李靖霄，李國(guó)盛，徐陽(yáng)，何融泉，周華富，孔晉亮，陳罡*

肺癌（lung cancer，LC）是中國(guó)最常見且病死率最高的癌種；最新的研究報(bào)道顯示，在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中，LC的發(fā)病率和病死率分別位居第二和第一［1，2］。根據(jù)病理分型，LC常被分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩種亞型，而前者約占LC的85%［3］。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是最常被診斷的NSCLC組織學(xué)亞型［4］。隨著診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步，手術(shù)聯(lián)合新型放化療已可使NSCLC患者5年生存率達(dá)到21.7%［5］。然而，更多的患者在確診時(shí)腫瘤已進(jìn)展到晚期，這讓常規(guī)治療方法的療效不容樂觀［6，7］。因此，挖掘有效的臨床篩查和治療NSCLC的標(biāo)志物，對(duì)降低患者病死率和提高患者生存質(zhì)量尤為重要。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）可通過調(diào)控信使RNA的表達(dá)而影響轉(zhuǎn)錄過程［8］。作為miR-130家族的一員，miR-130b-3p已被報(bào)道參與調(diào)控多種腫瘤的進(jìn)展，但其調(diào)控作用與調(diào)控機(jī)制在不同腫瘤中卻不盡相同［9］。例如，miR-130b-3p在肝細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌中被認(rèn)為具有抑制腫瘤發(fā)展的作用，而在膀胱癌、腎母細(xì)胞癌、胃癌中被認(rèn)為具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用［10-15］。此外，miR-130b-3p在NSCLC中的作用也已被初步報(bào)道。一些針對(duì)人工培育NSCLC細(xì)胞和NSCLC患者腫瘤組織的研究表明，miR-130b-3p具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用［16-18］。盡管Ulivi等人的研究提到，血液中miR-130b-3p的表達(dá)與NSCLC患者的總生存率顯著相關(guān)，但他們并未闡明miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達(dá)情況與臨床意義［18］。此外，這些有關(guān)miR-130b-3p和NSCLC的研究均屬于單中心的小樣本研究，未探索miR-130b-3p應(yīng)用于篩查NSCLC的潛在價(jià)值，且未闡明miR-130b-3p在NSCLC中的作用機(jī)制。因此，應(yīng)用大量樣本進(jìn)一步探索miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達(dá)水平和作用機(jī)制對(duì)明確miR-130b-3p的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值至關(guān)重要。

本研究旨在通過分析來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)的miRNAs表達(dá)譜，以探究miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達(dá)水平及鑒別該疾病的潛力，從而挖掘miR-130b-3p篩查和治療NSCLC的潛在臨床意義。

1 資料與方法

1.1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達(dá)水平

為采集用于分析miR-130b-3p在NSCLC中的表達(dá)水平與鑒別潛力的數(shù)據(jù)，本研究以“l(fā)ung AND（tumor OR cancer OR carcinoma OR neoplasms）

AND（microRNA OR miRNA）”作為檢索式，在基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）以及序列片段歸檔數(shù)據(jù)庫(kù)（Sequence Read Archive，SRA）中進(jìn)行檢索。同時(shí)，為了檢索與提取癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中收錄的數(shù)據(jù)，Xena數(shù)據(jù)庫(kù)被用于下載LC相關(guān)數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集納入條件如下：①研究對(duì)象為智人；②數(shù)據(jù)應(yīng)來(lái)自血液，包括全血、血漿等；③數(shù)據(jù)集需包含miR-130b-3p表達(dá)數(shù)據(jù)；④每個(gè)數(shù)據(jù)集需包含至少3個(gè)腫瘤和3個(gè)非腫瘤樣本；⑤樣本未經(jīng)過任何藥物或其它化學(xué)物質(zhì)處理。隨后，將所收集到的數(shù)據(jù)按照測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行合并，并進(jìn)行了log2（x+1）轉(zhuǎn)換。

為觀察不同NSCLC亞型中miR-130b-3p的表達(dá)水平，本研究根據(jù)腫瘤亞型將所有樣本分為兩組，分別為L(zhǎng)UAD和LUSC組。首先，對(duì)數(shù)據(jù)集的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、敏感度、特異度進(jìn)行計(jì)算，并根據(jù)分組進(jìn)行記錄。接著，各個(gè)數(shù)據(jù)集的miR-130b-3p表達(dá)水平被繪制成散點(diǎn)圖和受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線。為了綜合展示各個(gè)數(shù)據(jù)集的結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)化均數(shù)差（standardized mean difference，SMD）和診斷性似然比（diagnostic likelihood ratio，DLR）也被計(jì)算。我們還繪制森林圖與綜合受試者工作特征（summaryreceiver operating characteristic，sROC）曲線。由于可收集到的數(shù)據(jù)有限，本研究在此將LUAD和LUSC的數(shù)據(jù)集合并分析。曲線下面積（area under curve，AUC）的百分比值大小是在ROC及sROC曲線中評(píng)判miR-130b-3p鑒別NSCLC的潛力的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 MiR-130b-3p下游靶基因的篩選

MiRwalk 2.0納入了12個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的miRNAs和基因的表達(dá)情況，具有預(yù)測(cè)miRNA-靶基因關(guān)系的功能。本研究將“miR-130b-3p”作為關(guān)鍵詞在MiRwalk 2.0中進(jìn)行檢索。對(duì)檢索到的靶基因基于下列條件篩選：結(jié)合分?jǐn)?shù)（binding score）等于1且同時(shí)在12個(gè)數(shù)據(jù)集中被認(rèn)為是miR-130b-3p的靶基因。將篩選到的基因輸入檢索相互作用基因的搜索工具（search tool for the retrieval of interacting genes，STRING）分析靶基因之間作用關(guān)系，并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。隨后，根據(jù)各基因相互作用的degree值篩選出的樞紐基因（hub genes）被選用于后續(xù)分析。

1.3 富集分析

將篩選得到的miR-130b-3p下游靶基因輸入注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）v 6.8進(jìn)行富集分析。本研究選擇了基因本體（Gene Ontology，GO）-生物過程（biological process，BP）、GO-細(xì)胞成分（cellular component，CC）、GO-分子功能（molecular function，MF）對(duì)miR-130b-3p下游靶基因進(jìn)行功能富集，同時(shí)應(yīng)用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，以探討miR-130b-3p下游靶基因調(diào)控腫瘤發(fā)展的潛在信號(hào)通路。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在本研究中，Graphpad prism 8.0被用于構(gòu)建散點(diǎn)圖及描繪ROC曲線。應(yīng)用IBM SPSS 23.0計(jì)算數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。Stata 14.0被用于計(jì)算SMD和DLR并繪制森林圖與sROC曲線。在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRwalk 2.0以及DAVID v6.8分別被用于預(yù)測(cè)miR-130b-3p的下游靶基因和下游靶基因的潛在信號(hào)通路。我們使用Cytoscape v3.7.1的cytohubba模塊篩選出了miR-130b-3p下游靶基因的樞紐基因。

2 結(jié)果

2.1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中低表達(dá)

在本研究中，共有來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)的7項(xiàng)研究被納入分析（表1）。

在4個(gè)納入的LUAD數(shù)據(jù)集中，有3個(gè)表明miR-130b-3p在LUAD組和對(duì)照組血液樣本間的表達(dá)差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A～D）。如 圖1E～G所 示，在3個(gè) 納 入 的LUSC數(shù)據(jù) 集 中有1個(gè)表明在LUSC組和對(duì)照組血液樣本間miR-130b-3p的表達(dá)差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)各個(gè)數(shù)據(jù)集ROC曲線的AUC，我們認(rèn)為使用在NSCLC患者血液中低表達(dá)的miR-130b-3p具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值（圖2）。

圖1 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中表達(dá)水平的散點(diǎn)圖A～D：樣本來(lái)自LUAD患者血液；E～G：樣本來(lái)自LUSC患者血液

圖2 MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的ROC曲線A～D：分別為GSE27486、GSE40738、GSE152702和GSE171517的ROC曲線；E～G：分別為GSE40738、GSE152702和GSE171517的ROC曲線

為了進(jìn)一步明確miR-130b-3p在NSCLC患者血液的表達(dá)水平，本研究綜合計(jì)算了miR-130b-3p的SMD（表2）。結(jié)果表明，在LUAD中，SMD=-1.45，95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）為-2.66～-0.23；在LUSC中，SMD=-0.46，95%CI：-0.84～-0.09（圖3A）。未發(fā)現(xiàn)SMD結(jié)果存在明顯的發(fā)表偏倚（圖3B）。因此，目前結(jié)果顯示miR-130b-3p在NSCLC患者血液中的表達(dá)量顯著低于健康人血液。綜合結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者血液中低表達(dá)的miR-130b-3p具有較好地區(qū)分腫瘤組織和正常組織的潛力（AUC=0.85，95%CI：0.82～0.88）（圖3C）。圖3D提示納入的NSCLC組織數(shù)據(jù)集具有較低的陰性DLR以及較高的陽(yáng)性DLR。

圖3 MiR-130b-3p在NSCLC患者體內(nèi)的表達(dá)水平及鑒別潛力A：MiR-130b-3p在血液中表達(dá)水平森林圖，上半部分表示其在LUAD血液樣本中的表達(dá)水平，下半部分表示其在LUSC血液樣本中的表達(dá)；B：漏斗圖展示所納入血液樣本的發(fā)表偏倚；C：MiR-130b-3p在NSCLC患者血液中的sROC曲線；D：在NSCLC患者血液中miR-130b-3p的DLR注：LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鱗狀細(xì)胞癌；sROC，綜合受試者工作特征；NSCLC，非小細(xì)胞肺癌；DLR，診斷性似然比

表2 在7項(xiàng)納入的研究中，miR-130b-3p在NSCLC患者和健康人血液中的表達(dá)水平平均值與標(biāo)準(zhǔn)差

2.2 探索miR-130b-3p的下游靶基因

在miRwalk 2.0中，本研究篩選出了47個(gè)miR-130b-3p的下游靶基因，并通過PPI網(wǎng)絡(luò)展示了他們之間的聯(lián)系（圖4A）。根據(jù)各下游靶基因間的degree值，我們篩選出了前10個(gè)degree值最高的下游靶基因作為樞紐基因，分別為ESR1、AGO1、DDX6、MTMR9、CFL2、TRIM2、QKI、FMR1、TNRC6B和BRWD1（圖4B）。所篩選出的下游靶基因們將被用于后續(xù)分析。

2.3 富集分析

結(jié)果顯示，在GO-BP分析中，miR-130b-3p下游靶基因顯著富集于protein phosphorylation、mRNA processing和RNA splicing（圖4C）。在GO-CC分析中，miR-130b-3p下游靶基因顯著富集于lysosome、early endosome membrane和processing body（圖4D）。在GO-MF分析中，miR-130b-3p下游靶基因顯著富集于protein binding、chromatin binding和protein serine（圖4E）。KEGG分析結(jié)果表明，miR-130b-3p下游靶基因顯著富集于endocytosis和axon guidance通路（圖4F）。這些結(jié)果提示miR-130b-3p可能通過參與相關(guān)通路的調(diào)控進(jìn)而影響NSCLC的發(fā)展。

圖4 MiR-130b-3p下游靶基因的富集分析A：使用miR-130b-3p下游靶基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖；B：MiR-130b-3p下游靶基因的樞紐基因（hub genes）；C：在GO_BP分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情況；D：在GO_CC分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情況；E：在GO_MF分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情況；F：在KEGG富集分析中miR-130b-3p下游靶基因富集情況

3 討論

在本研究中，基于300例血液樣本的miR-130b-3p表達(dá)水平，我們首次提出miR-130b-3p在NSCLC患者血液中表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在血液中低表達(dá)的miR-130b-3p具有顯著的篩查NSCLC患者的潛力。47個(gè)基因被鑒定為miR-130b-3p的下游靶基因，且根據(jù)這些靶基因探索miR-130b-3p參與調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的潛在信號(hào)通路。

近年來(lái)，已有一些研究報(bào)道了miR-130b-3p在NSCLC中的表達(dá)水平及生物學(xué)作用?；诜治?5例組織樣本，Yu等［16］人發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p的表達(dá)水平在來(lái)自NSCLC患者體內(nèi)的癌細(xì)胞中明顯升高，并與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移速度呈正相關(guān)，且敲低miR-130b-3p后，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移隨之受到抑制。Guo等［17］人發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p在人工培育的NSCLC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；而敲低miR-130b-3p的NSCLC細(xì)胞具有更低的增殖、侵襲和遷移能力，提示了miR-130b-3p表達(dá)可能影響NSCLC的進(jìn)展。通過分析99例LUAD樣本和83例LUSC樣本的血液miRNAs表達(dá)水平，Ulivi等［18］人報(bào)道了高表達(dá)的miR-130b-3p與LUSC患者的無(wú)瘤生存期呈明顯負(fù)相關(guān)，且與LUAD患者的總生存率呈明顯負(fù)相關(guān)。這些研究提示了miR-130b-3p在NSCLC的表達(dá)差異及重要生物學(xué)功能，但存在樣本量較小（n≤182）、僅基于單中心數(shù)據(jù)等問題，他們也并未闡明miR-130b-3p在血液中的表達(dá)水平。在本研究首次通過來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)大樣本探討了miR-130b-3p在NSCLC患者血液內(nèi)的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)相較于健康人的血液，miR-130b-3p在NSCLC患者的血液中呈現(xiàn)明顯的低表達(dá)。已有的研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡和活性分泌是血液中miRNAs的重要來(lái)源，當(dāng)細(xì)胞凋亡和活性分泌活躍時(shí)，血液中miRNAs含 量 上調(diào)［19］。Guo等［17］人認(rèn)為，miR-130b-3p主要來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過胞外囊泡分泌轉(zhuǎn)移至NSCLC細(xì)胞內(nèi)，從而促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，我們推斷NSCLC患者間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的miR-130b-3p隨血液轉(zhuǎn)移至NSCLC細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致患者血液中miR-130b-3p含量較正常人的更低；同時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞凋亡活動(dòng)減弱，患者血液中miR-130b-3p將持續(xù)處于低水平。

現(xiàn)有研究表明，血液中miRNAs可作為某些腫瘤的生物標(biāo)志物［20］。一些研究也通過診斷試驗(yàn)鑒定了多個(gè)具有作為NSCLC早期篩查的生物標(biāo)志物前景的miRNAs［21-23］。在本研究中，診斷試驗(yàn)結(jié)果顯示miR-130b-3p的AUC=0.85，提示miR-130b-3p可以較為準(zhǔn)確地鑒別NSCLC患者和健康人。因此，我們提出通過檢測(cè)血液中miR-130b-3p的表達(dá)水平，有助于篩查NSCLC。在未來(lái)投入更多的精力研究miR-130b-3p在NSCLC患者血液的表達(dá)水平，對(duì)早期預(yù)測(cè)NSCLC及其預(yù)后具有積極作用。

本研究尚存在一些局限：首先，尚需在將來(lái)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-130b-3p與下游靶基因的聯(lián)系；其次，下游靶基因所顯著富集的信號(hào)通路與NSCLC發(fā)展的關(guān)系尚無(wú)法闡明；最后，因可收集的樣本有限，除了LUAD和LUSC外，本研究未能對(duì)NSCLC的其他亞型進(jìn)行分析。

總之，本研究通過分析來(lái)自多中心的大樣本數(shù)據(jù)，首次提出miR-130b-3p在NSCLC患者血液內(nèi)表達(dá)下調(diào)，并有望用于NSCLC的篩查。