徐賽賽， 曹亞兵， 曹喜兵， 董洋， 翟曉巧， 范國強

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省林業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450008)

9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)，能夠催化新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)氧化形成黃質(zhì)醛，是脫落酸(abscisic acid, ABA)生物合成過程中的關(guān)鍵限速酶[1]。該蛋白包含一個RPE65結(jié)構(gòu)域[2]。第一個NCED基因由TAN等[3]從玉米vp14突變體中鑒定得到。隨后，其同源基因在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)和棉花(Gossypiumhirsutum)等物種中被鑒定出來[4]。

近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)，NCED基因在植物響應(yīng)非生物和生物脅迫過程中具有重要作用。尹欣幸等[5]發(fā)現(xiàn)，低溫和干旱脅迫能誘導(dǎo)椰子NCED2表達，而鹽脅迫處理抑制其的表達；干旱脅迫能使西葫蘆CpNCED2表達量升高[6]；LI等[7]發(fā)現(xiàn)，白蠟FvNCED3在鹽和ABA脅迫下的表達量增加，而在高溫和低溫脅迫下降低；在患有潰瘍病的柑橘中，發(fā)現(xiàn)NCED在感病植株中的表達水平升高[8]；在茄鏈格孢感染的馬鈴薯中，發(fā)現(xiàn)NCED基因顯著下調(diào)[9]；同樣，在黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染后，甜瓜中大部分NCED基因的表達量下調(diào)[10]。此外，科研工作者發(fā)現(xiàn)NCED的表達升高能夠?qū)е聰M南芥[11]、水稻[12]和高粱[13]腋芽休眠，減少植株的分枝形成，但是，截至目前，有關(guān)NCED在泡桐叢枝病腋芽分化中的作用還未見報道。

白花泡桐原產(chǎn)于中國，是最重要的速生落葉喬木之一[14]。因具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值，現(xiàn)已報道在世界多個國家被引種[15-16]。然而，該樹易被植原體感染而發(fā)生叢枝病，造成腋芽叢生，葉片變黃，節(jié)間變短，生長速度減慢，成材質(zhì)量降低，嚴重影響泡桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[17-19]。前期，在泡桐-植原體相互作用方面，已有關(guān)于轉(zhuǎn)錄組[20]、ceRNA[21]和蛋白組[22]等方面的研究報道，并且發(fā)現(xiàn)PfNCED在植原體侵染后表達量顯著變化。因此，為進一步揭示PfNCED家族成員在叢枝病發(fā)生中的作用，本研究利用白花泡桐全基因組鑒定PfNCED家族，分析其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化、啟動子作用元件以及響應(yīng)植原體侵染的表達模式，并預(yù)測其蛋白互作網(wǎng)絡(luò)?；谝陨戏治?，篩選出白花泡桐中響應(yīng)叢枝植原體侵染的PfNCED。為闡明PfNCED在泡桐植原體侵染研究中的重要作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林木生物技術(shù)實驗室培養(yǎng)30 d的白花泡桐健康(healthyPaulowniafortunei, PF)和叢枝植原體感染的組培苗(P.fortuneiinfected with phytoplasmas, PFI)，材料的培養(yǎng)參考FAN等[23]的方法。

1.2 試驗方法

1.2.1 白花泡桐NCED基因的鑒定與理化性質(zhì)分析 白花泡桐全基因組數(shù)據(jù)下載自NCBI數(shù)據(jù)庫[19]。RPE65結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型下載自Pfam數(shù)據(jù)庫(https://pfam.xfam.org/)。擬南芥NCED基因家族的蛋白序列下載自TAIR數(shù)據(jù)庫(https:// www. arabidopsis.org)。本研究首先以RPE65結(jié)構(gòu)域模型為種子文件，采用HMMER 3.0程序[24]在白花泡桐所有蛋白序列中進行搜索，閾值設(shè)置為e<1e-5；然后以擬南芥NCED(A.thalianaNCED, AtNCED)蛋白序列作為種子序列，采用BLASTP程序在白花泡桐所有蛋白序列中以e<1e-5的閾值進行搜索。最后，將上述兩種方法獲得的結(jié)果進行分析，以確定PfNCED家族成員。本研究采用Pfam數(shù)據(jù)庫和CDD數(shù)據(jù)庫，對鑒定到的NCED家族成員進行結(jié)構(gòu)域驗證，并根據(jù)PfNCED在染色體上的位置對其進行命名。本研究將PfNCED的蛋白序列提交至ExPASy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/compute_pi/)[25]，預(yù)測PfNCED蛋白的理化性質(zhì)，并使用WoLFPSORT在線網(wǎng)站 (http://www.genscript.com/psort/ wolf_psort.htm l)進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2.2 白花泡桐NCED基因的進化樹、保守基序、和基因結(jié)構(gòu)分析 本研究使用ClustalW對PfNCED的蛋白序列進行序列比對，然后使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建進化樹[26]；使用在線軟件MEME(http://memesuite.org/tools/meme)進行保守基序鑒定[22]；根據(jù)白花泡桐基因組注釋文件對PfNCED的基因結(jié)構(gòu)進行分析。上述結(jié)果采用TBtools軟件進行可視化[27]。

1.2.3 白花泡桐NCED基因的染色體定位和共線性分析 本研究基于白花泡桐基因組信息采用TBtools軟件進行染色體定位分析，探索PfNCED基因家族成員間具有共線關(guān)系的基因?qū)?，鑒定共線基因?qū)﹂g的復(fù)制類型并計算其非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)。

1.2.4 白花泡桐NCED基因與其他物種間的進化樹和共線性分析 擬南芥基因組數(shù)據(jù)下載自TAIR數(shù)據(jù)庫，水稻NCED(OryzasativaNCED, OsNCED)氨基酸序列和基因組數(shù)據(jù)下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。采用MEGA 7.0[21]構(gòu)建進化樹；采用TBtools[28]進行共線性分析。

1.2.5 白花泡桐NCED基因的啟動子順式作用元件分析 本研究采用TBtools[23]提取PfNCED啟動子上游2 kb堿基序列作為啟動子區(qū)域，并采用Plant CARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行啟動子區(qū)域的順式作用元件預(yù)測[29]。

1.2.6 白花泡桐NCED基因響應(yīng)植原體侵染的表達模式分析 PF、PFI、利福平處理的PFI植物中PfNCED的RNA測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中下載(SRA登錄號SRR11787883, SRR11787894, SRR11787905, SRR11787912～SRR11787921, SRR11787925～SRR11787931, 和SRR11787935～SRR11787941)[19]。利用TBtools軟件[23]繪制PfNCED基因表達熱圖?；虮磉_的結(jié)果采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)進行驗證?？俁NA提取和qRT-PCR參照LIVAK等[30]的方法，以核糖體18SRNA為內(nèi)參基因，試驗進行3個生物學(xué)重復(fù)，相關(guān)引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The primers used for qRT-PCR

1.2.7 白花泡桐NCED蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析 基于白花泡桐與擬南芥間的同源性，本研究利用STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)[31]預(yù)測并構(gòu)建PfNCED蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/download.html)[32]對預(yù)測結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花泡桐NCED基因的鑒定與理化性質(zhì)分析

本研究共鑒定到28個PfNCED家族成員，根據(jù)它們在白花泡桐染色體上的位置信息依次命名為PfNCED1～PfNCED28(表2)。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，28個蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量在198～613個之間；相對分子質(zhì)量為22.1～67.9 kD；等電點為5.51～8.92，其中，10個PfNCED為堿性蛋白(pI >7)，18個PfNCED為酸性蛋白(pI<7);不穩(wěn)定系數(shù)為29.13～44.72。這一結(jié)果說明該家族成員中既有穩(wěn)定蛋白又有不穩(wěn)定蛋白；亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，PfNCED主要定位于葉綠體或細胞質(zhì)(表2)。

2.2 白花泡桐NCED基因的進化樹、保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)PfNCED家族成員之間的進化關(guān)系，本研究將28個PfNCED基因分成4組，其中Ⅰ組包含16個基因，Ⅱ組包含6個基因，Ⅲ組和Ⅳ組分別包含3個基因(圖1A)。

保守基序分析結(jié)果(圖1B)顯示，同一組內(nèi)的PfNCED具有類似的基序組成。在Ⅰ組中，除PfNCED4 和 PfNCED22外，其他成員均包含motif2、4、5和7～9，并且這些motif在各成員中具有固定的排列順序；在Ⅱ組中，除PfNCED2 和PfNCED16分別缺少motif2和motif5,其他基因的基序組成呈現(xiàn)motif1～9固定排列的規(guī)律；在Ⅲ組中，所有基因均包含motif3～6； Ⅳ組的所有基因均包含motif3、6、9。保守基序分析結(jié)果顯示PfNCED的基序組成在各組內(nèi)具有高度的保守性，各組間又存在一定的差異，表明PfNCED家族在進化過程中可能發(fā)生了功能分化。

表2 白花泡桐NCED基因家族成員信息Table 2 Information of NCED gene family member in P. fortunei

A：基于PfNCED氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；B：PfNCED的基因結(jié)構(gòu)； C：PfNCED的保守基序，底部的刻度尺單位為aa，表示蛋白質(zhì)的長度。 A: Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of PfNCEDs; B: The exon-intron structure of PfNCEDs; C: The motif composition of PfNCEDs, and the bottom scale unit is aa, showing the protein length.圖1 PfNCED的進化樹、保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Phylogenetic analysis, conserved motifs and gene structure of PfNCEDs

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示(圖1C)，28個PfNCED基因中只有8個基因包含UTR，表明PfNCED基因功能間可能存在差異；PfNCED基因中內(nèi)含子的數(shù)量在0至13之間，其中PfNCED8、PfNCED12、PfNCED15、PfNCED22和PfNCED25沒有內(nèi)含子，PfNCED2有13個內(nèi)含子，是所有PfNCED中內(nèi)含子最多的。在Ⅲ組和Ⅳ組中，PfNCED不僅沒有UTR，而且含有較多的內(nèi)含子，暗示這些基因在轉(zhuǎn)錄過程中可能不穩(wěn)定。

2.3 白花泡桐NCED基因的染色體定位與共線性分析

染色體定位分析顯示28個PfNCED基因中的25個被定位到8條染色體上，其余3個PfNCED基因被定位到未組裝的骨架上(圖2)。PfNCED基因在染色體上的分布比較集中，具體表現(xiàn)為 7號和18號染色體上均有8個PfNCED，并且主要分布于染色體的兩端。共線性分析(圖2)結(jié)果表明，白花泡桐基因組中的PfNCED基因發(fā)生了5次基因復(fù)制事件，并且均為片段復(fù)制，片段復(fù)制事件可能在PfNCED家族的擴張過程中發(fā)揮重要作用。Ka/Ks值為選擇系數(shù)，可以反映生物的進化趨勢，當Ka/Ks>1，Ka/Ks=1和Ka/Ks<1分別代表在進化過程中基因承受正向選擇、中性選擇和純化選擇[33]。PfNCED家族中所有參與復(fù)制事件的基因?qū)a/Ks值均小于1(表3)，表明在PfNCED家族進化過程中發(fā)生了較強的純化選擇。

2.4 白花泡桐NCED基因與其他物種間的進化樹和共線性分析

為探究PfNCED的進化關(guān)系，本研究選擇AtNCED和OsNCED基因與PfNCED構(gòu)建進化樹。進化樹根據(jù)聚類結(jié)果被分為四組(Ⅰ～Ⅳ組, 圖3)。復(fù)制基因?qū)fNCED12/PfNCED16、PfNCED13/PfNCED15與AtNCED3聚類在Ⅰ組中的同一分枝，暗示它們可能與AtNCED3具有相似的功能，此外，在Ⅰ組中PfNCED2和PfNCED25分別與AtNCED1和AtNCED6聚類在同一分枝；復(fù)制基因?qū)fNCED11/PfNCED17與AtNCED8聚類在Ⅱ組中的同一分枝，表明它們可能與AtNCED8具有相似的功能；PfNCED24與AtNCED4聚類在Ⅲ組中的同一分枝，表明二者功能相近；Ⅳ組中只包含15個PfNCED，表明該組中的PfNCED與AtNCED和OsNCED的進化距離較遠。

圖2 PfNCED的染色體分布及家族成員間的共線性分析Fig.2 Chromosomal distribution and colinearity analysis of PfNCEDs

表3 PfNCED基因進化選擇壓分析Table 3 Analysis of evolutionary selection pressure of PfNCED genes

本研究分別分析了PfNCED與AtNCED(圖4A)、PfNCED與OsNCED(圖4B)的共線性關(guān)系。結(jié)果顯示，在白花泡桐與擬南芥的共線性關(guān)系中，有10個PfNCED參與形成12個復(fù)制基因?qū)?；在白花泡桐與水稻的共線關(guān)系中，有7個PfNCED參與形成9個復(fù)制基因?qū)?。該結(jié)果表明，與OsNCED相比，PfNCED與AtNCED的共線關(guān)系更密切。

2.5 白花泡桐NCED基因啟動子順式作用元件分析

為了進一步探究PfNCED的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，本研究對PfNCED啟動子順式作用元件進行分析。結(jié)果顯示，PfNCED的啟動子區(qū)域包含光響應(yīng)、植物激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)的順式作用元件和參與調(diào)控植物生長過程的順式作用元件(圖5)。68%的PfNCED啟動子區(qū)域含有茉莉酸甲酯或水楊酸響應(yīng)順式作用元件，79%的PfNCED啟動子區(qū)域含有脫落酸響應(yīng)順式作用元件。其中，PfNCED2包含生長素、脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件；PfNCED5包含脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件；PfNCED13包含脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件；PfNCED16包含生長素、赤霉素和脫落酸響應(yīng)順式作用元件；PfNCED23包含脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件；PfNCED24包含生長素、赤霉素、脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件；PfNCED28包含生長素、赤霉素、脫落酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件。推測這部分PfNCED基因主要參與脫落酸、茉莉酸甲酯或水楊酸調(diào)控通路。

圖3 白花泡桐、擬南芥、水稻NCED蛋白的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the NCED proteins of P. fortunei, A. thaliana and rice

注：不同物種基因?qū)Φ墓簿€關(guān)系用灰色線表示，PfNCED與其他基因的共線關(guān)系顯示為紅線。 A：PfNCED基因與AtNCED基因的共線性分析；B：PfNCED基因與OsNCED的共線性分析。Note: The collinear relationship of gene pairs in different species was shown with the gray lines. The collinear relationship of PfNCEDs with other genes was shown with the red lines. A: Colinearity analysis of PfNCED genes with AtNCED genes; B: Colinearity analysis of PfNCED genes with OsNCED genes.圖4 PfNCED與AtNCED、PfNCED與OsNCED間的共線性分析Fig.4 Colinearity analysis between PfNCED and AtNCED, PfNCED and OsNCED

2.6 白花泡桐NCED基因響應(yīng)植原體侵染的表達模式分析

本研究在泡桐叢枝病發(fā)病模擬系統(tǒng)的基礎(chǔ)上[34]，通過分析PfNCED基因在植原體侵染前后的轉(zhuǎn)錄組表達情況，發(fā)現(xiàn)28個PfNCED中有7個基因在PFI/PF差異顯著，其中，PfNCED2、PfNCED5和PfNCED24表達顯著上調(diào)，PfNCED13、PfNCED16、PfNCED23和PfNCED28表達顯著下調(diào)(圖6 A)。進一步分析了這7個PfNCED在30、100 mg·L-1利福平處理和30 mg·L-1利福平處理后恢復(fù)幼苗中的表達模式(圖6 B)，發(fā)現(xiàn)PfNCED13、PfNCED16和PfNCED28的表達模式與泡桐叢枝病模擬系統(tǒng)中形態(tài)變化趨勢一致，因此，推測這3個基因在泡桐叢枝病發(fā)生過程中可能具有重要作用。

圖5 PfNCED基因啟動子區(qū)域的順式作用元件分析Fig.5 Cis-acting elements analysis in the promoter regions of PfNCED genes

為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)，本研究隨機選擇5個PfNCED基因采用qRT-PCR方法分析了其在PF和PFI中的表達水平 (圖6C)。qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq結(jié)果一致，證明了RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性。

2.7 白花泡桐NCED蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測分析

為了進一步探究PfNCED的功能，本研究基于PfNCED與AtNCED的高度同源性，預(yù)測了PfNCED的互作蛋白(圖7)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PfNCED 16與PfNCED 1可能有互作關(guān)系； PfNCED1/11/16/25均與MAX2具有互作關(guān)系；PfNCED1還與MEE3、D27和CYP711A1具有互作關(guān)系。在擬南芥中，CYP711A1和MAX2已被證明可以抑制腋芽的形成，而D27在調(diào)節(jié)分生組織形成[35-37]中發(fā)揮重要作用。因此，本研究推測PfNCED1/11/16/24/25可能調(diào)控腋芽的形成。進一步結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)PfNCED16可能與泡桐叢枝病腋芽叢生相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

泡桐叢枝病是由植原體侵染引起的病害，嚴重影響感病泡桐的生長速度和木材質(zhì)量，制約泡桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[38]。近年來，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與泡桐叢枝病發(fā)生相關(guān)的基因[21]，但是未見PfNCED基因家族的相關(guān)報道。為探究該家族基因響應(yīng)叢枝植原體侵染的表達模式，預(yù)測其在叢枝病發(fā)生中的作用。本研究進行了生物信息學(xué)分析，在白花泡桐中共鑒定到28個PfNCED基因，比棉花(23個)[4]、煙草(18個)[39]、葡萄(12個)[40]等物種的NCED基因數(shù)量明顯增加，推測在物種進化過程中PfNCED家族的擴張速度較快。同時發(fā)現(xiàn)PfNCED家族進化過程中共發(fā)生5次片段復(fù)制，通過計算復(fù)制基因?qū)﹂g的Ka/Ks值，發(fā)現(xiàn)該家族在進化過程中經(jīng)歷純化選擇。最后，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白互作分析，推測PfNCED16可能參與調(diào)控腋芽形成。

CANNON等[41]發(fā)現(xiàn)片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)是植物基因家族擴張和進化的主要原因，同源基因的序列、結(jié)構(gòu)和表達的變化是功能分化的主要特征[42-44]。PRIYA等[45]通過比較48種植物的93個NCED基因發(fā)現(xiàn)，基因復(fù)制、功能分化和外顯子內(nèi)含子丟失事件促進了NCED家族進化。本研究中，PfNCED家族在進化過程中發(fā)生5次片段復(fù)制事件，且復(fù)制基因?qū)χg在基因結(jié)構(gòu)、編碼氨基酸數(shù)量和響應(yīng)植物原體感染的表達模式上有不同程度的差異，其中，PfNCED13/PfNCED15在基因結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，PfNCED6/PfNCED22編碼蛋白的氨基酸個數(shù)存在顯著差異，PfNCED12/PfNCED16的表達模式存在顯著差異，推測該家族在進化過程中可能發(fā)生了功能分化。

A：PfNCED基因在PF、PFI和Rif處理幼苗中的表達量；B：PF/PFI中顯著差異表達基因在30 mg·L-1Rif處理的PFI中的表達水平變化趨勢， 1: PFIL30-5, 2: PFIL30-10, 3: PFIL30-15, 4: PF, 5: PFIL30R-10, 6: PFIL30R-20；C：qRT-PCR驗證結(jié)果。*表示P<0.05。 A: PfNCED genes expression in PF,PFI and Rif-treated PFI; B: The variation trend of differentially expressed genes in PF/PFI expression levels in 30 mg·L-1 Rif-treated PFI, 1: PFIL30-5, 2: PFIL30-10, 3: PFIL30-15, 4: PF, 5: PFIL30R-10, 6: PFIL30R-20; C: Results of qRT-PCR validation. * means P<0.05.圖6 PfNCED基因的表達模式分析Fig.6 Expression pattern analysis of PfNCED genes

圖7 蛋白質(zhì)間的相互作用分析Fig.7 The analysis of protein-protein interaction

已有報道表明NCED參與調(diào)節(jié)植物腋芽的形成。水稻過表達OsNCED1的轉(zhuǎn)基因株系中，植株分蘗減少[8]。擬南芥AtNCED3缺失突變體植株表現(xiàn)為腋芽增多[46]。本研究中發(fā)現(xiàn)PfNCED16與AtNCED3的同源性為66%，根據(jù)其在PFI和利福平處理的PFI中的表達模式以及蛋白互作預(yù)測結(jié)果，推測PfNCED16可能參與調(diào)控白花泡桐的腋芽形成。

本研究采用生物信息學(xué)方法對白花泡桐NCED基因家族成員進行鑒定和分析，共鑒定到28個NCED基因，結(jié)合泡桐叢枝病發(fā)生過程中NCED基因表達量的變化分析，最終發(fā)現(xiàn)7個PfNCED基因可能與泡桐叢枝病發(fā)生密切相關(guān)，其中PfNCED16可能參與調(diào)控分枝形成，其具體的功能可進一步通過轉(zhuǎn)基因進行驗證。