方 天， 何 玲， 尹德晶， 岳 筠， 朱二鵬，3， 文 明，3， 程振濤,3

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽(yáng)550008；3.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025)

安卡拉病是由安卡拉病毒感染引起的一種禽類高發(fā)病，最早發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦卡拉奇周圍區(qū)域。該病毒又稱禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4)，雞感染后的特征性病變?yōu)樾陌e液-肝炎綜合征(Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)[1]。2013年國(guó)內(nèi)FAdV-4的感染病例開始增多，2015年疫情迅速蔓延，在中國(guó)吉林、江蘇、山東等東部地區(qū)均有發(fā)生[2-3]。貴州省于2016年首次報(bào)道此病[4]，隨后多地呈現(xiàn)局部流行。3～5周齡的肉雞最為易感，發(fā)病后死亡率為30%～70%，感染雞的日齡越大則死亡率越低[5]。安卡拉病可通過(guò)水平傳播和垂直傳播2種方式感染健康雞[6]，F(xiàn)AdV-4能在糞便、鼻氣管黏膜和腎臟中存活較長(zhǎng)時(shí)間，其在糞便中載毒量最高，表明FAdV-4水平傳播的主要途徑為糞-口傳播，其次為短距離的飛沫傳播，垂直傳播則是通過(guò)種蛋、雞胚等途徑傳播。FAdV-4也可與該屬其他血清型病毒混合感染導(dǎo)致禽類發(fā)病[7]；FAdV-4與具有免疫抑制特性的病毒(如傳染性法氏囊病病毒)混合感染禽類時(shí)，引起的死亡率會(huì)進(jìn)一步升高[8]。

FAdV-4為雙股線狀的DNA病毒，無(wú)囊膜，其結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)主要包括Penton五鄰體蛋白、Hexon六鄰體蛋白以及Fiber1纖突蛋白、Fiber2纖突蛋白。Hexon蛋白構(gòu)成病毒粒子的面，Penton蛋白構(gòu)成頂，F(xiàn)iber1和Fiber2纖突蛋白則位于病毒粒子表面[9]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)iber2蛋白具有良好的免疫原性，在介導(dǎo)FAdV-4感染宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，有效刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫[10]。本研究擬通過(guò)對(duì)FAdV-4貴州株(GZ-QL)Fiber2基因進(jìn)行克隆與生物信息學(xué)分析，了解FAdV-4貴州株Fiber2基因的遺傳變異情況，明確Fiber2蛋白相關(guān)生物學(xué)特點(diǎn)，為深入解析該蛋白的功能及新型疫苗研制提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 主要毒株

GZ-QL和DH-5α菌株均由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

酵母粉、胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；2×TaqPCR MasterMix、2 000 bp DNA marker、5 000 bp DNA marker、pMD19-T載體、DNA限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XbaI均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA基因組小量提取試劑盒、E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、E.Z.N.A.TM Plasmid Kit質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司。

1.3 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2基因擴(kuò)增

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI基因庫(kù)中已公布的FAdV-4經(jīng)典株ON1的基因序列(登錄號(hào)：GU188428)，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)包含F(xiàn)iber2全基因序列的特異性引物。Fiber2-F：5′-TCCTATCCCTTTTTCCTATCAG-3′；Fiber2-R：5′-GTTTTTAGAAAGCGTAAATCTGTTG-3′，預(yù)擴(kuò)增片段的大小為1 425 bp。

1.3.2 基因組DNA的提取 將病毒培養(yǎng)物分裝到1.5 ml EP管中，8 000 r/min離心30 s取上清液，使用DNA基因組小量提取試劑盒提取病毒DNA，將提取的病毒DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.3.3 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2基因的PCR擴(kuò)增 通過(guò)普通PCR方法擴(kuò)增FAdV-4Fiber2基因，構(gòu)建25 μl反應(yīng)體系，短暫離心后旋渦振蕩混勻，按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，轉(zhuǎn)入含Goldview I核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，隨后于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照分析。

1.4 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因克隆與測(cè)序

使用膠回收試劑盒對(duì)瓊脂糖凝膠內(nèi)的目的基因進(jìn)行回收純化。將目的基因連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB固體平板后置于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種LB液體培養(yǎng)基，放入37 ℃恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過(guò)PCR方法，使用pMD19 T載體通用引物篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒；進(jìn)一步使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和Hind Ⅲ 對(duì)重組質(zhì)粒pMD19 T-Fiber2進(jìn)行雙酶切鑒定；把質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至華大基因科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.5 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因序列分析

對(duì)測(cè)序后的基因片段進(jìn)行拼接，在NCBI下載禽腺病毒屬各血清型Fiber2基因序列，使用軟件DNAStar將GZ-QLFiber2基因序列與選取的各血清型參考毒株Fiber2基因進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；進(jìn)一步推導(dǎo)出GZ-QL株Fiber2蛋白的氨基酸序列，并將此序列與ON1弱毒株、MX-SHP95弱毒株、四川SCnj1601強(qiáng)毒株、北京NIVD2強(qiáng)毒株Fiber2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。各血清型FAdV毒株Fiber基因參考序列信息見(jiàn)表1。

表1 FAdV Fiber基因參考序列

1.6 FAdV-4 GZ-QL 株 Fiber2蛋白生物信息學(xué)分析

應(yīng)用在線軟件ExPASy-Protparam對(duì)GZ-QL株Fiber2蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)及氨基酸組成分析。應(yīng)用在線軟件ProtScale對(duì)GZ-QL Fiber2蛋白進(jìn)行疏水性與親水性分析。應(yīng)用在線軟件SOPMA、Swiss-model預(yù)測(cè)GZ-QL Fiber2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。分別應(yīng)用在線軟件TMHMM Server v.2.0和SingalP v3.0對(duì)GZ-QL Fiber2蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域和信號(hào)肽分析。應(yīng)用在線軟件Protean和IEDB的Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0抗原表位預(yù)測(cè)工具對(duì)GZ-QL Fiber2蛋白進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2基因擴(kuò)增

以FAdV-4 GZ-QL株的DNA樣本為模板，以Fiber2-F/Fiber2-R為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的特異性基因片段大小約為1 425 bp，與目的片段的預(yù)期大小一致(圖1)。結(jié)果初步表明成功擴(kuò)增出了FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因。

M：5 000 bp Marker；1～2：擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 FAdV-4 Fiber2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of FAdV-4 Fiber2 gene

2.2 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因重組質(zhì)粒的鑒定

采用質(zhì)粒PCR方法和雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD19 T-Fiber2。由圖2可知，重組質(zhì)粒PCR均能擴(kuò)增出大小約1 425 bp的目的條帶，而空白對(duì)照組無(wú)此條帶；由圖3可知，重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ雙酶切后，均能產(chǎn)生與預(yù)期大小(1 425 bp)一致的目的基因條帶以及對(duì)應(yīng)的克隆載體片段(2 692 bp)，而空載體經(jīng)過(guò)相同的雙酶切后只產(chǎn)生與預(yù)期大小(2 692 bp)一致的載體片段。結(jié)果表明，GZ-QLFiber2基因成功插入到pMD19-T克隆載體中。

M：2 000 bp marker；1～3：重組質(zhì)粒；4：空白對(duì)照。圖2 FAdV-4 Fiber2基因重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification results of restructuring plasmid of FAdV-4 Fiber2 gene

M：5 000 bp marker；1～3：重組質(zhì)粒；4：pMD19-T。圖3 FAdV-4 Fiber2基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of FAdV-4 Fiber2 gene recombinant plasmid digested by double enzymes

2.3 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因序列和參考株ON1、SCnj1601、NIVD2等毒株Fiber2基因序列進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。由圖4可知，F(xiàn)AdV-4 GZ-QL株與四川分離的SCnj1601強(qiáng)毒株、北京分離的NIVD2強(qiáng)毒株Fiber2基因核苷酸同源性均為100.0%；和ON1 經(jīng)典株Fiber2基因的核苷酸同源性為95.9%；與基因型一致的FAdV-10CX-1毒株同源性為96.2%；與剩余血清型(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-11)的同源性相對(duì)較低，約為45.9%～52.2%。由圖5可知，F(xiàn)AdV-4 GZ-QL株與四川SCnj1601強(qiáng)毒株、北京NIVD2強(qiáng)毒株位于相同進(jìn)化分支；與國(guó)外ON1經(jīng)典株、MX-SHP95弱毒株及血清10型的CX-1相比存在多點(diǎn)位氨基酸突變，同屬于一個(gè)大的進(jìn)化分支，均為FAdV-C(基因型)；與國(guó)內(nèi)外其他血清型處于不同分支，親緣性較遠(yuǎn)。提示，F(xiàn)AdV-4Fiber2基因在本血清型內(nèi)相對(duì)保守，與其他血清型之間差異較大。

圖4 核苷酸序列同源性比對(duì)分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of nucleotide homology

圖5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of phylogenetic tree

2.4 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2蛋白生物信息學(xué)分析

2.4.1 FAdV-4Fiber2基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析 把基因測(cè)序得到的序列片段進(jìn)行拼接，獲得FAdV-4 GZ-QL株Fiber2全基因序列，使用軟件DNAstar推導(dǎo)氨基酸序列，并將此序列與ON1弱毒株、MX-SHP95弱毒株、四川SCnj1601強(qiáng)毒株、北京NIVD2強(qiáng)毒株氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。由圖6可知，F(xiàn)AdV-4 GZ-QL株Fiber2基因編碼479個(gè)氨基酸，與四川SCnj1601強(qiáng)毒株、北京NIVD2強(qiáng)毒株Fiber2蛋白氨基酸序列完全一致；但與國(guó)外FAdV-4 ON1弱毒株、MX-SHP95弱毒株相比，分別有33處、27處氨基酸突變，且在第11～15位氨基酸處均存在5個(gè)氨基酸插入。

圖6 推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.6 Amino acid sequences derived

2.4.2 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2蛋白理化性質(zhì)分析 應(yīng)用在線軟件ExPASy-Protparam分析預(yù)測(cè)GZ-QL株Fiber2蛋白的理化性質(zhì)及氨基酸組成。結(jié)果顯示，QZ-QLFiber2基因編碼序列(CDS)區(qū)大小為1 440 bp，對(duì)應(yīng)編碼479個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為50 000，其蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為4.376，共有43個(gè)氨基酸帶負(fù)電荷，其中29個(gè)天冬氨酸(Asp)、14個(gè)谷氨酸(Glu)，23個(gè)氨基酸帶正電荷，其中11個(gè)精氨酸(Arg)、12個(gè)賴氨酸(Lys)，脂肪系數(shù)為89.31，溶于水中的不穩(wěn)定指數(shù)為33.47(若指數(shù)超過(guò)40.00，則代表不穩(wěn)定)，提示該蛋白質(zhì)較穩(wěn)定。該蛋白質(zhì)氨基酸組成中，共含有3類堿性氨基酸，其中精氨酸11個(gè)、組氨酸(His)3個(gè)、賴氨酸12個(gè)，總計(jì)26個(gè)，占比為5.4%(26/479)；含有2類酸性氨基酸，其中天冬氨酸29個(gè)、谷氨酸14個(gè)，總計(jì)43個(gè)，占比為9.0%(43/479)；進(jìn)而推測(cè)Fiber2蛋白可能為酸性蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)共含有7類親水性氨基酸，總計(jì)200個(gè)，占總氨基酸的41.8%(200/479)；共含有8類疏水性氨基酸，總計(jì)210個(gè)，占總氨基酸的43.8%(210/479)；蛋白質(zhì)親水性平均值為-0.031(負(fù)值代表親水，正值代表疏水)，提示該蛋白質(zhì)可能為親水性蛋白質(zhì)。同時(shí)應(yīng)用ProtScale在線軟件預(yù)測(cè)Fiber2蛋白氨基酸序列的親/疏水性。如圖7所示，縱坐標(biāo)分值高于0的部分為疏水區(qū)，低于0則為親水區(qū)，分值絕對(duì)值越高，對(duì)應(yīng)的親/疏水性則越強(qiáng)；在Fiber2蛋白的氨基酸中，位于270位的氨基酸得分最高(2.02)，疏水性最強(qiáng)；位于第10位的氨基酸得分最低(-3.13)，親水性最強(qiáng)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4 GZ-QL株Fiber2蛋白親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，表明Fiber2蛋白為親水性蛋白質(zhì)，具備成為優(yōu)勢(shì)抗原的潛力。

2.4.3 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用SOPMA軟件預(yù)測(cè)GZ-QL Fiber2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，由圖8可知，F(xiàn)iber2蛋白α-螺旋占總體的4.8%，β-轉(zhuǎn)角占總體的8.1%，延伸鏈占總體的35.3%，無(wú)規(guī)則卷曲占總體的51.8%。整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成以無(wú)規(guī)卷曲為主，易于形成抗原表位。同時(shí)，通過(guò)Swiss-model軟件對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，由圖9可知，該蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈占比均相對(duì)較高，這與該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖7 FAdV-4 Fiber2蛋白的疏水性分析結(jié)果Fig.7 Hydrophobicity analysis result of FAdV-4 Fiber2 protein

h表示α-螺旋；t表示β-轉(zhuǎn)角；c表示無(wú)規(guī)則卷曲；e表示延伸鏈；右側(cè)數(shù)字表示氨基酸在肽段中的位置。圖8 FAdV-4 Fiber2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of secondary structure of FAdV-4 Fiber2 protein

2.4.4 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析 分別應(yīng)用在線軟件TMHMM Server v.2.0和SingalP v3.0分析預(yù)測(cè)GZ-QL株Fiber2蛋白的跨膜區(qū)域和信號(hào)肽。由圖10可知，該蛋白質(zhì)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；由圖11可知，該蛋白質(zhì)無(wú)信號(hào)肽，推測(cè)其為非分泌蛋白質(zhì)。

圖10 FAdV-4 Fiber2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of transmembrane domains of FAdV-4 Fiber2 protein

2.4.5 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 應(yīng)用Protean抗原表位預(yù)測(cè)工具對(duì)GZ-QL Fiber2蛋白進(jìn)行B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)和分析，主要分析其親水性、柔韌性、抗原表位及氨基酸表面可及性。由圖12可知，F(xiàn)iber2蛋白具有豐富的B細(xì)胞表位，且軟件分析結(jié)果顯示，N端2～38區(qū)域擁有最高的抗原指數(shù)、柔韌性、親水性和表面可及性，很可能是病毒粒子識(shí)別細(xì)胞膜表面受體并與之結(jié)合的區(qū)域。進(jìn)一步使用IEDB的Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)抗原表位，結(jié)果如圖13所示，除了較短氨基酸序列之外，GZ-QL Fiber2蛋白共含有8個(gè)分值較高的區(qū)域，可能是該蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域。

圖11 FAdV-4 Fiber2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.11 Signal peptide prediction of FAdV-4 Fiber2 protein

圖12 Protean預(yù)測(cè)Fiber2蛋白B細(xì)胞表位參數(shù)結(jié)果Fig.12 Results of Fiber2 protein B cell epitope parameter predicted by Protean

圖13 IEDB預(yù)測(cè)Fiber2蛋白B細(xì)胞表位參數(shù)結(jié)果Fig.13 Results of Fiber2 protein B cell epitope parameter predicted by IEDB

3 討論

腺病毒是一種在自然界中分布廣泛、理化性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定且具有較強(qiáng)傳染性的病原體[11-12]，國(guó)際病毒委員會(huì)于2021年將腺病毒科劃分成6屬87種[13]。其中，禽腺病毒屬病毒是禽類主要的傳染病病原之一，且主要在雞群中傳播。該屬相關(guān)的病毒種類非常多，不同亞群腺病毒的致病特點(diǎn)也存在一定的差異性。根據(jù)群特異性抗原特征將禽腺病毒分為Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因組分為A～E 5個(gè)基因型[14]。本研究中的FAdV-4為Ⅰ群禽腺病毒血清4型，基因型為C型。從目前流行狀況來(lái)看，F(xiàn)AdV-4的致病性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[15-16]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)流行的FAdV-4分離株(HN、AQ、AH726、JS07和AH712)Fiber2基因與國(guó)外早期流行毒株(JSJ13)相比，已經(jīng)發(fā)生了較大變異[17]，血清型相同的毒株之間，其致病性也存在很大差異[18]。推測(cè)FAdV-4在傳播過(guò)程中發(fā)生了變異，導(dǎo)致毒力發(fā)生了變化，致病性增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，GZ-QL株 Fiber2蛋白氨基酸序列與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)流行毒株一致；但與國(guó)外早期流行的弱毒株(ON1、MX-SHP95)相比，GZ-QL株 Fiber2蛋白在11～15位存在5個(gè)氨基酸插入，而軟件分析結(jié)果顯示該區(qū)域擁有最高的抗原性、柔韌性、親水性和表面可及性，可能是病毒粒子與細(xì)胞膜上受體結(jié)合的位點(diǎn)，對(duì)于病毒復(fù)制過(guò)程至關(guān)重要。那么，GZ-QL株毒性的增強(qiáng)是否與這5個(gè)氨基酸插入突變有關(guān)？本研究結(jié)果為這一推測(cè)提供了依據(jù)，但仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。已有研究結(jié)果表明，F(xiàn)iber2蛋白和Hexon蛋白與FAdV-4的致病性有密切關(guān)系[19]，在病毒內(nèi)化過(guò)程中，F(xiàn)iber2蛋白能夠直接與宿主細(xì)胞膜上受體結(jié)合，從而影響病毒的致病性[20]，而Fiber1蛋白和Penton蛋白對(duì)病毒的毒力無(wú)直接影響[21]。如果能證實(shí)GZ-QL株Fiber2蛋白N端這5個(gè)氨基酸插入突變?cè)诓《疚胶椭虏∵^(guò)程中的作用，將會(huì)為闡釋FAdV-4的致病機(jī)制提供更多證據(jù)。

Fiber2蛋白為FAdV-4的結(jié)構(gòu)蛋白，其抗原表位具有型特異性和亞屬特異性，可有效誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體[22]。生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果表明，F(xiàn)AdV-4貴州株Fiber2蛋白具有良好的抗原性，并且與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)分離株高度同源，但與Ⅰ群其他血清型毒株核苷酸序列同源性較低，提示Fiber2蛋白在本血清型內(nèi)相對(duì)保守，具有作為基因工程疫苗靶標(biāo)蛋白質(zhì)的潛力。

研究發(fā)現(xiàn)，將鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白基因與FAdV-4的Fiber2基因融合后進(jìn)行原核表達(dá)，得到的重組蛋白質(zhì)能與FAdV-4陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，且在動(dòng)物試驗(yàn)中產(chǎn)生了良好的免疫保護(hù)效果[23]。郭浩然等[24]制備的抗Fiber2蛋白多克隆抗體和王萍等[25]制備的抗FAdV-4 Fiber2單克隆抗體與Fiber2蛋白及病毒陽(yáng)性血清樣品結(jié)合均能產(chǎn)生特異性反應(yīng)，證實(shí)Fiber2蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性?；蛐蛄械纳镄畔W(xué)分析有助于了解編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與成分，可為目的蛋白質(zhì)的體外表達(dá)和后續(xù)開發(fā)利用等奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)了FAdV-4 Fiber2蛋白的理化性質(zhì)和抗原表位，結(jié)果表明，F(xiàn)iber2蛋白可作為免疫抗原的候選蛋白質(zhì)，研究結(jié)果為開展FAdV-4新型疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

FAdV-4貴州分離株Fiber2基因總長(zhǎng)度是1 440 bp，共編碼479個(gè)氨基酸，與中國(guó)SCnj1601以及NIVD2株的氨基酸序列相同；與國(guó)外MX-SHP95、ON1經(jīng)典株相比，存在多位點(diǎn)的氨基酸突變，屬于同種的不同進(jìn)化分支。Fiber2蛋白屬于親水性蛋白質(zhì)，無(wú)跨膜區(qū)和信號(hào)肽，相對(duì)保守且抗原性良好，具備成為優(yōu)勢(shì)抗原的潛力。