許 航 孟 林

·綜述與進展·

骨關(guān)節(jié)炎的基因治療研究進展

許 航1孟 林2

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院創(chuàng)傷骨科與手外科，廣西南寧 530011; 2.廣西骨傷醫(yī)院關(guān)節(jié)科，廣西南寧 530012

骨關(guān)節(jié)炎是一種嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的骨科疾病，盡管治療手段較多，但治療效果仍然欠佳。近幾年，隨著基因治療在骨關(guān)節(jié)炎方面的研究逐步深入，發(fā)現(xiàn)其可以通過抑制炎癥、抑制軟骨細(xì)胞凋亡，以及促進軟骨細(xì)胞增殖等途徑發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外相關(guān)研究文獻，對骨關(guān)節(jié)炎基因治療的研究現(xiàn)狀進行總結(jié)分析，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

骨關(guān)節(jié)炎；基因治療；載體

骨關(guān)節(jié)炎是一種多見于中老年人及運動員的疾病，臨床表現(xiàn)為病變關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹、功能下降，發(fā)作過程為持續(xù)性及反復(fù)性[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，基因治療逐漸成為骨關(guān)節(jié)炎治療的熱點。骨關(guān)節(jié)炎的基因治療是指將具有編碼治療性蛋白的基因?qū)腙P(guān)節(jié)中，使關(guān)節(jié)組織持續(xù)形成具有治療骨關(guān)節(jié)炎的蛋白，從而達到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。本文廣泛查閱近年來國內(nèi)外有關(guān)骨關(guān)節(jié)炎基因治療的相關(guān)研究，并進行總結(jié)分析，旨在為骨關(guān)節(jié)炎的基因治療后續(xù)相關(guān)研究提供參考和借鑒。

1 炎癥因子在骨關(guān)節(jié)炎中的作用

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制尚不完全清楚，目前認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病主要涉及致病因素刺激關(guān)節(jié)組織表達腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（inter-leukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥因子[2]。相關(guān)研究表明，TNF-α和IL-1β對于金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和聚蛋白多糖酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-motifs，ADAMTS）的產(chǎn)生起著重要的調(diào)節(jié)作用，MMPs和ADAMTS均是降解酶，可誘導(dǎo)軟骨降解[3]。在TNF-α、IL-1β等炎癥因子的作用下，核轉(zhuǎn)錄因子κB（nu-clearfactor κB，NF-κB）被激活，然后引起內(nèi)皮細(xì)胞釋放MMPs，通過旁分泌方式來影響軟骨細(xì)胞功能，最后通過降解軟骨的方式來加速骨關(guān)節(jié)炎的病理進展，也就是說激活NF-κB通路，誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨破壞[4]。IL-1β還可促進軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞合成并釋放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）產(chǎn)生強大的致痛作用[5]。此外，活化的炎癥細(xì)胞會產(chǎn)生、累積并釋放活性氧，啟動氧化應(yīng)激，進而促進MMPs釋放，加速軟骨細(xì)胞凋亡[6,7]。一般認(rèn)為TNF-α和IL-1β等炎癥因子主要通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路來影響關(guān)節(jié)軟骨降解。但研究發(fā)現(xiàn)，還有許多信號通路與關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)，提示當(dāng)阻斷NF-κB信號通路時，炎癥細(xì)胞因子也可通過其他通路釋放各種炎性介質(zhì)誘導(dǎo)軟骨破壞[8]。

2 信號通路在骨關(guān)節(jié)炎中的作用

研究表明，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中重要的信號通路包括NF-κB信號通路、MAPK信號通路、Notch信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等。NF-κB信號通路是重要的炎癥通路，可以被多種炎癥因子激活，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞釋放大量金屬蛋白酶、氧化酶和致痛因子，加速軟骨基質(zhì)的分解及軟骨細(xì)胞的凋亡[9]。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）信號通路在調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖凋亡和炎癥方面發(fā)揮重要作用，可被細(xì)胞炎癥因子激活，將細(xì)胞外信號傳至核內(nèi)，啟動相關(guān)基因的表達。Notch信號通路是一條進化高度保守的信號通路，其下游調(diào)節(jié)基因Hes1可以誘導(dǎo)炎癥因子表達，加速軟骨降解[10]。但也有研究顯示，激活Notch信號通路可使MMPs的表達下調(diào)，表明Notch信號通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11]。Wnt/β-catenin信號通路是經(jīng)典的Wnt信號通路，其中Wnt是一種糖蛋白，可激活下游效應(yīng)因子β-catenin。Wnt/β-catenin信號通路被激活后可引起軟骨細(xì)胞損傷，促進骨關(guān)節(jié)炎的進展。信號通路已成為骨關(guān)節(jié)炎近年來的熱點，堅信隨著越來越多因子和通路的作用機制逐步明確。必會給骨關(guān)節(jié)炎的防治帶來革命性的突破。

3 骨關(guān)節(jié)炎基因治療相關(guān)載體

3.1 腺病毒載體

腺病毒（adenovims）為DNA病毒，它可以感染各時相的細(xì)胞，不易與宿主基因發(fā)生整和，故被廣泛應(yīng)用于研究。但其缺點是表達時間短、容量小，使用其作為載體可能在體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，第三代腺病毒載體的產(chǎn)生解決了上述問題。Nixon等[12]采用小鼠和馬動物模型，首先體外構(gòu)建白介素-1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Rα）輔助依賴性腺病毒載體，關(guān)節(jié)腔注入輔助依賴腺病毒白介素-1受體拮抗劑（helper-dependent adenovirus- interleukin-1 receptor antagonist，HDAd- IL-1Ra）后，組織學(xué)檢測表明IL-1Ra基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后明顯減輕了滑膜的炎癥，減少了關(guān)節(jié)軟骨的損傷，說明IL-1Ra基因治療是治療關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)的一種可行的方法。Farrell等[13]體外將攜帶病毒白介素-10（virus- interleukin-10，vIL-10）靶基因的復(fù)制缺乏型腺病毒載體（adenovirus- interleukin-10，AdvIL-10）轉(zhuǎn)染至人間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC），AdvIL-10轉(zhuǎn)染的MSC與脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)后，ELISA法檢測表明巨噬細(xì)胞的TNF-α生成下降，說明vIL-10基因轉(zhuǎn)染后可以抑制炎癥。

3.2 腺相關(guān)病毒載體

腺相關(guān)病毒（adeno-associated vires，AAV）是一種DNA病毒，其物理性質(zhì)穩(wěn)定，能感染非增殖及增殖細(xì)胞，使用腺相關(guān)病毒作為基因載體很少在體內(nèi)引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，對人不致病，具有較高的安全性。但在實際運用上，AAV可攜帶目的基因的容量小，感染滴度低，對目的基因的選擇有一定限制。Hemphill等[14]體外實驗將表達胰島素樣生長因子Ⅰ（insulin-like growth factor Ⅰ，IGF-Ⅰ）基因的自身互補腺相關(guān)病毒載體（self-complimentary adeno-associated virus-IGF-Ⅰ，scAAVIGF-Ⅰ）轉(zhuǎn)染馬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，7d后取出標(biāo)本可以發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ表達提高，同時也明顯促進了Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的合成，說明scAAVIGF-Ⅰ具有較強的誘導(dǎo)軟骨修復(fù)的能力。Watson Levings等[15]實驗研究發(fā)現(xiàn)，自身互補腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的IL-1Ra轉(zhuǎn)染后，能在馬腕關(guān)節(jié)持續(xù)產(chǎn)生IL-1Ra、PGE2濃度明顯下降，組織學(xué)和影像學(xué)顯示滑膜炎和軟骨損壞得到改善。Rey-Rico等[16]應(yīng)用組織工程技術(shù)，將攜帶人的TGF-β靶基因的重組腺相關(guān)病毒載體（adeno- associated virus-human TGF-β，rAVV-hTGF-β），該聚合物膠束是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯在水中自組裝形成的一種膠體溶液，可以與藥物相溶解，增加了藥物的代謝穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)時間，也被認(rèn)為是一種較好的藥物輸送載體[17]。人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞與含有rAAV-hTGF-β的聚合物膠束共孵育后，ELISA法測定發(fā)現(xiàn)TGF-β表達水平明顯比自由載體組高。人軟骨缺損培養(yǎng)物與重組腺相關(guān)病毒/聚合物膠束共孵育，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，Ⅱ型膠原蛋白沉積也更多，說明組織工程技術(shù)與基因治療聯(lián)合應(yīng)用在提高目的基因的表達、延長目的基因的表達時間、延緩骨關(guān)節(jié)炎進展方面具有較大優(yōu)勢。

3.3 慢病毒載體

慢病毒（lentivirus，LV）為RNA病毒，其攜帶的遺傳物質(zhì)為RNA而不是DNA，是以人類免疫缺陷病毒1型為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，能感染增殖及非增殖細(xì)胞，其免疫性小，感染效率高，容納外源性目的基因片段大，感染滴度高，可長時間穩(wěn)定表達，是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要載體之一。但不利的是慢病毒可以插入到宿主的基因組中，可能引起宿主基因突變而致瘤[18]。Zhang等[19]應(yīng)用基因重組技術(shù)，將環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）沉默基因、聚集蛋白聚糖酶-1（aggrecanse-1）沉默基因和IGF-Ⅰ的表達基因重組到慢病毒載體中，產(chǎn)生的重組慢病毒感染人骨髓干細(xì)胞，7d后RT-PCR檢測表明COX-2和aggrecanse-1的mRNA表達明顯下降，IGF-Ⅰ的mRNA表達明顯上升。在猴交叉韌帶切除骨關(guān)節(jié)炎模型中重組慢病毒感染人骨髓干細(xì)胞注射至目標(biāo)關(guān)節(jié)，7d后提取關(guān)節(jié)滑液可以發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ濃度明顯升高，炎癥因子IL-1和致痛因子PGE2的濃度明顯降低，組織學(xué)檢測也表明COX-2沉默基因、aggrecanse-1沉默基因和IGF-Ⅰ表達基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后，避免骨膠原的丟失，促進了關(guān)節(jié)軟骨的合成。Gabner等[20]實驗研究證實了慢病毒介導(dǎo)的IL-1Ra基因轉(zhuǎn)染后，可明顯降低馬軟骨細(xì)胞的IL-1β、IL-6、MMPs水平，說明IL-1Ra基因治療是抑制炎癥反應(yīng)的一種有效的方法。

3.4 非病毒載體

由于病毒載體在基因治療過程中有較多缺點，如免疫原性、致癌作用、基因攜帶量較有限和病毒載體不能大規(guī)模生產(chǎn)等缺點，因此人們開始重視非病毒載體[21]。相比之下，非病毒載體免疫源性低，生物安全性高，基因攜帶量大，制備簡單，易于保存，但低轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后基因表達時間短很大程度上限制其廣泛使用[22]。目前常用的非病毒載體有陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物、化學(xué)聚合物、質(zhì)粒DNA、納米顆粒等。Jeong等[23]采用一種細(xì)胞核靶向聚乙烯亞胺-地塞米松聚合物作為基因遞送系統(tǒng)用于骨關(guān)節(jié)炎治療的研究，將聚乙烯亞胺-地塞米松聚合物與含有軟骨誘導(dǎo)因子性別決定區(qū)域Y相關(guān)高遷移率組框6（sex-determining region y-related high- mobility-group box 6，SOX6）和性別決定區(qū)域Y相關(guān)高遷移率組框9（sex-determining region y-related high-mobility-group box 9，SOX9）、血管生成素樣蛋白4短發(fā)夾RNA（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4shRNA）的微型環(huán)狀DNA質(zhì)粒（mini circle DNA）載體復(fù)合形成MC-9/6/shANG。研究表明，遞送MC-9/6/shANG至MSC和脂肪干細(xì)胞（adipose- derived stem cells，ADSC）后均明顯增加了SOX6和SOX9的表達，同時降低了脂肪干細(xì)胞ANGPTL4的表達。手術(shù)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)結(jié)果顯示，MC-9/6/shANG-tADSC轉(zhuǎn)染后的滑液中COX-2和MMP13明顯低于MC-9/6-tADSC組。在骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中關(guān)節(jié)內(nèi)注射MC-9/6/shANG可延緩骨關(guān)節(jié)炎進展。Watkins等[24]通過將負(fù)載白介素-10（interleukin- 10，IL-10）基因的DNA質(zhì)粒注入骨關(guān)節(jié)炎動物的關(guān)節(jié)內(nèi)，能使IL-10在動物體內(nèi)得到長效表達而產(chǎn)生抗炎效應(yīng)且沒顯示明顯不良反應(yīng)，為開展表達IL-10的DNA質(zhì)粒治療骨關(guān)節(jié)炎的臨床研究提供了理論基礎(chǔ)。Rim等[25]采用大鼠動物模型，首先體外構(gòu)建分別攜帶BMP2和TGF-β3的minicircle DNA質(zhì)粒載體，在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)至由人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞衍生的MSC中，分別在細(xì)胞團塊培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30d后分別將培養(yǎng)基中的生成的軟骨形成顆粒，植入到大鼠股骨髁的軟骨缺損中。8周后取出標(biāo)本后發(fā)現(xiàn)，在mcTGF-β3顆粒植入關(guān)節(jié)中的Ⅱ型膠原蛋白表達最高，mcBMP2顆粒植入關(guān)節(jié)中的Ⅰ和Ⅹ型膠原蛋白表達最高,均成功地填充了Ⅱ膠原蛋白的缺損區(qū)域。且研究還發(fā)現(xiàn)，mcBMP2轉(zhuǎn)染率偏低，也就是說雖然mcBMP2轉(zhuǎn)染少量細(xì)胞卻分泌了較高水平的軟骨生長因子。

3.5 非編碼RNA

非編碼RNA可能會影響骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展，其中包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）和小核仁RNA（snoRNA），雖然不編碼蛋白質(zhì)，但仍會影響基因表達。miRNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達，在軟骨細(xì)胞增殖凋亡、軟骨外基質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-27a-3p的上調(diào)可能抑制軟骨細(xì)胞中MAPK和NF-κB信號通路并最終減少ADAMTS-5的生成[26]。骨關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)外模型顯示，miRNA影響關(guān)節(jié)軟骨分解代謝的調(diào)節(jié)，但并非所有miRNA對骨關(guān)節(jié)炎均有正性保護作用，研究顯示，在人類骨關(guān)節(jié)炎模型中，miR-138-5p、miR-146a-5p、miR-335-5p和miR-9-5p的表達均明顯升高[27]。最近在骨關(guān)節(jié)炎組織中確定了一種新型的miR-4303靶標(biāo)Asporin（ASPN）[28]，其通過與各種生長因子結(jié)合降低其活性，影響軟骨的代謝，最終導(dǎo)致發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎[29]，因此，miRNA可作為潛在的輔助診斷標(biāo)志物，用于追蹤骨關(guān)節(jié)炎的病程，血清miRNA水平可作為骨關(guān)節(jié)炎早期診斷的敏感標(biāo)志物，有望成為骨關(guān)節(jié)炎早期診斷的新靶標(biāo)。

另一種非編碼RNA-lncRNA已成為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的重要調(diào)控分子。研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞中，lncRNA H19表達上調(diào)，并下調(diào)miR-140-5p表達，從而促進骨關(guān)節(jié)炎炎癥和軟骨降解的發(fā)展[30]。另有研究顯示[31]，高表達的LncRNA MALAT1可通過充當(dāng)“miRNA分子海綿”降低miR-150-5p有效性，干擾miR-150-5p介導(dǎo)靶基因AKT3下調(diào)，進而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果提示，在骨關(guān)節(jié)炎中l(wèi)ncRNA的部分促損傷作用可能是通過負(fù)向調(diào)控miRNA而實現(xiàn)，兩者可作為骨關(guān)節(jié)炎治療的靶標(biāo)，非編碼RNA參與基因表達，表明其可作為骨關(guān)節(jié)炎基因治療的新靶點。

4 骨關(guān)節(jié)炎基因治療的臨床試驗

2017年7月，首個骨關(guān)節(jié)炎基因治療產(chǎn)品Invossa在韓國問世[32,33]。目前，Invossa的Ⅲ期臨床試驗已在美國得以重啟。在近期一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，4例手骨關(guān)節(jié)炎患者被導(dǎo)入負(fù)載干擾素的AVV載體，其中3例患者不能耐受不良反應(yīng)而中途退出[34]。另一項Ⅰ期臨床試驗共納入9例膝骨關(guān)節(jié)炎患者，將負(fù)載IL-1Ra的AAV載體導(dǎo)入所有的患者后，沒有嚴(yán)重的不良反應(yīng)發(fā)生，證明其治療骨關(guān)節(jié)炎具有一定的臨床可行性和安全性。

5 總結(jié)與展望

骨關(guān)節(jié)炎是嚴(yán)重影響中老年人生活質(zhì)量的一種退行性疾病，目前臨床上還沒有用于有效預(yù)防及根治骨關(guān)節(jié)炎的藥物?；蛑委熆梢匝泳応P(guān)節(jié)炎癥并修復(fù)軟骨，但仍存在許多未解決的問題。相信隨著分子生物學(xué)和組織工程學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，骨關(guān)節(jié)炎的基因治療一定會顯現(xiàn)出更加光明的應(yīng)用前景。

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廣西壯族自治區(qū)青年岐黃學(xué)者培養(yǎng)項目（桂中醫(yī)藥科教發(fā)[2022]13號）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)一流學(xué)科建設(shè)開放課題（2019XK026）

孟林，電子信箱：14262618@qq.com

（2022–08–04）

（2022–09–10）

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1673–9701(2022)36–0112–04