肖慎華， 阿得力江·吾斯曼， 劉振廣

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

近年來，隨著納米材料技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料在疫苗佐劑方面的應(yīng)用對(duì)疫苗的發(fā)展起到了一定的推進(jìn)作用。納米佐劑的優(yōu)勢在于其良好的生物相容性、納米尺寸效應(yīng)、抗原負(fù)載能力、抗原緩釋效應(yīng)及靶向性等[1-2]。與傳統(tǒng)佐劑相比，聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚羥基丁酸酯等納米材料制備出的納米?；蛭⑶蚩蓪⒖乖蛭皆陬w粒中形成良好的納米疫苗佐劑[3-5]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)，PLGA]因其良好的安全性、生物相容性、藥物包封效果及藥物緩釋作用在疫苗佐劑領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注[6-7]。PLGA納米?？蓪⑺幬锘蚩乖庠诩{米顆粒中，不但可保護(hù)藥物或抗原免受酶解，還能夠使藥物或抗原長期緩慢釋放，從而達(dá)到藥物長期作用或抗原長效免疫保護(hù)的目的[7-8]。

近年來，隨著對(duì)PLGA納米材料的深入理解和納米材料制備工藝的快速發(fā)展，學(xué)者們制備出了一系列不同相對(duì)分子質(zhì)量、不同性質(zhì)的PLGA原材料。PLGA是一種線性分子，水解后可分解為單體乳酸和羥基乙酸，由于這兩種單體是內(nèi)源性的，很容易通過三羧酸循環(huán)在人體內(nèi)代謝，因此以PLGA為載體進(jìn)行藥物輸送或作為生物材料應(yīng)用于機(jī)體所產(chǎn)生的毒性非常微弱[9-10]。PLGA通常用LAGA表示PLGA材料中的乳酸和羥基乙酸比，如LAGA為7 525，表示材料中乳酸含量為75%、羥基乙酸含量為25%。目前市場上常見的PLGA相對(duì)分子質(zhì)量在5 000至150 000之間，其降解時(shí)間從幾個(gè)月到幾年不等，具體取決于PLGA的相對(duì)分子質(zhì)量、共聚物比例和環(huán)境因素[11-12]。通常情況下PLGA相對(duì)分子質(zhì)量越低，降解越快，因其末端羧酸的聚集和自身催化會(huì)導(dǎo)致納米粒的快速降解；LAGA越低，材料親水性越強(qiáng)、降解速率越高；酸性和堿性環(huán)境也會(huì)加速PLGA納米粒降解，相對(duì)而言PLGA納米粒在中性環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性。PLGA不溶于水，但在常用有機(jī)溶劑如二氯甲烷、丙酮、氯仿、苯甲醇、乙酸乙酯中有良好的溶解性[13]。隨著對(duì)PLGA納米材料性質(zhì)的全面了解和制備技術(shù)的發(fā)展，研究人員制備出了一系列不同大小、形狀和表面屬性的PLGA納米粒，并對(duì)這些納米粒進(jìn)行了抗原負(fù)載方式、負(fù)載能力、佐劑活性及相關(guān)機(jī)理的檢測和評(píng)價(jià)[14-15]。本文以PLGA納米材料為研究對(duì)象，結(jié)合近年來PLGA納米粒作為疫苗佐劑存在的問題及相關(guān)解決方案，對(duì)PLGA納米粒的制備、檢測方法及影響其疫苗佐劑效果各因素進(jìn)行了全面分析總結(jié)，并展望未來發(fā)展趨勢，以期為該領(lǐng)域的科研工作者提供理論基礎(chǔ)。

1 PLGA納米粒

1.1 PLGA納米粒的制備方法

納米粒制備過程不同，納米粒的結(jié)構(gòu)有所差異。PLGA納米粒的常用制備方法有乳化-溶劑揮發(fā)法、乳化-鹽析法和噴霧干燥法[16]。

乳化-溶劑揮發(fā)法，是制備PLGA納米粒最常用的方法，常用于制備單層或雙層納米粒[17]。該方法首先是將PLGA溶于二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯等有機(jī)溶劑中，然后將藥物水溶液單獨(dú)或混合表面活性劑聚乙烯醇、聚山梨酯80或泊洛沙姆等一起均質(zhì)，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的初乳或單層PLGA納米粒。雙層納米粒的制備方法是，形成初乳后再向初乳中加入表面活性劑，均質(zhì)后得到穩(wěn)定的雙層PLGA納米粒[17-18]。單層或雙層納米粒中的有機(jī)溶劑可通過磁力攪拌或低壓旋蒸的方法去除，除去有機(jī)溶劑后得到穩(wěn)定的PLGA納米粒溶液。該方法操作簡單、可重復(fù)性良好，是試驗(yàn)室制備PLGA納米粒最常用的方法，但該方法在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中只適合于包封脂溶性藥物的PLGA納米粒生產(chǎn)，且均質(zhì)過程耗能較高(圖2)[18]。

乳化-鹽析法，首先將含有PLGA和藥物的有機(jī)相加入到含鹽析劑(氯化鎂或氯化鈣)或膠體穩(wěn)定劑(聚乙烯吡咯烷酮)的水溶液中，均質(zhì)形成水包油O/W乳液，用大量的水進(jìn)一步稀釋O/W，有機(jī)溶劑在水中迅速擴(kuò)散，形成納米粒[19]。殘留溶劑和鹽析劑或膠體穩(wěn)定劑可通過過濾去除。該方法制備的PLGA納米粒具有包封熱敏感性藥物(蛋白質(zhì)、DNA和RNA)的優(yōu)勢，但制備過程中由于有機(jī)溶劑在水中快速擴(kuò)散，在納米粒形成后其表面常會(huì)產(chǎn)生小孔，容易導(dǎo)致藥物的滲漏[19]。

噴霧干燥法，是制備PLGA納米粒的新方法。該方法是將藥物分散在溶有PLGA的有機(jī)相中，將該混合體系噴灑在熱氣流中，形成納米粒氣溶膠，最后通過干燥氣溶膠的方式收集納米粒[21]。該方法具有快速、高效、實(shí)現(xiàn)工藝參數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)。但納米粒制備過程中會(huì)和熱氣流對(duì)撞，不利于對(duì)蛋白質(zhì)、RNA等藥物的包封制備[20]。

除了以上三種常見制備方法外，人們還通過將溶解有PLGA的有機(jī)相放置在透析管內(nèi)，通過透析袋內(nèi)溶劑發(fā)生置換方式制備出了均質(zhì)的PLGA納米粒[21]。有研究人員將溶質(zhì)溶解在超臨界流體中，使壓力快速降低，達(dá)到高度飽和后導(dǎo)致納米粒的膨脹定型[22]。

1.2 PLGA納米粒的檢測方法

納米粒表征及穩(wěn)定性等相關(guān)檢測對(duì)研究納米粒作用機(jī)制及納米粒的推廣使用具有重要意義。納米粒的大小有助于學(xué)者們確定納米粒的使用途徑、功效、藥物釋放情況和降解模式。用動(dòng)態(tài)光散射、掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡等檢測手段可確定納米粒大小、分布和形態(tài)等參數(shù)[23-24]。研究結(jié)果顯示，PLGA的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)納米粒的粒徑、包封率和降解速度均有一定的影響。當(dāng)PLGA相對(duì)分子質(zhì)量較低時(shí)，末端羧酸含量相對(duì)較高，大量羧酸會(huì)導(dǎo)致PLGA納米粒的自身催化，從而加快納米粒的降解速率。PLGA納米粒的相對(duì)分子質(zhì)量可通過尺寸排阻色譜法進(jìn)行檢測[25]。研究結(jié)果顯示，納米粒Zeta電荷對(duì)納米粒體外釋放、黏附性、穩(wěn)定性以及納米粒在機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)特性具有重要意義[26-27]。納米粒的分散系數(shù)(PDI)可直接反應(yīng)納米粒的分散狀態(tài)。納米粒的Zeta電荷、PDI及粒徑均可通過馬爾文Zeta電位儀進(jìn)行檢測。納米粒在機(jī)體中的轉(zhuǎn)運(yùn)分布情況很大程度上取決于其疏水性[28-29]。研究結(jié)果表明，親水性顆粒的滯留時(shí)間比疏水性顆粒要長，通過檢測納米粒表面化學(xué)官能團(tuán)，如通過X射線光電子能譜、傅立葉變換紅外光譜和核磁共振光譜等，可判斷納米粒疏水性能的強(qiáng)弱[30-31]。傅立葉變換紅外光譜和核磁共振光譜等方法同樣可用于檢測PLGA納米粒中藥物的包封情況及表面修飾PLGA納米粒的修飾程度和修飾物用量[32-33]。

2 以PLGA為基礎(chǔ)的納米佐劑

研究結(jié)果[34-35]表明，負(fù)載抗原的納米粒注入機(jī)體后可增強(qiáng)對(duì)機(jī)體抗原呈遞細(xì)胞(APC)的募集效果，納米粒能夠有效被大量APC攝取，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的攝取率，與抗原單獨(dú)使用或傳統(tǒng)油佐劑相比，納米粒用作佐劑具有更好的免疫或治療效果。除了APC的高攝取率外，基于以PLGA為基礎(chǔ)的疫苗佐劑包封抗原后，因良好的緩釋效果能夠長時(shí)間釋放抗原，為機(jī)體提供更有效的免疫保護(hù)反應(yīng)，能夠減少免疫次數(shù)，達(dá)到經(jīng)濟(jì)有效保護(hù)機(jī)體的目的[35-36]。PLGA納米粒作為載體可負(fù)載單獨(dú)抗原或幾個(gè)不同的抗原[37]。研究結(jié)果[38]證明，抗原和佐劑共同傳遞，才能同時(shí)被細(xì)胞有效內(nèi)化。此外，當(dāng)抗原和PLGA濃度較低時(shí)就能夠有效刺激機(jī)體誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫反應(yīng)[39-40]。因此，從抗原使用劑量角度而言，PLGA包封的抗原能夠有效節(jié)約抗原用量。基于PLGA納米良好的安全性及佐劑效應(yīng)，該納米佐劑引起了學(xué)者們廣泛關(guān)注。已知，納米粒的大小、形狀及表面電荷等均對(duì)納米粒佐劑活性的發(fā)揮有著重要影響[41-42]。因此，學(xué)者們圍繞PLGA納米粒展開了一系列研究，優(yōu)化其粒徑、形狀及表面電荷，以求制備出更為有效的納米佐劑。

2.1 粒徑對(duì)納米粒佐劑效果的影響

為了制備出最佳疫苗載體，學(xué)者們對(duì)納米粒粒徑進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其機(jī)體作用途徑進(jìn)行了檢測。An等[43]以PLGA納米粒為基礎(chǔ)，制備出了粒徑分別為20 nm、40 nm和100 nm的3種粒徑納米粒，比較不同粒徑納米粒淋巴結(jié)傳送效率及淋巴結(jié)內(nèi)樹突狀細(xì)胞(DC)的有效靶向性。3種納米粒中，20 nm粒徑的納米粒最快進(jìn)入淋巴結(jié)，且高效地被DC所攝取，進(jìn)而快速誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)；40 nm粒徑的納米粒也能夠快速進(jìn)入淋巴結(jié)，但被DC攝取效率低于前者，因此所誘導(dǎo)的免疫強(qiáng)度弱于前者；而100 nm粒徑的納米粒，進(jìn)入淋巴結(jié)中的時(shí)間較長，但其免疫持續(xù)時(shí)間要強(qiáng)于前兩者[43]。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，3種不同粒徑納米粒，進(jìn)入淋巴結(jié)的時(shí)間和方式有所不同，因此介導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)弱和持續(xù)時(shí)間均有所差異。粒徑為20～100 nm的納米粒，可直接進(jìn)入淋巴管或細(xì)胞間隙將疫苗遞送至淋巴結(jié)，產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，即為細(xì)胞旁路途徑[44]。粒徑大于100 nm的納米粒，能夠在注射部位產(chǎn)生募集效應(yīng)，經(jīng)大量APC攝取后，將疫苗遷移至淋巴結(jié)中而產(chǎn)生長效免疫反應(yīng)，即為細(xì)胞載體途徑[44-45]。不同粒徑納米粒對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)類型的影響檢測試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粒徑在200～600 nm大小的納米粒介導(dǎo)能夠誘導(dǎo)機(jī)體IFN-γ高水平分泌，免疫類型偏向T helper 1(Th1)型免疫反應(yīng)；粒徑在2 000～8 000 nm的納米粒介導(dǎo)，則誘導(dǎo)機(jī)體IL-4高水平分泌，免疫類型偏向Th2型免疫反應(yīng)[45]。以上結(jié)果表明，PLGA納米粒的作用途徑及介導(dǎo)的免疫反應(yīng)類型和免疫反應(yīng)強(qiáng)弱均可通過控制顆粒大小進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此，納米粒大小對(duì)PLGA納米粒疫苗佐劑效應(yīng)的發(fā)揮具有重要意義。

2.2 電荷對(duì)納米粒佐劑效果的影響

將抗原包封在PLGA納米粒中，能夠?yàn)闄C(jī)體提供長效而持久的抗原刺激，因此PLGA納米粒是一種良好的疫苗佐劑[46]。但有學(xué)者[47]發(fā)現(xiàn)，PLGA納米?？乖膺^程中抗原和油相中有機(jī)溶劑直接接觸，對(duì)抗原活性產(chǎn)生一定影響，且單一的包封策略限制了納米粒的抗原負(fù)載效率。為了加強(qiáng)納米粒的抗原負(fù)載率，對(duì)PLGA納米粒采取了表面陽離子修飾策略[48]。常用陽離子修飾物有殼聚糖、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚多巴胺和陽離子脂質(zhì)體雙十八烷基溴化銨等[49]。這些陽離子可直接通過靜電吸附對(duì)PLGA納米粒進(jìn)行修飾，從而提高PLGA納米粒的抗原負(fù)載率[49-50]。經(jīng)一系列的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米粒表面經(jīng)陽離子修飾后，不但能夠通過靜電吸附負(fù)載更多的抗原，還能加強(qiáng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫活性[49]。納米粒的表面電荷對(duì)細(xì)胞的攝取作用具有重要影響[39]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，帶正電的納米粒更容易發(fā)生細(xì)胞內(nèi)化，因?yàn)閹д姷募{米粒更容易通過靜電作用被帶負(fù)電的細(xì)胞膜所攝取[50-51]。此外，帶正電荷的納米粒進(jìn)入溶酶體后，能夠快速消耗溶酶體中大量H+，從而使細(xì)胞質(zhì)中大量鹽離子內(nèi)流，導(dǎo)致溶酶體破裂，產(chǎn)生有效溶酶體逃逸，而逃逸出的納米粒，通過MHC I分子呈遞，有效誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞活化，產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞免疫應(yīng)答[52]。

2.3 形狀對(duì)納米粒佐劑效果的影響

納米粒形狀對(duì)其佐劑活性強(qiáng)弱也有一定的影響。納米粒形狀不同，導(dǎo)致不同納米粒和細(xì)胞膜接觸后形成的角度不同，被APC攝取的效率也不同。Niikura等[53]分別對(duì)圓球狀、橄欖球狀及棒狀納米粒進(jìn)行了APC細(xì)胞的攝取率檢測，結(jié)果顯示，棒狀或橄欖球狀納米粒豎直和細(xì)胞膜接觸時(shí)所產(chǎn)生的阻力最小，易被吞噬，但當(dāng)棒狀或橄欖球狀納米粒橫向接觸細(xì)胞膜時(shí)所產(chǎn)生的阻力要遠(yuǎn)大于圓球狀納米粒，且納米粒接觸細(xì)胞膜時(shí)，因表面張力的作用，使棒狀或橄欖球狀納米粒更容易以橫向方式和細(xì)胞膜接觸。因此相對(duì)棒狀或橄欖球狀納米粒，圓球狀更容易被APC攝取[54]。因此，合理設(shè)計(jì)納米粒的形狀，對(duì)其在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮有效的免疫效果具有重要意義。

3 PLGA納米佐劑存在的問題和解決策略

盡管有關(guān)PLGA納米粒的研究很多，也從多方面對(duì)該納米粒的佐劑作用機(jī)制進(jìn)行了全面分析，但PLGA納米粒在臨床運(yùn)用卻很少[55]。其中，限制PLGA納米粒大規(guī)模應(yīng)用的因素有以下幾點(diǎn):(1)納米粒載藥量低，通常情況下PLGA納米粒具有良好的包封效果對(duì)大多數(shù)藥物和抗原均具有較高的包封率，如對(duì)雌二醇或黃原酮的包封率為60%～70%，但PLGA納米粒的載藥量卻很低，約1%左右，意味著100 mg質(zhì)量的PLGA納米粒只能負(fù)載1 mg藥物。(2)抗原負(fù)載方式不完善，PLGA納米粒以包封的方式負(fù)載抗原，但納米粒制備過程中將會(huì)使抗原和油相中的有機(jī)溶劑直接接觸，影響抗原的活性。(3)無法做到納米粒和抗原分開保存使用，實(shí)際應(yīng)用中佐劑和抗原的分開保存，通過簡單混合后就可使用，無疑是佐劑使用的最佳方式[56-57]。但PLGA納米粒以包封的方式存在顯然無法做到納米粒和抗原分開保存，為此，解決PLGA納米粒的抗原負(fù)載率，將其制備成類似于鋁佐劑的方便型疫苗佐劑，是推廣利用以PLGA為基礎(chǔ)的納米疫苗佐劑的關(guān)鍵技術(shù)問題。

近年來，有報(bào)道，可利用陽離子對(duì)PLGA納米粒進(jìn)行修飾，使原來帶負(fù)電荷的PLGA納米粒表面經(jīng)陽離子修飾后變?yōu)檎姾?，再通過電荷吸附作用使納米粒負(fù)載帶負(fù)電荷的疫苗抗原[58]。陽離子修飾PLGA納米粒的抗原負(fù)載量和表面電荷有關(guān)，表面正電荷越強(qiáng)抗原負(fù)載率越高，但過高的正電荷會(huì)導(dǎo)致較大的細(xì)胞毒性[59]。因此，在較為安全的細(xì)胞毒性范圍內(nèi)，陽離子修飾PLGA納米粒的抗原負(fù)載率受到了極大限制。

為了進(jìn)一步改善PLGA納米粒的抗原負(fù)載率和抗原負(fù)載方式，有學(xué)者將PLGA納米粒和油乳液進(jìn)行了組裝，將PLGA納米粒組裝成復(fù)合納米粒，從而提高納米粒抗原負(fù)載率、加強(qiáng)納米粒APC募集效果及誘導(dǎo)強(qiáng)烈細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答[60]。Xia等[60]以PLGA納米粒為外殼，以角鯊烯為油相，制備出了新型組裝Pickering乳液，復(fù)合納米粒佐劑結(jié)合了油佐劑和PLGA納米粒的優(yōu)點(diǎn)。檢測得知，Pickering乳液表面為草莓樣結(jié)構(gòu)，可為抗原提供巨大的比表面積，這種特殊的表面結(jié)構(gòu)可有效利用乳液表面PLGA納米粒之間的縫隙吸附大量抗原，從而提高納米?？乖?fù)載率，加大載藥量；這種復(fù)合納米粒在乳液界面形成了一層殼狀覆蓋，便于抗原的緩慢釋放和傳遞；Pickering乳液凹凸的表面更有利于APC的攝??；Pickering乳液具有柔軟的角鯊烯內(nèi)核，因此和APC接觸時(shí)因變形作用，接觸面積增加，APC在納米粒表面密集抗原的作用下引發(fā)多級(jí)免疫識(shí)別，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)[58]。Song等[61]以poly(ethylene glycol)-block- poly(lactide-co-?-caprolactone)( PEG-b-PLACL)納米粒為外殼，以檸檬酸/角鯊烯為內(nèi)核，制備出了復(fù)合納米粒。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合納米粒佐劑具有良好的APC募集及抗原負(fù)載效果，同時(shí)還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)人卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤具有良好的治愈效果[61]。

PLGA納米材料是具有生物相容性的良好疫苗載體。因此，合理地設(shè)計(jì)PLGA納米粒，通過陽離子修飾或組裝的方式對(duì)PLGA納米粒進(jìn)行進(jìn)一步處理，使PLGA納米粒成為具有高抗原負(fù)載率、高APC募集效果及鋁佐劑樣混合吸附抗原特性，是攻克PLGA納米粒的低抗原負(fù)載率，不完善的抗原負(fù)載方式等缺陷的有效策略。PLGA納米粒表面陽離子修飾或與油乳液等組裝將成為PLGA納米佐劑研究的新方向。