王娟娟，榮婷婷，鄭英霞，朱威南，沈立松

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092

宮頸癌是一種可預(yù)防、可治愈的疾病，卻也是全球女性中發(fā)病率和病死率均排名第4位的癌癥[1]。據(jù)GLOBOCAN 2020年的數(shù)據(jù)，全球?qū)m頸癌每年新發(fā)病例近60萬例，病死病例約34.2萬例[2]。早期發(fā)現(xiàn)的宮頸癌患者其5年生存率為92%，而宮頸癌篩查成為提高早診率、降低病死率的主要途徑。巴氏涂片法是最早用于宮頸癌篩查的檢測方法，但靈敏度低，容易發(fā)生漏檢[3]。液基細(xì)胞學(xué)雖然提高了細(xì)胞學(xué)檢查的準(zhǔn)確性，但靈敏度和特異度與傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢查方法沒有明顯差異[4]。人乳頭瘤病毒(HPV)檢測具有很高的靈敏度和陰性預(yù)測值[5]，但不足以提供準(zhǔn)確的預(yù)測，因?yàn)椴⒎撬蠬PV亞型感染都將導(dǎo)致子宮頸癌的發(fā)生[6]。本研究針對CADM1、C13ORF18、PCDHA4和TERT 4種基因，收集不同病變類型的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，檢測每個(gè)基因的甲基化水平，研究其單項(xiàng)或聯(lián)合檢測與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的聯(lián)系，并結(jié)合高危HPV檢測及病理結(jié)果，綜合分析它們在識別宮頸癌及癌前病變中存在的價(jià)值。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年9月至2020年8月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院婦科就診的101例女性患者的宮頸脫落細(xì)胞，其中低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)51例作為LSIL組，高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)28例作為HSIL組，宮頸癌22例作為宮頸癌組，101例患者均在陰道鏡下活檢獲得組織標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)確診。其中有76例患者進(jìn)行TCT檢查。同時(shí)，采集20例健康女性的宮頸脫落細(xì)胞作為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組研究對象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 儀器和試劑檢測均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。SLAN-96S實(shí)時(shí)定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)、Centrifuge 5417R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)、GL-1800恒溫金屬浴(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、電泳儀(上海天能科技有限公司)、凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)、NanoDrop 2000(賽默飛世爾科技公司)。核酸提取試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)、HPV高危亞型檢測試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)、PCR檢測試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)、M.SssI酶(NEB公司)、核酸提取或純化試劑(蘇州海苗生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1宮頸脫落細(xì)胞的基因組DNA提取 采用Autrax全自動核酸提取工作站提取宮頸脫落細(xì)胞中的人基因組DNA和HPV DNA，提取的DNA使用NanoDrop 2000進(jìn)行測量，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2MSP甲基化引物設(shè)計(jì) 利用MethPrimer、NCBI primer-blast等網(wǎng)站進(jìn)行5個(gè)基因甲基化和非甲基化引物的設(shè)計(jì)(ACTB為內(nèi)參基因，具體序列見表1)，并將引物送出合成。

表1 9對基因引物序列表

續(xù)表1 9對基因引物序列表

1.3.3HPV DNA的檢測 采用HPV高危亞型檢測試劑盒對脫落細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行HPV16/18的PCR檢測。

1.3.4陽性對照制作 提取對照組外周血白細(xì)胞的基因組DNA，采用M.SssI酶處理后作為甲基化引物的陽性對照待用。

1.3.5重亞硫酸鹽修飾 采用核酸提取或純化試劑對提取的人脫落細(xì)胞基因組DNA和M.SssI酶處理后的陽性對照DNA進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理并純化，按試劑盒說明書操作。目的是將DNA中的非甲基化C轉(zhuǎn)化為U，然后通過PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為T。

1.3.6配制PCR反應(yīng)混合液 按照廠家(上海之江生物科技股份有限公司)說明書配制PCR反應(yīng)混合液，將重亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA加入混合液，上機(jī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：95 ℃，15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

1.3.7瓊脂糖凝膠電泳 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度3%，電壓120 V。

2 結(jié) 果

2.1各組一般資料比較 121例女性的年齡(46.91±13.89)歲，其中對照組(44.00±12.85)歲，LSIL組(45.69±13.37)歲，HSIL組(44.93±15.01)歲，宮頸癌組(54.91±12.40)歲。宮頸癌組≥55歲人數(shù)比例高于對照組、LSIL組和HSIL組(P<0.01)。對照組和不同病變程度的宮頸病變組中，HPV16/18的陽性率隨著病變程度增加呈上升趨勢(P<0.01)。76例患者的TCT檢查結(jié)果見表2。

表2 各組一般資料情況(n)

2.2瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 4對甲基化引物、4對非甲基化引物及1對人基因組內(nèi)參引物的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后確認(rèn)目的基因長度，見圖1，并送上海生工進(jìn)行克隆測序，確定目的基因序列。

2.34組間4種基因的甲基化水平差異分析 CADM1和PCDHA4基因的甲基化陽性率在LSIL組、HSIL組、宮頸癌組和對照組4組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C13ORF18和TERT基因的甲基化陽性率在4組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CADM1基因的甲基化陽性率在對照組、LSIL組、HSIL+宮頸癌組3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PCDHA4基因的甲基化陽性率在對照組、LSIL組、HSIL+宮頸癌組3組間隨著病變程度增加而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4種基因在不同宮頸病變患者及對照組中的甲基化陽性情況

2.4C13ORF18基因甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18檢測單項(xiàng)或聯(lián)合檢測時(shí)對于宮頸癌的診斷效能 C13ORF18基因甲基化檢測與HPV16/18二者聯(lián)合檢測，以及C13ORF18基因甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18三者聯(lián)合檢測時(shí)，特異度均為96.97%，但三者聯(lián)合檢測具有更高的陽性預(yù)測值(75.00%)。TERT基因甲基化單項(xiàng)檢測靈敏度和陰性預(yù)測值均最高，分別為86.36%、94.74%。見表4。

表4 不同檢測方法對宮頸癌的診斷效能(%)

2.5C13ORF18基因甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18檢測單項(xiàng)或聯(lián)合檢測在TCT檢查結(jié)果為不能明確意義的不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)患者中區(qū)分高級別及以上病變的診斷效能 當(dāng)TCT檢查結(jié)果為正?；駻SCUS時(shí)，HPV16/18檢測篩查高級別級以上病變的檢測靈敏度最好(分別為100.00%和71.43%)，且具有較好的陰性預(yù)測值。C13ORF18基因甲基化檢測具有較好的特異度，均高達(dá)100.00%，且具有較好的陽性預(yù)測值。HPV16/18與C13ORF18基因甲基化聯(lián)合檢測的靈敏度低于HPV16/18單項(xiàng)檢測，同時(shí)與C13ORF18基因甲基化單項(xiàng)檢測比較，雖特異度一致，但靈敏度沒有提高，甚至在ASCUS的TCT結(jié)果診斷中明顯下降。TERT基因甲基化檢測無論是單項(xiàng)還是聯(lián)合HPV16/18檢測,靈敏度均不及HPV16/18單項(xiàng)檢測，特異度也不及C13ORF18基因甲基化單項(xiàng)檢測，見表5、6。

表5 C13ORF18甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18檢測單項(xiàng)或聯(lián)合檢測在正常TCT結(jié)果中診斷高級別及以上病變的診斷效能(%)

表6 C13ORF18甲基化檢測、TERT基因甲基化檢測與HPV16/18檢測單項(xiàng)或聯(lián)合檢測在ASCUS的TCT結(jié)果中診斷高級別及以上病變的診斷效能(%)

3 討 論

高危HPV亞型的感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因[7]，但是高危HPV亞型感染并不一定能夠促使最終發(fā)展為宮頸癌，僅有少部分人HPV持續(xù)性感染會發(fā)展為子宮頸病變。本研究中宮頸癌組的女性年齡明顯高于對照組、LSIL組和HSIL組，且HPV16/18的陽性率隨著宮頸病變程度的增加而增高，也證實(shí)了高危HPV亞型的持續(xù)感染在子宮頸癌及癌前病變中的關(guān)鍵作用。

目前對于宮頸癌的篩查策略主要采用細(xì)胞學(xué)檢查或主要的高危HPV亞型檢測，分別側(cè)重于檢測異常細(xì)胞和是否存在高危HPV亞型感染。傳統(tǒng)宮頸巴氏涂片可以診斷宮頸癌病變，但靈敏度低，假陰性率非常高，容易導(dǎo)致臨床誤診和漏診[8]。TCT檢查提高了細(xì)胞學(xué)檢查的陽性率，但其受標(biāo)本采集及制片的影響[9]，本研究中76例患者的TCT檢查結(jié)果也證實(shí)了細(xì)胞學(xué)檢查的局限性；而高危HPV亞型篩查不能區(qū)分一過性感染和持續(xù)性轉(zhuǎn)化感染，降低了篩查的特異度，這表明需要采取更加客觀的篩查策略。

DNA甲基化是修飾DNA的一種方式，其不改變基因組DNA，僅改變表觀遺傳表現(xiàn)，是細(xì)胞維持基因穩(wěn)定和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的主要因素[10]。DNA甲基化主要機(jī)制是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化作用下，使胞嘧啶磷酸鳥嘌呤二核苷酸(CpG)5′端C原子與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的活性甲基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成DNA的甲基化修飾。CpG島中的大多數(shù)CpG在正常細(xì)胞中通常未甲基化，CpG的超甲基化是在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常觀察到的變化之一，這可能導(dǎo)致腫瘤抑制基因沉默[11]。因此，基因甲基化可能是宮頸癌診斷的潛在生物標(biāo)志物。目前在宮頸組織中已檢測出超過 100 種基因甲基化標(biāo)志物[12]，趙娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌和癌旁組織中的 SALL3 基因啟動子區(qū)甲基化水平明顯高于正常宮頸組織。盡管如此，病理組織標(biāo)本取樣煩瑣，并不適用于一般人群篩查。有報(bào)道顯示，宮頸脫落細(xì)胞基因甲基化檢測可應(yīng)用于宮頸癌早期篩查，并可能成為更加靈敏、特異的手段[14]。近年來國內(nèi)也有許多關(guān)于宮頸脫落細(xì)胞如PAX1[15]、FAM19A4[16]等基因甲基化的研究，結(jié)果也提示了宮頸脫落細(xì)胞基因甲基化的檢測在宮頸癌及癌前病變篩查中具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。

CADM1，又稱肺癌腫瘤抑制因子1(TSLCl)，主要發(fā)揮維持細(xì)胞間黏附穩(wěn)定及細(xì)胞骨架構(gòu)建的功能。在許多實(shí)體瘤(如胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、食道癌和宮頸癌)中，CADM1經(jīng)常被啟動子高甲基化滅活[17]，有研究發(fā)現(xiàn)，CADMl與MAL基因甲基化異常與高級別宮頸病變更高的陽性率相關(guān)[18]。C13ORF18為13號染色體開放閱讀框18，C13ORF18的啟動子甲基化會導(dǎo)致細(xì)胞周期的破壞，可能是宮頸癌發(fā)生的早期事件[19]。原鈣黏蛋白(PCDH)是細(xì)胞黏附分子超家族中最大的一員，分為α、β、和γPCDH基因簇(根據(jù)人類基因組組織命名法分別對應(yīng)PCDHA@、PCDHB@和PCDHG@)，在5q31號染色體上串聯(lián)分布，PCDHA4是PCDHA@中的一種。有研究顯示，與HPV檢測相比，對于宮頸上皮內(nèi)瘤變2級病變的早期檢測，PCDHA4的甲基化檢測具有相同的靈敏度，但特異度更高[20]。TERT是細(xì)胞內(nèi)一種與癌變密切相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄酶，其基因啟動子區(qū)異常甲基化已被證實(shí)存在于包括宮頸癌[21]在內(nèi)的多種腫瘤組織中。

GUSTAFSON等[22]對液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中15種基因甲基化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，CADMl基因甲基化檢測是區(qū)分高級病變與正常及低級別病變最好的標(biāo)志物。VAN BAARS等[23]的研究也顯示了相似的結(jié)果，CADM1基因甲基化隨著病變嚴(yán)重程度的增加而增加，并且是病變特異性的標(biāo)志物。而本研究結(jié)果表明，CADMl基因甲基化陽性率在4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，并在低級別和高級別及以上病變之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能是由研究人群的種族、地域差異造成的。

WANG等[20]的研究顯示，正常對照、癌前病變(CIN)1級、CIN2/3級和子宮頸癌中PCDHA4基因甲基化陽性率隨著病變程度增加明顯增高，而本研究中該基因甲基化陽性率在4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能原因?yàn)楸狙芯繉m頸癌患者例數(shù)太少。然而，該基因甲基化陽性率在對照組、LSIL組和HSIL+宮頸癌組3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明PCDHA4基因的甲基化檢測有助于區(qū)分低級別和高級別及以上的病變。

YANG等[24]等的研究顯示，對于區(qū)分正常和CIN2級及以上的病變，C13ORF18基因甲基化是良好的檢測標(biāo)志物。也有試驗(yàn)證實(shí)，宮頸刮片中的C13ORF18啟動子甲基化與高級別病變密切相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，對照組、LSIL組、HSIL組和宮頸癌4組間的C13ORF18基因甲基化陽性率隨著病變程度的加深而明顯增高(P<0.01)，且C13ORF18基因甲基化單項(xiàng)檢測用于診斷宮頸癌，顯示出了較好的特異度(93.94%)，并優(yōu)于HPV16/18(75.76%)和TERT基因甲基化(54.55%)單項(xiàng)檢測。

EIJSINK等[26]的研究顯示，TERT基因甲基化陽性率在正常、CIN1、CIN2、CIN3和宮頸癌的冰凍宮頸組織中分別為8%、16%、14%、51%、90%，而本研究中該基因在宮頸脫落細(xì)胞中也有相似的結(jié)果，該基因甲基化陽性率在對照組、LSIL組、HSIL組和宮頸癌組中隨著病變程度增加而增加(P<0.05)，TERT基因甲基化單項(xiàng)檢測用于診斷宮頸癌的靈敏度為86.36%，高于C13ORF18基因甲基化(59.09%)和HPV16/18(68.18%)單項(xiàng)檢測，但特異度比C13ORF18基因甲基化和HPV16/18單項(xiàng)檢測低。

對C13ORF18基因甲基化、TERT基因甲基化聯(lián)合HPV16/18檢測診斷宮頸癌的綜合分析結(jié)果顯示，C13OFR18基因甲基化檢測聯(lián)合HPV16/18檢測可以略微提高檢測特異度(從93.94%提升至96.97%)，但是靈敏度大大降低(從59.09%降至45.45%)；TERT基因甲基化檢測聯(lián)合HPV16/18檢測可以提高特異度至85.86%，但不及C13ORF18基因甲基化單項(xiàng)檢測的特異度高，且靈敏度較低；三者聯(lián)合檢測特異度與C13OFR18基因甲基化檢測聯(lián)合HPV16/18檢測的特異度相同，但檢測靈敏度較低。

此外，本研究結(jié)果顯示，HPV16/18檢測和C13ORF18基因甲基化檢測可能有助于對于細(xì)胞學(xué)檢查后進(jìn)一步進(jìn)行危險(xiǎn)分層。對于正?；駻SCUS的TCT檢查結(jié)果，HPV16/18檢測對于區(qū)分宮頸高級別及以上病變具有很高的靈敏度(分別為100.00%和71.43%)，而C13ORF18基因甲基化檢測的特異度均高達(dá)100.00%。

綜上所述，宮頸脫落細(xì)胞CADM1、PCDHA4、TERT和C13ORF18這4種基因中，TERT基因和C13ORF18基因甲基化單項(xiàng)檢測在宮頸癌及癌前病變的篩查中體現(xiàn)了較好的臨床價(jià)值，但是聯(lián)合HPV16/18的篩查并不能明顯提高診斷性能。HPV16/18檢測和C13ORF18基因甲基化檢測對于細(xì)胞學(xué)檢查后進(jìn)一步進(jìn)行危險(xiǎn)分層具有一定的臨床意義。本研究樣本量尤其是宮頸癌患者病例較少，宮頸癌標(biāo)本臨床資料不夠全面，未來可擴(kuò)大研究人群，補(bǔ)充臨床資料，并結(jié)合更多的基因進(jìn)一步研究。