)，且JNK1被確定為miR-433的下游靶基因，miR-433的上調(diào)通過靶向JNK1抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移與侵襲，參與PE的發(fā)生、發(fā)展。

前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-433在多種疾病中發(fā)揮重要作用，且miR-433影響多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[20-24]。因此筆者猜想它可能影響PE的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PE患者胎盤組織中，miR-433明顯高表達(dá)。同時(shí)，在滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)，抑制miR-433的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，而過表達(dá)miR-433可抑制細(xì)胞遷移和侵襲。為了探究miR-433影響細(xì)胞遷移侵襲的機(jī)制，筆者采用生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，JNK1為miR-433的下游靶基因，過表達(dá)的miR-433可抑制JNK1的表達(dá)。這與miR-433在腫瘤組織中的研究存在差異[23]?？赡艿脑蚴莔iR-433通過不同靶點(diǎn)在不同疾病中發(fā)揮不同作用。如在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中，miR-433表達(dá)下調(diào)，并通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2/金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-2和MMP-9的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[20-25]。在乳腺癌中miR-433通過靶向MAPK信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞生長[26]。在食管鱗狀上皮細(xì)胞癌中，miR-433通過靶向GRB2抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲[27]。此外，TAO等[28]發(fā)現(xiàn)，在心臟纖維化的心臟病模型中，miR-433明顯高表達(dá)，在新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-433可以促進(jìn)細(xì)胞增殖并向肌成纖維細(xì)胞分化。值得注意的是，由于miR-433存在多個(gè)靶點(diǎn)，并不局限于JNK1，因此，筆者還需要進(jìn)一步研究其他潛在的靶基因，以進(jìn)一步研究miR-433在PE發(fā)生過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

此外，筆者還研究了miR-433是否通過下調(diào)JNK1在HTR-8/SVneo細(xì)胞中發(fā)揮作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JNK1的過表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了miR-433對滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。總的來說，目前的數(shù)據(jù)表明miR-433通過靶向JNK1參與了PE的發(fā)生，這表明miR-433/JNK1通路可能是PE治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。此外，SAUL等[29]發(fā)現(xiàn)，在重度PE患者中，妊娠早期母體血清中miR-433表達(dá)上調(diào)。因此，未來可以進(jìn)一步探究miR-433在母體血清中的表達(dá)情況。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，miR-433在PE患者胎盤組織中高表達(dá)，miR-433可能通過靶向JNK1抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲，參與PE的發(fā)生、發(fā)展。因此，靶向調(diào)節(jié)miR-433/JNK1通路的治療方法可能可以改善PE的治療。