王娜，高恩光，李娜,4，劉情情， 王凡，任紅濤，李正邦，余秋穎

(1.河南農業(yè)大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450046； 3.鄭州市營養(yǎng)與健康食品重點實驗室，河南 鄭州 450002；4.河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司， 河南 漯河 462000；5.正陽新地花生集團，河南 駐馬店 463600)

白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種生物活性很強的天然多酚類物質，廣泛存在于多種植物中，在葡萄、虎杖、花生和桑葚中含量豐富[1]，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌及保護胃腸道和神經系統(tǒng)等作用，現(xiàn)已被美國、日本、加拿大等國家列為保健品[2-5]。SANTOS等[6]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過調節(jié)信號通路降低活性氧水平產生抗氧化效果。吳海峰等[7]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有改善人顆粒細胞氧化應激損傷的作用。維生素E是一種很強的抗氧化劑，具有多種生物活性，體外攝入是其唯一來源，自然界中主要存在于干果和植物油中[8-10]。維生素E同樣具有抗氧化、抗炎、神經保護、降低膽固醇和保護肝臟等特性[11-15]。LLORET等[16]研究證明，維生素E有助于保持人類大腦健康。JI等[17]研究發(fā)現(xiàn)，維生素E可以降低非酒精性肝炎患者中丙氨酸氨基轉移酶水平，臨床療效較好。協(xié)同效應是指將多種活性因子聯(lián)合使用后產生比單一組分更優(yōu)的功能效果，這種“1+1>2”的現(xiàn)象激起了人們極大的興趣[18]。飲食對人的健康起決定作用，食物不僅能為人類生命活動提供能量,而且食物中存在的天然活性成分具有特殊的生理功能，對機體健康平衡具有調節(jié)功效[19]。食物基質本身十分復雜，其中活性成分的協(xié)同效應是非常重要的方面。但是，協(xié)同效應的機制研究尚顯不足，相關的基礎數(shù)據比較缺乏，因此已經成為現(xiàn)代營養(yǎng)學的重要研究內容和熱點。唐煜括等[20]研究證實了茶多酚與維生素C以特定比例混合后具有協(xié)同抗氧化作用。李星亞等[21]證實了茶多糖與茶多酚以一定比例復配具有較好的降血糖協(xié)同防治作用。目前，相關研究主要以茶多酚為主，且與其協(xié)同物質以維生素C和多糖居多，同時關于白藜蘆醇和維生素E的研究均以單一物質研究為主，對兩者的聯(lián)合使用鮮有報道。因此，本研究選用白藜蘆醇聯(lián)合維生素E探討其體外抗氧化能力的協(xié)同效果，為未來聚焦活性營養(yǎng)成分、靶向功能食品的科學合理開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料及試劑 白藜蘆醇、維生素E購自北京索萊寶(中國)公司，分析純；二苯基苦基苯肼(diphenylpicrylhydrazyl，DPPH)檢測試劑盒、2,2’-偶氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨(ABTS)檢測試劑盒購自南京建成(中國)公司；特丁基對苯二酚(tertiary butyl hydroquinonentrd，TBHQ)購自上海麥克林(中國)公司。雙蒸水自制，其他試劑均為市售，分析純。

1.1.2 主要儀器與設備 UV-2000紫外分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)；DK-600型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；移液槍(德國eppendorf公司)；冷凍離心機(美國Thermo公司)；多功能酶標儀(德國BMG LABTECH公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 體外抗氧化能力評價試驗組設計 試驗共分為5組，分別為單一使用RES組(白藜蘆醇0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1)、VE組(維生素E 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1)、陽性對照TBHQ組(TBHQ 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1)以及聯(lián)合使用DARV組和ARV組。其中，DARV組是指RES與維生素E按照物質的量1∶1聯(lián)合后加入溶劑體系，終質量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g·L-1；ARV組是指DARV組的半劑量組。

1.2.2 不同試驗組抗氧化能力指標評價 ①DPPH自由基清除能力的測定。按照DPPH自由基(DPPH·)清除能力試劑盒說明書，測定1.2.1試驗組樣品DPPH·清除能力。

DPPH·清除率計算公式為：

(1)

式中：D表示DPPH清除率；A2表示樣品測定管的吸光度值；A1表示對照管的吸光度值；A0表示空白管的吸光度值。

②ABTS+·清除能力的測定。按照ABTS法試劑盒說明書，測定1.2.1試驗組樣品ABTS+·清除能力。

ABTS+·清除率計算公式為：

(2)

式中：T表示ABTS+·清除率；A3為空白吸光度(蒸餾水)值；A4表示樣品吸光度值。

③還原力的測定。參照AK等[22]的方法，采用鐵氰化鉀還原法，700 nm處測定1.2.1試驗組樣品吸光度值。

④鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)測定。參照賈仕杰等[23]和BENZIE等[24]的方法，在1.2.1試驗組樣品中分別加入FRAP工作液，根據吸光度值大小分析其FRAP值即總抗氧化能力強弱。

1.2.3 不同試驗組自由基清除能力評價 為了更好比較不同樣品抗氧化活性的強弱，參照艾志錄等[25]的方法，根據1.2.1試驗組樣品對自由基的清除率和質量濃度作劑量效應關系曲線，計算半數(shù)清除率IC50值。IC50值越大代表其清除自由基的能力越小。

1.2.4 RES和維生素E聯(lián)合作用中效原理定量分析 采用中效原理聯(lián)合作用指數(shù)(combination index，CI)，以DPPH·清除率為指標，對RES和維生素E聯(lián)合作用測得的抗氧化能力進行比較。單一物質的質量濃度選擇在線性范圍內較低質量濃度(清除率小于30%)，使加和值小于70%[26]。為滿足上述復配原則，RES和維生素E按照物質的量1∶1聯(lián)合后終質量濃度選擇0.02、0.04、0.06 g·L-1，體積比例為7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，然后按照1.2.2的方法，測定聯(lián)合作用的DPPH·清除活性。

CI計算公式如下[27]：

式中：d1為藥物1和藥物2聯(lián)合作用抑制率為50%時藥物1的作用質量濃度；d2為藥物1和藥物2聯(lián)合作用抑制率為50%時藥物2的作用質量濃度；Dx,1為藥物1單獨作用時的作用抑制率為50%時的作用質量濃度；Dx,2為藥物2單獨作用時的作用抑制率為50%時的作用質量濃度。

計算采用95%置信區(qū)間。0.951.05表明藥物1和藥物2為拮抗作用。

1.2.5 數(shù)據分析 試驗設3次平行取平均值。利用SPSS Statistics 22.0對數(shù)據分析統(tǒng)計、用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 RES和維生素E單一及聯(lián)合使用體外抗氧化能力比較分析

2.1.1 對DPPH·的清除率比較分析 由圖1可知，在一定范圍內，不同試驗組清除DPPH·呈現(xiàn)一定的量效關系，即隨質量濃度增大，對DPPH·的清除效果增加。當質量濃度為0.6 g·L-1，不同試驗組對DPPH·清除率都達到90%以上；同質量濃度下RES組的抗氧化活性高于VE組，故在ARV組和DARV組的組合中，RES作為主抗氧化劑發(fā)揮作用，維生素E作為輔抗氧化劑發(fā)揮作用。當質量濃度小于0.3 g·L-1時，抗氧化物質對DPPH·清除效果為DARV組>TBHQ組>RES組>ARV組>VE組；當質量濃度大于0.3 g·L-1時，DPPH·清除效果為DARV組>TBHQ組>ARV組>RES組>VE組。這可能是因為隨著維生素E有效質量濃度的增高，RES和維生素E修復再生，使得ARV組中有效質量濃度得到增加，所以此時ARV組的清除率高于單種樣液。

2.1.2 對ABTS+·清除率比較分析 由圖2可知，在一定范圍內，RES組、ARV組、DARV組和TBHQ組清除ABTS+·的效果都具有劑量效應，且DARV組的清除率高于TBHQ組，最高能夠達到90%以上，清除效果最好。在質量濃度低于0.3 g·L-1時，對ABTS+·的清除效果為DARV組>ARV組>RES組>TBHQ組>VE組；在質量濃度高于0.3 g·L-1時，對ABTS+·的清除效果為DARV組>TBHQ組>ARV組>RES組>VE組。RES和維生素E聯(lián)合使用的DARV組、ARV組的ABTS+·清除率呈現(xiàn)出顯著協(xié)同作用，DARV組、ARV組的協(xié)同作用可能存在1個平衡質量濃度，在一定質量濃度下會具有明顯的抗氧化協(xié)同增效作用。

圖2 RES和維生素E單一及聯(lián)合使用對 ABTS+·的清除效果Fig.2 Clearance effect of RES and VE alone and in combination on ABTS+·

2.1.3 對還原力比較分析 圖3可知，不同試驗組均具有一定的還原力，且還原力與其質量濃度呈線性正相關[28]。質量濃度小于0.1 g·L-1時，還原力TBHQ組>DARV組>RES組>ARV組>VE組；質量濃度大于0.1 g·L-1時，DARV組>TBHQ組>ARV組>RES組>VE組。RES和維生素E聯(lián)合作用的ARV組的還原力呈增長趨勢，DARV組的還原力顯著提高，可能是因為RES與維生素E聯(lián)合之后，兩者自身的還原作用增強，給出更多電子用于清除自由基。

2.1.4 對總抗氧化能力比較分析 圖4可知，質量濃度低于0.5 g·L-1時，TBHQ組>DARV組>RES組>ARV組>VE組，質量濃度大于0.5 g·L-1時，TBHQ組>DARV組>ARV組>RES組>VE組。RES組、VE組、ARV組、DARV組和TBHQ組的FRAP值隨著質量濃度的增大，吸光度呈現(xiàn)增長趨勢，且DARV組和TBHQ組增長最為迅速，說明質量濃度越高總抗氧化能力越強。這可能與RES和維生素E的結構以及反應機制等因素有關。由于不同抗氧化物質提供氫的羥基位置不同，其活潑程度不同，有效作用于自由基的種類有別，導致各抗氧化劑的性能不同[29]。

虛線表示此質量濃度下樣品吸光度值已經超過 線性準確范圍，僅以虛線表示趨勢。 The red dotted lines indicated that the absorbance value of the sample exceeds the linear accuracy range at this concentration.圖3 RES和維生素E單一及聯(lián)合使用對還原力的作用Fig.3 Clearance effect of RES and VE alone and in combination on eduction capacity

樣品質量濃度為0.02、0.04、0.06和0.08 g·L-1時， 總抗氧化能力的吸光度值未有效測出，均記為0。 When the sample mass concentration was less than 0.1 g·L-1, the absorbance value of the total antioxidant capacity of FRAP was not measured and was recorded as 0.圖4 RES和維生素E單一及聯(lián)合使用對 總抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of RES and VE alone and in combination on FRAP value of total antioxidant capacity

2.2 RES和維生素E單一及聯(lián)合使用自由基清除能力比較分析

根據不同試驗組對自由基的清除率和質量濃度作劑量效應關系曲線，計算IC50值并進行比較分析自由基清除能力，結果如表1。DPPH·清除能力為DARV組>TBHQ組>RES組>ARV組>VE組，且RES組、VE組與ARV組、DARV組之間呈現(xiàn)顯著性關系, DARV組比單一組分RES組和VE組的IC50值分別顯著降低2/3和1/11；ABTS+·清除能力為DARV組>ARV組>RES組>TBHQ組>VE組；還原力大小為TBHQ組>DARV組>RES組>ARV組>VE組，且RES組、VE組、ARV組、DARV組和TBHQ組都具有顯著性差異(P<0.05)，DARV組比單一組分RES組和VE組的IC50值分別顯著降低5/9和25/32，還原力中DARV組比單一組分RES組和VE組的IC50值分別顯著降低1/2和5/18；FRAP值大小為TBHQ組>DARV組>RES組>ARV組>VE組，且DARV組與RES組、VE組、ARV組和TBHQ組具有顯著性差異，DARV組比單一組分RES組和VE組的IC50值分別顯著降低5/12和10/47。由IC50值可知，RES和維生素E聯(lián)合后DARV組的IC50值顯著降低，抗氧化活性呈現(xiàn)出一定的正協(xié)同作用，且聯(lián)合后其抗氧化能力與人工合成抗氧化劑TBHQ相比效果顯著。

表1 RES和維生素E單一及聯(lián)合使用抗氧化活性IC50值比較Table 1 Comparison of IC50 value of the antioxidant activity of RES and VE alone and in combination g·L-1

2.3 RES與維生素E不同劑量對協(xié)同作用的影響

以DPPH的清除率為指標，定量分析RES和維生素E不同體積比例和終質量濃度對協(xié)同作用的影響，結果如表2。在RES與維生素E聯(lián)合終質量濃度為0.02、0.04、0.06 g·L-1時，RES與維生素E的協(xié)同效應隨著質量濃度的增加而增強；不同質量濃度相同體積比例之間，對DPPH 的清除率差異性顯著；V(RES)∶V(維生素E)= 3∶1時，兩者的協(xié)同效應最強；抗氧化能力為DARV組>ARV組≥RES組>VE組，說明RES作為主劑發(fā)揮作用，維生素E作為輔劑發(fā)揮作用，并使得DARV組中主-輔劑呈現(xiàn)明顯的正協(xié)同作用。

2.4 RES與維生素E不同體積比例下協(xié)同抗氧化能力的比較

利用中效原理定量分析和IC50值，研究在RES聯(lián)合維生素E終質量濃度為0.02、0.04、0.06 g·L-1時不同體積比例對協(xié)同作用的影響，結果如表3。RES和維生素E體積比例不同其抗氧化效應不同。當V(RES)∶V(維生素E)=1∶2～1∶3，協(xié)同氧化能力表現(xiàn)為相加作用(0.95

表2 RES與維生素E體積比例對協(xié)同作用影響的研究Table 2 Study on the influence of the ratio of RES and VE on the synergy

續(xù)表Continuing table

表3 RES與維生素E不同體積比例對抗氧化 協(xié)同作用的影響Table 3 Effect of different ratios of RES and VE on anti-oxidation synergism

3 結論與討論

白藜蘆醇和維生素E作為藥食同源食物原料中重要的抗氧化物質，都具有清除體內自由基、抗氧化和抗衰老的功效。本研究發(fā)現(xiàn)，在DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、還原力大小和總抗氧化能力能力上，白藜蘆醇聯(lián)合維生素E后均具有顯著的協(xié)同增效作用，兩者的正協(xié)同效應與抗氧化物質質量濃度的高低、自身的抗氧化能力呈正相關。其中，在對DPPH·的清除作用上，無論質量濃度高低，二者均有協(xié)同增效作用，尤其RES與維生素E按照物質的量1∶1聯(lián)合后(DARV組)的抗氧化效果最為顯著；在ABTS+·清除體系上，RES與維生素E按照物質的量1∶1聯(lián)合(DARV組)以及DARV組半劑量組(ARV組)均具有顯著的協(xié)同增效作用，且試驗質量濃度范圍內，DARV組>ARV組>RES組>VE組；在對還原力進行評價時發(fā)現(xiàn)，RES聯(lián)合生素E作用后ARV組的還原力呈增長趨勢，DARV組的還原力顯著提高；在總抗氧化能力評價體系中，RES組、VE組、ARV組、DARV組和TBHQ組的FRAP值隨著質量濃度的增大，吸光度呈現(xiàn)增長趨勢，且DARV組增長最為迅速。白藜蘆醇和維生素E聯(lián)合互作產生的協(xié)同效應可能因評價體系不同而產生不同的結果，這是由于不同抗氧化物質提供氫的羥基位置不同，其活潑程度不同，有效作用于自由基的種類有別，各抗氧化劑的性能也不同[29]。

本研究也發(fā)現(xiàn)，以半數(shù)清除率IC50值作為衡量指標時，在FRAP值和還原力對應的IC50值大小順序均為TBHQ組>DARV組>RES組>ARV組>VE組，DARV組比單一組分RES組和VE組的IC50值分別顯著降低5/12和10/47；DPPH·清除能力對應的IC50值為DARV組>TBHQ組>RES組>ARV組>VE組，DARV組比單一組分RES組和VE組的IC50值分別顯著降低2/3和1/11；ABTS+·清除能力對應的IC50值為DARV組>ARV組>RES組>TBHQ組>VE組，DARV組比單一組分RES組和VE組的IC50值分別顯著降低5/9和25/32，表明其清除自由基的種類有別；RES與維生素E聯(lián)合后的IC50值顯著小于單一組分(CI<0.95)，表明白藜蘆醇和維生素E聯(lián)合后呈現(xiàn)出協(xié)同抗氧化作用，比各組分單一使用時具有更好的抗氧化效果。白藜蘆醇是一種多酚類物質，多酚類物質具有兩親性，既溶于水相，也溶于油相，其氧化還原電位介于維生素之間，這種獨特的物化性質使多酚與維生素類抗氧化劑之間具有良好的協(xié)同效應[30]。RES與維生素E聯(lián)合之后，兩者自身的還原作用增強，給出更多電子用于清除自由基，這也賦予了白藜蘆醇和維生素E聯(lián)合后具有顯著的協(xié)同增效作用。

本研究利用中效原理定量分析發(fā)現(xiàn)，當V(RES)∶V(維生素E)= 1∶1～7∶1之間具有良好的協(xié)同效果(CI<0.95)，當V(RES)∶V(維生素E)=3∶1時CI值最小，且此時IC50值也最小，為0.011 g·L-1，故當V(RES)∶V(維生素E)=3∶1時具有最佳的協(xié)同抗氧化作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，同質量濃度下RES組的抗氧化活性高于VE組，故在ARV和DARV的組合中，RES作為主抗氧化劑發(fā)揮作用，維生素E作為輔抗氧化劑發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，復合抗氧化劑具有修復再生的作用，輔劑可以再生具有強抗氧化性能的氧化劑，從而表現(xiàn)出抗氧化協(xié)同作用[31-32]。在本研究中，DARV組的清除率始終最高，說明RES聯(lián)合維生素E的清除率效果與樣品質量濃度呈正相關。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和維生素E聯(lián)合使用比單一組分有更好的功能效果，具有顯著的抗氧化協(xié)同增效作用。